Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural
20 de mayo de 2020
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.
Este método LAMP de Salmonella se ha incorporado en el Manual Analítico Bacteriológico de la FDA, tanto como método de detección en alimentos para animales como método de confirmación para cualquier presunto aislado de Salmonella. El método es rápido, fiable y robusto. En comparación con la PCR, sus principales ventajas son las pruebas rápidas, la instrumentación sencilla, una baja tasa de falsos negativos y un flujo de trabajo flexible.
El cribado rápido de patógenos como la salmonela desempeña un papel importante en la detección rápida de un producto potencialmente contaminado y puede prevenir enfermedades o brotes en humanos y animales. Comience preparando plantillas de ADN para el ensayo LAMP. Hay dos tipos de muestras que se utilizan para hacer plantillas de ADN.
Para preparar plantillas a partir de muestras de alimentos para animales, pese asépticamente 25 gramos de muestra de alimentos en una bolsa de filtro estéril. Agregue 225 mililitros de agua estéril de Peptona tamponada a la bolsa e incube a 35 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, transfiera un mililitro del lado filtrado de la bolsa a un tubo de microcentrífuga.
Centrifugar el tubo a 900 veces G durante un minuto. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Centrifugar la muestra a 16.000 veces G durante dos minutos.
Y para desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros del reactivo de preparación de muestras y caliéntelo a 100 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque de calor seco. Luego, enfríe la muestra a temperatura ambiente y guárdela a menos 20 grados centígrados. El segundo tipo de muestra para este ensayo LAMP proviene directamente de presuntos cultivos de salmonela.
Para preparar plantillas de ADN, transfiera 500 microlitros de un cultivo de salmonela durante la noche a un tubo de microcentrífuga y caliéntelo en un bloque de calor de 100 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, enfríe la muestra a temperatura ambiente y guárdela a menos 20 grados centígrados. Para evitar la contaminación cruzada, separe físicamente las áreas utilizadas para preparar la mezcla maestra LAMP y agregar las plantillas de ADN.
Limpie las superficies de trabajo con isopropanol y una solución degradante de ADN y ADN. A continuación, limpie las pipetas y los soportes de las tiras de tubos. Descongele la mezcla maestra isotérmica, la mezcla de cebador 10X, el agua de grado molecular, el ADN de control positivo y las plantillas de ADN a temperatura ambiente.
Encienda el instrumento LAMP e introduzca la información de muestra relevante. Prepare la Mezcla Maestra LAMP de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, vórtice y centrifugala brevemente, y distribuya 23 microlitros de la Mezcla Maestra en cada pocillo de una tira de tubo. Agita todas las plantillas de ADN y centrífugalas brevemente.
Luego, agregue dos microlitros de plantilla de ADN al pocillo apropiado y tape el pocillo herméticamente. Retire la tira de tubo del soporte y gírela para asegurarse de que todos los reactivos se hayan acumulado en el fondo del tubo. Cargue la tira de tubos en el instrumento LAMP e inicie la ejecución de LAMP.
Mientras la reacción LAMP está en curso, toque las pestañas Temperatura, Amplificación y Recocido para ver los cambios dinámicos de varios parámetros durante la ejecución de LAMP. Los resultados de LAMP se pueden ver en el panel de instrumentos de LAMP en tiempo real o mediante el software LAMP. Para interpretar los resultados en el panel de instrumentos, abra la ejecución LAMP de interés.
Observe las cinco pestañas asociadas a cada ejecución. Las pestañas Perfil y Temperatura muestran las temperaturas programadas y reales en los pocillos de muestra a medida que avanza la reacción LAMP. Las pestañas de amplificación y recocido muestran lecturas de fluorescencia y cambios en la fluorescencia durante las fases de amplificación y recocido, respectivamente.
La pestaña Resultados muestra la vista tabular de los resultados de LAMP que se pueden interpretar de acuerdo con las instrucciones de los manuscritos. La segunda forma de ver los resultados de LAMP es utilizando el software LAMP. Para interpretar los resultados con el software, haga clic en el icono de la computadora en el panel izquierdo y navegue hasta la ubicación del archivo para cargar la ejecución de LAMP de interés.
Observe las siete pestañas asociadas con cada ejecución. Las pestañas Perfil y Temperatura muestran las temperaturas programadas y reales en los pocillos de muestra a medida que avanza la reacción LAMP. Las pestañas Amplificación y Tasa de amplificación muestran las lecturas de fluorescencia y los cambios en la fluorescencia durante la fase de amplificación.
Las pestañas de recocido y derivado anal muestran lecturas de fluorescencia y cambios en la fluorescencia durante la fase de recocido. La pestaña Resultados muestra una vista tabular de los resultados de LAMP. Hay cuatro columnas tituladas Nombre del gráfico, Número de pozo, Nombre del pozo y Valor máximo.
Se muestran el tiempo de amperio y las derivadas de recocido de las ocho muestras. Los resultados pueden ser interpretados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. El panel de instrumentos LAMP y el software LAMP se pueden utilizar para mostrar los resultados del ensayo.
En esta ejecución de LAMP, las muestras S1 a S6 son diluciones en serie diez veces mayores de Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741, que van desde 1,1 millones hasta 11 unidades formadoras de colonias por reacción. El control positivo, o PC, es Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 a 17.000 unidades formadoras de colonias por reacción, y el control sin plantilla, o NTC, es agua de grado molecular. El pozo NTC tiene un Tmax en blanco y una temperatura Aneal de aproximadamente 81 grados Celsius en el panel de instrumentos LAMP, y un Tmax en blanco y una temperatura Anneal en blanco en el software LAMP.
El pozo de control positivo tiene un Tmax de siete minutos y 45 segundos y una temperatura de recocido de aproximadamente 90 grados centígrados en ambas plataformas. Las muestras S1 a S6 tienen un Tmax de entre seis minutos y 30 segundos y 12 minutos y 15 segundos, y una temperatura de recocido de aproximadamente 90 grados Celsius, lo que indica una detección positiva. LAMP es muy eficaz y genera una gran cantidad de ADN.
Por lo tanto, es fundamental que se utilicen las mejores prácticas de laboratorio para evitar la contaminación cruzada. Use prácticas similares al hacer sus plantillas de ADN, ya que los enriquecimientos de alimentos animales contaminados pueden tener altos niveles de salmonela. Las muestras de alimento para animales que dan positivo en la detección de LAMP deben confirmarse mediante aislamiento de cultivo siguiendo los procedimientos del Manual Analítico Bacteriológico de la FDA.
Las muestras negativas pueden ser reportadas como tales. La incorporación de este método LAMP en el Manual Analítico Bacteriológico de la FDA allana el camino para una aplicación más amplia de esta tecnología rápida, robusta y fácil de usar en las pruebas de inocuidad de los alimentos.
Visión general
Este estudio presenta un protocolo validado de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para la detección rápida de Salmonella en alimentos para animales. El método ofrece ventajas sobre la PCR tradicional, incluyendo resultados más rápidos y tasas reducidas de falsos negativos, convirtiéndolo en una herramienta confiable para identificar posibles contaminaciones.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Detección de patógenos
- Amplificación de ácidos nucleicos
- Seguridad alimentaria
Antecedentes
- Importancia de la detección rápida de patógenos en productos alimenticios
- Necesidad de métodos confiables de detección para Salmonella
- Limitaciones de los métodos PCR tradicionales
Métodos utilizados
- Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)
- Salmonella spp.
- Uso de protocolos específicos de preparación de ADN
Resultados principales
- Demostró la efectividad de LAMP para la detección de Salmonella
- Destacó la baja tasa de falsos negativos del método
- Validación mediante comparación multilaboratorio
Conclusiones
- El estudio establece LAMP como un método viable para la detección y confirmación de Salmonella en productos alimenticios.
- Enfatiza la importancia de pruebas rápidas para mejorar la seguridad alimentaria y prevenir riesgos para la salud.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
