Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Este protocolo se puede aplicar a cualquier proceso que resulte en roturas de ADN de doble cadena, produce datos cuantitativos detallados sobre la cinética. Aunque este método tiene una resolución de molécula única, mide hasta 1000 DNAs en un solo experimento, proporcionando así buenas estadísticas. La aplicación principal de este método es estudiar los mecanismos involucrados en la unión y modificación del ADN.

Por ejemplo, estamos interesados en estudiar la búsqueda de objetivos de ADN, que es relevante para todas las proteínas de unión al ADN. Al intentar esta técnica por primera vez, recuerde que las correas de moléculas individuales son delicadas, y una vez que se forman, deben manejarse con cuidado. La proporción adecuada de superficies funcionalizadas es esencial.

Hay algunos trucos para hacer el flujo así. Además de cambiar los tubos de muestra durante la recopilación de datos, la demostración visual puede ayudar a alguien que es nuevo en este procedimiento. Para lavar los resbalones de la cubierta, colóquelos en frascos de tinción y sonicévelos con etanol durante 30 minutos.

Enjuáguelos bien con agua desionizada y destilada, luego sumerjalas en un hidróxido de potasio molar y sonicéalos durante 30 minutos más. Repita la secuencia de lavado, asegurándose de enjuagar los resbalones de la cubierta con agua después de cada lavado. Guarde los resbalones de la cubierta limpia en frascos de tinción con agua.

Utilice una maquinilla de afeitar limpia para cortar tubos de carga y salida de ocho centímetros de largo, e insértelos en agujeros en un portaobjetos de vidrio limpio. Epoxi el tubo y deje curar durante cinco minutos para asegurarlo. Aplique cinta de doble cara precortado con el patrón de canal a los portaobjetos de vidrio, y alé exterior con fórceps de plástico para lograr un buen sello.

Retire el respaldo de la cinta y aplique un resbalón de cubierta limpio, alisándolo con los fórceps. Luego, epoxi el borde de la cubierta se desliza para sellar la célula de flujo y dejar que se cure. Preparar el ADN etiquetado para el anclaje mediante la realización de PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.

A continuación, purifique el producto PCR con un kit de limpieza de PCR. Preparar 10 mililitros de tampón A, y desgasiarlo en un desecador de vacío durante al menos una hora. Para funcionalizar la célula de flujo, inyecte 25 microlitros de anti-digoxigenina y fragmentos fab en PBS, en el canal de flujo, utilizando una punta de carga de gel para caber en el tubo PE60.

Incubar la celda de flujo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, tire de 0,5 mililitros de tampón A a través del canal con una jeringa, teniendo cuidado de no introducir aire en el canal. Luego, monte la célula de flujo en un microscopio invertido.

Enganche el tubo de salida a una bomba de jeringa y coloque el tubo de entrada en un tubo de micro centrífuga que contenga el tampón A.Tire manualmente de al menos 0,5 mililitros de tampón A para vaciar el sistema y preparar la bomba. A continuación, deje que la bomba funcione a 10 microlitros por minuto durante al menos cinco minutos para equilibrar el sistema. Vórtice la botella de material de cuentas, y pipeta 1,6 microlitros de las cuentas en 50 microlitros de tampón A, a continuación, vórtices de nuevo.

Coloque las perlas en un separador magnético y pipetee el búfer. Re-suspenderlos en 50 microlitros de tampón A y vórtices. Después del último lavado, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón A para una concentración final de 160 microgramos por mililitro.

Preparar 480 microlitros de sustrato de ADN etiquetado 0.5 picomolar en tampón A, y pipeta 20 microlitros de suspensión de cuentas en el ADN diluido. Coloque la mezcla sobre un rotador durante tres minutos. Después de los tres minutos, cargue inmediatamente la muestra en el canal a un caudal de 10 microlitros por minuto durante 15 minutos, o hasta que se observe suficiente anclaje de cuentas.

Lave el canal de todas las perlas libres cambiando el tubo de entrada a un tubo fresco de tampón A, y fluyendo en 50 microlitros por minuto durante al menos 10 minutos o hasta que no se observen perlas sueltas. Y es útil usar una válvula en línea para cortar el flujo y cambiar el tubo. Cambiar el tubo en un movimiento suave y asegúrese de que los niveles de líquido en los tubos de muestra nuevos y viejos coincidan para evitar el contraflujo.

Antes de recopilar datos, prepare la concentración correcta de la enzima de escisión de ADN e inserte el tubo de entrada en la muestra. Baje el imán sobre la celda de flujo. Ajuste la bomba para inyectar 80 microlitros de muestra a 150 microlitros por minuto y comenzar la recolección de datos.

Un minuto después de la recopilación de datos, active la bomba. Aquí se muestra una imagen representativa de las cuentas atadas antes y después de la reacción. Se realizó un análisis de datos para cuantificar el número de perlas que quedan atadas a lo largo de la reacción de escote.

Esta técnica se utilizó para medir las tasas de escisión de ADN específicas del sitio de Nde1 para las concentraciones de proteínas que van de 0,25 a cuatro unidades por mililitro, y dos concentraciones diferentes de magnesio. Cada condición se replicó al menos dos veces, con unos pocos 100 a 1000 ADN atados por experimento. A concentraciones proteicas suficientemente bajas, la tasa es proporcional a la proteína e independiente del magnesio.

Para altas concentraciones de proteínas, la tasa depende del magnesio, pero es independiente de la concentración de proteínas. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que las burbujas de aire en el canal de tubería y flujo pueden ejecutar el experimento. Asegúrese de no permitir que entre aire en las líneas mientras cambia el tubo, y desgaste todos los buffers antes de usarlos.

El método de anclaje permite explorar el efecto de la tensión en el ADN en la reacción. Esto se puede lograr variando la fuerza del imán o aplicando el flujo durante la recopilación de datos.