Name: Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a detectar Salmonella en alimentos para animales mediante amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Este método validado ofrece resultados rápidos con menor tasa de falsos negativos que la PCR tradicional.

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Los autores agradecen a los miembros del Subcomité de Validación de Métodos de Microbiología (MMVS) de la FDA y al Consejo del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) por revisar críticamente los estudios de validación del método Salmonella LAMP.

<ol><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li>
<li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed%3A+Current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li>
<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li>
<li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+%28OIE%29+notifiable+viral+diseases+of+ruminants%2C+swine+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Health+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li>
<li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Reviews+in+Food+Science+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li>
<li>WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en">http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en</a> (2016).</li>
<li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification%3A+Beyond+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Biology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110(2016).</li>
<li>WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en</a> (2018).</li>
<li>FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf">http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf</a> (2015).</li>
<li>FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013).</li>
<li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+%28MDA%29+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces%3A+collaborative+study%2C+first+action+2016.01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li>
<li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+loop-mediated+amplification%2FISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li>
<li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).</li>
<li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li>
<li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA%3A+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li>
<li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid%2C+reliable%2C+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).</li>
<li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li>
<li>Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2020).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores. Las opiniones expresadas en este manuscrito son las de los autores y no reflejan necesariamente la política oficial del Departamento de Salud y Servicios Humanos, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos o el Gobierno de los Estados Unidos. La referencia a cualquier material comercial, equipo o proceso no constituye de ninguna manera aprobación, aprobación o recomendación por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos.

Hemos presentado aquí un método LAMP simple, rápido, específico y sensible para la detección y confirmación de Salmonella en alimentos para animales y cultivo puro, respectivamente. Con la comodidad de una mezcla maestra isotérmica que contiene cuatro reactivos clave, y una mezcla de imprimación preparada internamente lista para usar, el montaje de una reacción LAMP requiere sólo unos pocos pasos de pipeteo (Figura 1). El tiempo total de ejecución, incluidas las fases de amplificación y recocido, es inferior a 38 min(Figura 2A, B y Figura 3A,B). Los resultados positivos se supervisan mediante fluorescencia en tiempo real(Figura 2C y Figura 3C,D)y se pueden detectar tan pronto como 5 min26. La fase de recocido sirve como una confirmación adicional de la especificidad de LAMP ya que sólo las muestras con Tm correcta (alrededor de 90 °C) se notifican como positivas(Figura 2D, E y Figura 3E-G). Previamente se han notificado sensibilidades de 1 célula salmonela en cultivo puro y < 1 CFU/25 g en alimentosanimales.
Como LAMP es bastante eficaz y genera una gran cantidad de ADN1,es fundamental que se utilicen las mejores prácticas de laboratorio para prevenir la contaminación cruzada, que pueden incluir separar físicamente las áreas para preparar la mezcla maestra LAMP y agregar plantillas de ADN, evitar generar aerosoles, usar puntas de pipeta de filtro, cambiar guantes a menudo y abstenerse de abrir tubos de reacción LAMP después de la amplificación.
La especificidad de este método Salmonella LAMP se probó previamente utilizando 300 cepas bacterianas (247 Salmonella de 185 serovars y 53 noSalmonella)y demostró ser 100% específica26. En particular, se observaron diferencias significativas en Tmax entre las dos especies de Salmonella, S. enterica y Salmonella bongori,y entre las subespecies S. enterica, especialmente subsp. arizonae (IIIa)26. No obstante, estos resultados positivos siguen siendo válidos según las normas para interpretar los resultados de LAMP. En nuestro estudio colaborativo multi-laboratorio en alimentos para perros secos en el que participaron 14 analistas19,ocasionalmente se observaron muestras con resultados inconsistentes en corridas duplicadas de LAMP. Estos generalmente implicaban muestras con resultados positivos retrasados(Máx. T> 15 min). Repetir ambas ejecuciones de forma independiente normalmente resuelve el problema. Más raramente, observamos muestras con valoresmáximos T m correctospero no o irregulares T(< 5 min). Esto fue generalmente causado por burbujas de aire en el tubo de reacción.
A lo largo del ciclo de vida del desarrollo de métodos LAMP, evaluación, estudio precolaborante y validación multi-laboratorio, hemos observado alta tolerancia de LAMP a inhibidores en diversos alimentos animales o matrices alimentarias y medios de cultivo4,19,22,23,24,destacando la robustez del método y colaborando numerosos otros estudios a escala global8. Esto es superior en comparación con PCR o PCR en tiempo real, que normalmente requiere un control de amplificación interna para asegurarse de que los resultados negativos no se deben a la inhibición de la matriz28. Además, LAMP demostró una especificidad y sensibilidad similares (o superiores) en comparación con pcr o PCR en tiempo real en la gran mayoría de los estudios8. El costo de los reactivos LAMP es de aproximadamente $1 por reacción. Los instrumentos LAMP utilizados en este protocolo son pequeños, de bajo mantenimiento y portátiles. Pueden manejar cualquier método de amplificación isotérmica que emplee la detección de objetivos mediante la medición de fluorescencia, LAMP incluido. Con el software LAMP, se pueden generar informes completos en varios formatos (pdf, texto e imagen).
La validación de métodos es un paso crítico antes de que se pueda adoptar un nuevo método para su uso rutinario. Cabe destacar que el protocolo LAMP notificado aquí ha completado con éxito la validación multi-laboratorio19. Con la reciente incorporación de este protocolo LAMP en el Capítulo 5 de Salmonella27de bam de la FDA de los Estados Unidos, se espera que el método obtenga un uso mucho más amplio, tanto como un método de detección rápida en alimentos para animales como como un método de confirmación confiable para los presuntos aislados salmonela de todas las categorías de alimentos.

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una nueva prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) inventada en 2000 por un grupo de científicos japoneses1. A través de la formación de una estructura de ADN de bucle vástago específica del objetivo durante los pasos iniciales, LAMP utiliza una polimerasa de ADN que desplaza las hebras para amplificar eficientemente este material de partida de forma cuasi exponencial, lo que resulta en 109 copias de objetivo en menos de 1 h1. En comparación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un NAAT ampliamente utilizado, LAMP posee varias ventajas. En primer lugar, las reacciones LAMP se llevan a cabo en condiciones isotérmicas. Esto obvia la necesidad de un sofisticado instrumento de ciclismo térmico. En segundo lugar, LAMP es altamente tolerante a los medios de cultivo y sustancias biológicas2 con robustez demostrada tanto para aplicaciones clínicas como alimentarias3,4. Esto simplifica la preparación de la muestra y minimiza los resultados negativos falsos5. En tercer lugar, LAMP es apto para múltiples plataformas de detección, como turbidez, colorimetría, bioluminiscencia, fluorescencia y microfluídica6. En cuarto lugar, LAMP es muy específico, ya que utiliza de cuatro a seis imprimaciones especialmente diseñadas para dirigirse a seis a ocho regiones específicas1,7. En quinto lugar, LAMP es ultrasensible y numerosos estudios han informado de su sensibilidad superior a PCR o PCR8en tiempo real. Por último, LAMP es más rápido con muchos ensayos que ahora adoptan un tiempo de ejecución estándar de 30 minutos, mientras que los ensayos de tipo PCR suelen tomar 1-2 h8.
Estas atractivas características alimentaron la aplicación de LAMP en amplias áreas de detección de patógenos, incluyendo diagnóstico in vitro 9,diagnóstico de enfermedades animales10y pruebas alimentarias y ambientales11. En particular, la OMS ha recomendado una TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis)como prueba de sustitución válida para la microscopía de frotis de esputo para diagnósticos de tuberculosis pulmonar en entornos periféricos12. La aplicación LAMP también se expande más allá de la identificación microbiana para incluir la detección de alérgenos, especies animales, resistencia a fármacos, organismos genéticamente modificados y pesticidas13.
Salmonella no fofódica es un patógeno zoonótico de considerable seguridad alimentaria y preocupación de salud pública en todo el mundo14. También se ha identificado como un importante peligro microbiano en los alimentos para animales (es decir, alimentos para animales)15,16. Para prevenir enfermedades/brotes de Salmonella de alimentos humanos contaminados y alimentos para animales, es imperativo contar con métodos rápidos, fiables y robustos para probar Salmonella en una variedad de matrices. En la última década, se han realizado considerables esfuerzos internacionales en el desarrollo y aplicación de ensayos de Salmonella LAMP en una amplia gama de matrices de alimentos, como se resumió recientemente en una extensa revisión8. Varios ensayos de Salmonella LAMP, incluido el presentado aquí, han completado con éxito la validación multi-laboratorio siguiendo directrices internacionales bien establecidas17,18,19,20.
Nuestro ensayo Salmonella LAMP se dirige específicamente al gen de invasión Salmonella invA (número de adhesión a GenBank M90846)21 y es rápido, fiable y robusto en múltiples matrices de alimentos4,22,23,24,25,26. El método ha sido validado en seis matrices de alimentos para animales en un estudio precollaborante26 y en alimentos para perros secos en un estudio colaborativo multi-laboratorio19. Como resultado, el método Salmonella LAMP presentado aquí se ha incorporado recientemente al Manual Analítico Bacteriológico (BAM) capítulo 5 salmonella 27 de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) capítulo 5 Salmonella27 para servir dos propósitos, uno como método de detección rápida para la presencia de Salmonella en alimentos animales y dos como un método de confirmación confiable para la presunta Salmonella aislada de todos los alimentos.

<table><tbody><tr><td>Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>299070</td><td>Medio de crecimiento líquido utilizado en el cultivo de Salmonella.</td></tr><tr><td>Agua de peptona tamponada (BPW)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218105</td><td></td><td>Medio de preenriquecimiento para la recuperación de Salmonella a partir de muestras de alimentos para animales.</td></tr><tr><td>DNA AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>7010</td><td>Elimina el ADN y la DNasa no deseados de la mesa de laboratorio, la cristalería y el material de plástico sin afectar a las muestras de ADN posteriores.</td></tr><tr><td>Software Genie Explorer</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>Versión 2.0.6.3</td><td>Admite el funcionamiento remoto de los instrumentos Genie, incluidas las ejecuciones de LAMP y el análisis de datos.</td></tr><tr><td>Genie II o Genie III (instrumento LAMP)</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>GEN2-02 o GEN3-02</td><td>Un pequeño instrumento capaz de controlar la temperatura hasta 100 &°; C con &plusmn; 0.1 &deg; Precisión C y detección simultánea de fluorescencia a través del canal FAM. Genie II tiene 2 bloques (A y B) con 8 muestras en cada bloque. Genie III tiene un solo bloque que tiene capacidad para 8 muestras.</td></tr><tr><td>Tira Genie</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>OP-0008</td><td>Tiras de microtubos de 8 pocillos con tapones de bloqueo integrales y un volumen de trabajo de 10 a 150 &micro;l.</td></tr><tr><td>Soporte de tiras Genie</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>GBLOCK</td><td>Utilizado para sujetar tiras Genie al configurar una reacción LAMP, el soporte de aluminio también se puede utilizar como bloque de refrigeración.</td></tr><tr><td>Solución de ácido clorhídrico (HCl), 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SA48-500</td><td>Ajusta el pH de las muestras de alimentos para animales después de agregar BPW y antes del enriquecimiento durante la noche.</td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>88-860-022</td><td>Calienta muestras a 100 &plusmn; 1 oC para la extracción de ADN.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>3960</td><td>Incubadora de laboratorio estándar.</td></tr><tr><td>ISO-001 mezcla maestra isotérmica</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>ISO-001</td><td>Una mezcla maestra optimizada para simplificar el ensamblaje de una reacción LAMP, que contiene un fragmento grande de ADN polimerasa GspSSD que desplaza la hebra de Geobacillus spp., pirofosfatasa inorgánica termoestable, tampón de reacción, MgSO4, dNTP y un colorante de unión al ADN de doble cadena (canal de detección FAM).</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>A416</td><td>Desinfecta las superficies de trabajo.</td></tr><tr><td>Imprimaciones LAMP</td><td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td><td></td><td>Imprimaciones LAMP personalizadas con información detallada en la Tabla 1.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td><td>22620207</td><td>MiniSpin más microcentrífuga personal.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>05-408-129</td><td>Tubos de microcentrífuga estándar.</td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AM9938</td><td>Se utiliza en la fabricación de material de imprimación, mezcla de cebador y mezcla de reacción LAMP.</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de sodio (NaOH), 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SS266-1</td><td>Ajusta el pH de las muestras de alimentos para animales después de agregar BPW y antes del enriquecimiento durante la noche.</td></tr><tr><td>Agar no selectivo (por ejemplo, agar sangre, agar nutrientes y agar de soja tripticasa)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R01202</td><td>Medio de crecimiento sólido utilizado en el cultivo de Salmonella.</td></tr><tr><td>Agua de peptona</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>218071</td><td>Diluye los cultivos de Salmonella durante la noche para producir ADN de control positivo.</td></tr><tr><td>Pipetas y puntas</td><td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td><td>Pipet Lite LTS series Pipetas</td><td>y puntas de laboratorio estándar.</td></tr><tr><td>Reactivo de preparación de muestras PrepMan Ultra</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4318930</td><td>Un kit sencillo utilizado para la preparación rápida de plantillas de ADN para su uso en una reacción LAMP.</td></tr><tr><td>Cepa de referencia de Salmonella LT2</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>700720</td><td>Cepa de referencia de Salmonella utilizada como control positivo.</td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticasasa (TSB)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>211768</td><td>Medio de crecimiento líquido utilizado en el cultivo de Salmonella.</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td><td>SI-0236</td><td>Mezclador de vórtice de laboratorio estándar.</td></tr><tr><td>Bolsa de filtro Whirl-pak Marca</td><td>de muestreo Nasco, Fort Atkinson, WI</td><td>B01318</td><td>Bolsas de filtro para contener muestras de alimentos para animales para el enriquecimiento previo.</td></tr></tbody></table>

amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ha surgido como una potente prueba de amplificación de ácido nucleico para la detección rápida de numerosos agentes bacterianos, fúngicas, parásitos y virales. La salmonela es un patógeno bacteriano de importancia mundial en la seguridad alimentaria, incluidos los alimentos para los animales. Aquí se presenta un protocolo lamp de salmonela con múltiples laboratorios validado que se puede utilizar para examinar rápidamente los alimentos de los animales para detectar la presencia de la contaminación por Salmonella y también se puede utilizar para confirmar los presuntos aislados de Salmonella recuperados de todas las categorías de alimentos. El ensayo LAMP se dirige específicamente al gen de invasión Salmonella (invA)y es rápido, sensible y altamente específico. Los DNAs de plantilla se preparan a partir de caldos de enriquecimiento de alimentos para animales o cultivos puros de presuntos aislados salmonela. La mezcla de reactivos LAMP se prepara combinando una mezcla maestra isotérmica, imprimaciones, plantilla de ADN y agua. El ensayo LAMP se ejecuta a una temperatura constante de 65 °C durante 30 min. Los resultados positivos se supervisan a través de la fluorescencia en tiempo real y se pueden detectar tan pronto como 5 min. El ensayo LAMP exhibe una alta tolerancia a los inhibidores en los alimentos o medios de cultivo de los animales, sirviendo como un método rápido, fiable, robusto, rentable y fácil de usar para la detección y confirmación de Salmonella. El método LAMP se ha incorporado recientemente al Capítulo 5 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos.

La Figura 2 y la Figura 3 muestran gráficos/tablas LAMP representativos que se muestran en ambas plataformas. En esta ejecución lamp, las muestras S1 a S6 son diluciones serie de 10 veces de S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 que van desde 1.1 x 106 CFU a 11 CFU por reacción. El control positivo es S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) a 1,7 x 104 CFU por reacción y NTC es agua de grado molecular.
Como se muestra en la Figura 2E y la Figura 3G,los pozos NTC y PC son controles válidos. El pozo NTC tiene Tmax en blanco, mientras que Tm es &lt; 83 °C en el panel de instrumentos LAMP y en blanco en el software LAMP, lo que sugiere un resultado negativo. El pozo pc tiene Tmáx. de 7 min 45 seg y Tm de ~ 90 °C en ambas plataformas, lo que sugiere un resultado positivo. Las muestras S1 a S6 tienen Tmax entre 6 min 30 seg y 12 min 15 seg, todas son Salmonella-positivas.
Después de las ejecuciones duplicadas del mismo conjunto de muestras, se notifican los resultados finales de LAMP para estas muestras. Esta ejecución representativa de LAMP muestra que LAMP detecta con éxito Salmonella con una amplia gama de concentraciones en las muestras.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> Figura 2: Resultados representativos de LAMP que se muestran en el panel de instrumentos LAMP. (A) La pestaña Perfil muestra el perfil de temperatura programado. (B) La pestaña Temperatura muestra las temperaturas reales en los pozos de muestra a medida que avanza la reacción de LAMP. (C) La pestaña Amplificación muestra lecturas de fluorescencia durante la amplificación de LAMP. (D) La pestaña Anneal muestra cambios en la fluorescencia (derivado) durante la fase de recocido. (E) La pestaña Resultados muestra una vista tabular de los resultados de LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> Figura 3: Resultados representativos de LAMP vistos en el software LAMP. (A) La pestaña Perfil muestra el perfil de temperatura programado. (B) La pestaña Temperatura muestra las temperaturas reales en los pozos de muestra a medida que avanza la reacción de LAMP. (C) La pestaña Amplificación muestra lecturas de fluorescencia durante la amplificación de LAMP. (D) La pestaña Tasa de amplificación muestra cambios en la fluorescencia (relación de fluorescencia) durante la amplificación de LAMP. (E) La pestaña Anneal muestra lecturas de fluorescencia durante la fase de recocido. (F) La pestaña Derivado de Anneal muestra cambios en la fluorescencia (derivado) durante la fase de recocido. (G) La pestaña Resultado muestra una vista tabular de los resultados de LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.

Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Este método LAMP de Salmonella se ha incorporado en el Manual Analítico Bacteriológico de la FDA, tanto como método de detección en alimentos para animales como método de confirmación para cualquier presunto aislado de Salmonella. El método es rápido, fiable y robusto. En comparación con la PCR, sus principales ventajas son las pruebas rápidas, la instrumentación sencilla, una baja tasa de falsos negativos y un flujo de trabajo flexible.El cribado rápido de patógenos como la salmonela desempeña un papel importante en la detección rápida de un producto potencialmente contaminado y puede prevenir enfermedades o brotes en humanos y animales. Comience preparando plantillas de ADN para el ensayo LAMP. Hay dos tipos de muestras que se utilizan para hacer plantillas de ADN.Para preparar plantillas a partir de muestras de alimentos para animales, pese asépticamente 25 gramos de muestra de alimentos en una bolsa de filtro estéril. Agregue 225 mililitros de agua estéril de Peptona tamponada a la bolsa e incube a 35 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, transfiera un mililitro del lado filtrado de la bolsa a un tubo de microcentrífuga.Centrifugar el tubo a 900 veces G durante un minuto. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Centrifugar la muestra a 16.000 veces G durante dos minutos.Y para desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros del reactivo de preparación de muestras y caliéntelo a 100 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque de calor seco. Luego, enfríe la muestra a temperatura ambiente y guárdela a menos 20 grados centígrados. El segundo tipo de muestra para este ensayo LAMP proviene directamente de presuntos cultivos de salmonela.Para preparar plantillas de ADN, transfiera 500 microlitros de un cultivo de salmonela durante la noche a un tubo de microcentrífuga y caliéntelo en un bloque de calor de 100 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, enfríe la muestra a temperatura ambiente y guárdela a menos 20 grados centígrados. Para evitar la contaminación cruzada, separe físicamente las áreas utilizadas para preparar la mezcla maestra LAMP y agregar las plantillas de ADN.Limpie las superficies de trabajo con isopropanol y una solución degradante de ADN y ADN. A continuación, limpie las pipetas y los soportes de las tiras de tubos. Descongele la mezcla maestra isotérmica, la mezcla de cebador 10X, el agua de grado molecular, el ADN de control positivo y las plantillas de ADN a temperatura ambiente.Encienda el instrumento LAMP e introduzca la información de muestra relevante. Prepare la Mezcla Maestra LAMP de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, vórtice y centrifugala brevemente, y distribuya 23 microlitros de la Mezcla Maestra en cada pocillo de una tira de tubo. Agita todas las plantillas de ADN y centrífugalas brevemente.Luego, agregue dos microlitros de plantilla de ADN al pocillo apropiado y tape el pocillo herméticamente. Retire la tira de tubo del soporte y gírela para asegurarse de que todos los reactivos se hayan acumulado en el fondo del tubo. Cargue la tira de tubos en el instrumento LAMP e inicie la ejecución de LAMP.Mientras la reacción LAMP está en curso, toque las pestañas Temperatura, Amplificación y Recocido para ver los cambios dinámicos de varios parámetros durante la ejecución de LAMP. Los resultados de LAMP se pueden ver en el panel de instrumentos de LAMP en tiempo real o mediante el software LAMP. Para interpretar los resultados en el panel de instrumentos, abra la ejecución LAMP de interés.Observe las cinco pestañas asociadas a cada ejecución. Las pestañas Perfil y Temperatura muestran las temperaturas programadas y reales en los pocillos de muestra a medida que avanza la reacción LAMP. Las pestañas de amplificación y recocido muestran lecturas de fluorescencia y cambios en la fluorescencia durante las fases de amplificación y recocido, respectivamente.La pestaña Resultados muestra la vista tabular de los resultados de LAMP que se pueden interpretar de acuerdo con las instrucciones de los manuscritos. La segunda forma de ver los resultados de LAMP es utilizando el software LAMP. Para interpretar los resultados con el software, haga clic en el icono de la computadora en el panel izquierdo y navegue hasta la ubicación del archivo para cargar la ejecución de LAMP de interés.Observe las siete pestañas asociadas con cada ejecución. Las pestañas Perfil y Temperatura muestran las temperaturas programadas y reales en los pocillos de muestra a medida que avanza la reacción LAMP. Las pestañas Amplificación y Tasa de amplificación muestran las lecturas de fluorescencia y los cambios en la fluorescencia durante la fase de amplificación.Las pestañas de recocido y derivado anal muestran lecturas de fluorescencia y cambios en la fluorescencia durante la fase de recocido. La pestaña Resultados muestra una vista tabular de los resultados de LAMP. Hay cuatro columnas tituladas Nombre del gráfico, Número de pozo, Nombre del pozo y Valor máximo.Se muestran el tiempo de amperio y las derivadas de recocido de las ocho muestras. Los resultados pueden ser interpretados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. El panel de instrumentos LAMP y el software LAMP se pueden utilizar para mostrar los resultados del ensayo.En esta ejecución de LAMP, las muestras S1 a S6 son diluciones en serie diez veces mayores de Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741, que van desde 1,1 millones hasta 11 unidades formadoras de colonias por reacción. El control positivo, o PC, es Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 a 17.000 unidades formadoras de colonias por reacción, y el control sin plantilla, o NTC, es agua de grado molecular. El pozo NTC tiene un Tmax en blanco y una temperatura Aneal de aproximadamente 81 grados Celsius en el panel de instrumentos LAMP, y un Tmax en blanco y una temperatura Anneal en blanco en el software LAMP.El pozo de control positivo tiene un Tmax de siete minutos y 45 segundos y una temperatura de recocido de aproximadamente 90 grados centígrados en ambas plataformas. Las muestras S1 a S6 tienen un Tmax de entre seis minutos y 30 segundos y 12 minutos y 15 segundos, y una temperatura de recocido de aproximadamente 90 grados Celsius, lo que indica una detección positiva. LAMP es muy eficaz y genera una gran cantidad de ADN.Por lo tanto, es fundamental que se utilicen las mejores prácticas de laboratorio para evitar la contaminación cruzada. Use prácticas similares al hacer sus plantillas de ADN, ya que los enriquecimientos de alimentos animales contaminados pueden tener altos niveles de salmonela. Las muestras de alimento para animales que dan positivo en la detección de LAMP deben confirmarse mediante aislamiento de cultivo siguiendo los procedimientos del Manual Analítico Bacteriológico de la FDA.Las muestras negativas pueden ser reportadas como tales. La incorporación de este método LAMP en el Manual Analítico Bacteriológico de la FDA allana el camino para una aplicación más amplia de esta tecnología rápida, robusta y fácil de usar en las pruebas de inocuidad de los alimentos.

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Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural (Video) | JoVE Journal

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