Name: Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende la fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT. Este método permite visualizar la red arterial pulmonar completa preservando la integridad de los tejidos blandos.

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Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros NHLBI (DIR HL-006247). Nos gustaría dar las gracias a NIH Mouse Imaging Facility por orientación en la adquisición y análisis de imágenes.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (ACUC) del Instituto Nacional de Pulmón Cardíaco y Sangre.
1. Preparación
<ol><li>Inyecte el ratón por vía intraperitoneal con heparina (1 unidad/g de peso corporal del ratón) y permita que se ambula durante 2 min.</li>
	<li>Eutanasia al animal en una cámara deCO2.</li>
	<li>Coloque el ratón en una posición supina en una placa quirúrgica y asegure las cuatro extremidades a la placa con cinta adhesiva. Utilice la ampliación para la disección fina.</li>
</ol>2. Exposición de pulmones y tráquea
<ol><li>Rocíe el lado ventral del ratón con 70% de etanol para minimizar la interferencia del cabello.</li>
	<li>Agarre la piel abdominal con fórceps y haga una pequeña incisión con tijeras en la región umbilical. Deslice las puntas de las tijeras en la capa fascial entre la musculatura abdominal y la piel y comience a separar las dos capas. Trabaje rostralmente, eliminando la piel del abdomen, la caja torácica y el cuello.</li>
	<li>Abra la musculatura abdominal con tijeras y corte lateralmente en ambos lados hasta que el diafragma quede expuesto.</li>
	<li>Sujete suavemente el proceso de xifoide y levante ligeramente la caja torácica maximizando la vista de los pulmones caudales a través del diafragma delgado y semitransparente. Haga cuidadosamente una pequeña incisión en el diafragma justo debajo del proceso de xifoide. Los pulmones colapsarán y se alejarán del diafragma. Diseccionar el diafragma lejos de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar el parénquima pulmonar.</li>
	<li>Localice y corta la vena cava inferior (IVC) y el esófago por donde pasan a través del diafragma. Use gasas para limpiar cualquier acumulación de sangre en la cavidad torácica, evitando el contacto con los pulmones.</li>
	<li>Sujete el xifoide una vez más y levante suavemente. Cortar la caja torácica bilateralmente (aproximadamente en la línea axilar media) evitando el contacto con los pulmones. Retire la caja torácica anterior por completo, haciendo el corte final a lo largo del ángulo esternal justo antes del manubrio.</li>
	<li>Usando una jeringa precargada, humedezca liberalmente los pulmones con solución salina tamponada por fosfato (PBS, pH 7.4) para evitar el secado. Continúe con esta rutina durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Usando fórceps, agarre el manubrio y aléjese suavemente del cuerpo. Usando tijeras, corte 1-2 mm lateralmente al manubrio, cortando las clavículas y retírelas. Esto expondrá el timo debajo.</li>
	<li>Agarre cada lóbulo del timo, tire de separarse y retírelo. Repita este procedimiento con la glándula submandibular. Finalmente, retire el tejido muscular superponiendo la tráquea. NOTA: Después de la disección, el corazón, la aorta ascendente (AA), el tronco arterial pulmonar (PAT) y la tráquea deben ser visibles. Asegúrese de que las ramas arteriales primarias del tronco no estén divididas ni lesionadas.</li>
</ol>3. Cateterismo PA y perfusión de sangre
<ol><li>Para montar la unidad 1, enhebrar 15 cm de tubo PE-10 en el cubo de una aguja de 30 G y fijar a una jeringa de 1 ml precargada con nitroprusido sódico (SNP)de 10 -4 M en PBS. En primer lugar, el tubo avanzando el émbolo hasta que se purgue todo el aire de esta unidad (Figura 1). ADVERTENCIA: SNP es tóxico si se ingiere. Evite el contacto con la piel y los ojos. Lávese bien la piel después de manipularla. Use el equipo de protección personal adecuado.<ol>
<li>Alternativamente, monte la unidad 2. Para ratones del día 7 (P7) y menores, utilice un hemostat para separar una aguja adicional de 30 G de su cubo e enhebrar la aguja en el extremo abierto del tubo de la Unidad 1 (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>En lugar de una aguja, utilice fórceps afilados curvados para agarrar un extremo de una longitud de 10 cm de seda de 7-0. Penetra el ápice del corazón entrando por un lado y pasando las puntas de los fórceps a través del músculo y fuera del otro lado. Sujete la seda con otro conjunto de fórceps y tire de aproximadamente 2 cm de longitud a través y atar. Tome el extremo restante de 8 cm de la sutura, tirando del corazón caudalmente, y pegue el extremo de la placa quirúrgica. NOTA: Esto creará tensión, exponiendo aún más los grandes vasos y atando el corazón en su lugar, lo que permite una colocación más fácil del catéter en la arteria pulmonar.</li>
	<li>Enganchar las puntas de los fórceps curvos bajo el AA y PAT. Tire de una longitud de 3 cm de seda 7-0 hacia atrás a través de la abertura y cree una sutura suelta de un solo tiro.</li>
	<li>Usando tijeras hacer una incisión de 1-2 mm hacia el ápice del corazón, penetrando el ventrículo derecho de paredes delgadas (RV), para permitir la inserción del catéter (Unidad 1). Antes de la inserción, confirme que no hay aire en el sistema. Introducir el tubo cebado en el ventrículo derecho y avanzar suavemente en la SEMItransparente PAT de paredes delgadas.<ol>
<li>Verifique visualmente que el catéter no ha avanzado hacia las ramas pulmonares izquierda o derecha y no se encuentra con la rama de la arteria pulmonar. Con cinta adhesiva, fije la parte distal del tubo a la placa quirúrgica. NOTA: Para identificar la RV, utilice fórceps para pellizcar el lado derecho del corazón. A diferencia del ventrículo izquierdo, la pared libre relativamente delgada de la RV debe ser fácilmente agarrada.</li>
		<li>Para ratones menores que P7, conecte la unidad 2 a un micromanipulador e introduzca el extremo de la aguja de la unidad en la PALMADITA como se ha descrito anteriormente utilizando el manipulador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Apriete suavemente la sutura suelta alrededor de ambos grandes recipientes y corte la longitud de 8 cm de sutura creada en el paso 3.2 para devolver el corazón a una posición de reposo natural. El catéter ahora está firmemente asegurado dentro de la PAT.</li>
	<li>Recorte la aurícula izquierda del corazón para permitir que perfusate salga del sistema.</li>
	<li>Asegure la jeringa que contiene SNP (Unidad 1 o Unidad 2, dependiente del tamaño) en la bomba de la jeringa y perfunda la solución a una velocidad de 0,05 ml/min para vaciar la sangre y dilatar al máximo la vasculatura. La sangre/perfuto saldrá a través de la aurícula recortada. Continúe con la perfusión hasta que la perfusión quede clara (200 ml en un ratón adulto, menos para los animales más jóvenes). NOTA: Al perfunde la baja viscosidad PBS/SNP, se utilizó una tasa de perfusión relativamente más alta en aras de ahorrar tiempo. El compuesto de polímero más viscoso se infunde a un ritmo más lento para evitar el sobrellenado, la ruptura y maximizar el control sobre los puntos finales distales.</li>
</ol>4. Traqueotomía e inflación pulmonar
<ol><li>Construir la unidad de inflado pulmonar (Figura 2).<ol>
<li>Conecte un catéter de plástico flexible de 24 G por vía intravenosa (IV) (se extrae la aguja)/un conjunto de perfusión de mariposa a un tapón, unido a una jeringa abierta de 50 ml (sin émbolo). Cuelgue la jeringa de un soporte de anillo.</li>
		<li>Añadir 10% de formalina tamponada a la jeringa. Abra la llave, permitiendo que el formol entre en el tubo y purgue todo el aire del sistema. Cierre el llave y levante la jeringa hasta que el menisco esté 20 cm por encima de la tráquea8. ADVERTENCIA: Formalin es inflamable, cancerígeno, agudamente tóxico cuando se ingiere, y causa irritación de la piel, daño ocular grave, sensibilización de la piel y mutagenicidad de las células germinales. Evite la ingestión y el contacto con la piel y los ojos. Evite la inhalación del vapor o la niebla. Mantener alejado de fuentes de ignición. Use el equipo de protección personal adecuado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque dos suturas sueltas inferiores al cartílago cricoide 2-4 mm de separación.</li>
	<li>Usando tijeras, haz una pequeña incisión en el ligamento cricotiroido superior a las suturas.</li>
	<li>Inserte el catéter IV en la abertura y avance la punta más allá de las dos suturas sueltas.</li>
	<li>Apriete las suturas alrededor de la tráquea y abra el llave. Permita que la formalina entre en los pulmones por gravedad y espere 5 minutos para que los pulmones se inflan completamente. Si los pulmones se adhieren a la caja torácica durante la inflación, agarre el exterior de la caja torácica con fórceps con puntas contundentes y muévase en todas las direcciones para ayudar a liberar los lóbulos. No haga contacto directo con los pulmones.</li>
	<li>Después de 5 minutos, retroceda el catéter IV más allá de la primera sutura y el ligato. Repita para la segunda sutura. Los pulmones ahora están inflados en un estado cerrado y presurizado.</li>
</ol>5. Fundición de la vasculatura
<ol><li>En un tubo de 1,5 ml, prepare 1 ml de unasolución 8:1:1 de polímero:diluir:agente de curado e invierta suavemente varias veces para asegurar una buena mezcla.</li>
	<li>Retire el émbolo de una jeringa de 1 cc, cubra el extremo opuesto con un dedo enguantado y vierta el compuesto de polímero en la jeringa. Vuelva a insertar cuidadosamente el émbolo, invierta y avance el émbolo para eliminar todo el aire y formar un menisco en la punta de la jeringa.</li>
	<li>Retire la jeringa SNP/PBS del cubo de la aguja y gotee PBS adicional en el cubo para crear un menisco. Revise cuidadosamente el cubo en busca de aire atrapado, desalojar si es necesario, y reformar el menisco. Unir el cubo a la jeringa llena con el compuesto de polímero. NOTA: La creación de un menisco en ambos extremos reduce significativamente la posibilidad de que el aire entre en el sistema.</li>
	<li>Fije la jeringa llena de compuesto de polímero a la bomba de la jeringa e infunda a 0,02 ml/min. NOTA: Para los pulmones más pequeños, una velocidad más lenta puede ser útil para prevenir el sobrellenado, pero no es esencial.</li>
	<li>Supervise el compuesto a medida que se mueve libremente por el tubo de PE y observe el volumen de la jeringa al entrar en la PAT. Continúe llenando hasta que todos los lóbulos se llenen completamente hasta el nivel capilar y detenga la bomba de la jeringa. Compruebe de nuevo el volumen de la jeringa. NOTA: Después de varias corridas, se puede utilizar un volumen estimado para medir un punto final aproximado (35 oL para un ratón adulto y 5 ml para un cachorro de P1). Después de detener la bomba, la presión residual en el sistema continuará empujando el compuesto del polímero en las arterias pulmonares. Todos los lóbulos pulmonares deben llenarse a una velocidad similar.</li>
	<li>Cubra los pulmones con una toallita limpiadora de fibra óptica, aplique liberalmente PBS y deje que la carcasa se siente intacta durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Durante este período, el compuesto de polímero se curará y endurecerá.</li>
	<li>Retire el catéter, corta los brazos/la mitad inferior del ratón y coloca la cabeza/tórax en una cónica de 50 ml llena de formalina tamponada al 10% durante la noche.</li>
	<li>Después de la fijación, agarre la tráquea y separe suavemente la unidad del corazón/pulmón de la caja torácica y el tórax restantes. Coloque el bloqueo del corazón/pulmón en un vial de centelleo lleno de formol. Desecha el resto.</li>
</ol>6. Camas vasculares alternativas para fundición (Tabla 1)
NOTA: Cada lecho vascular objetivo puede requerir diferentes colocaciones de catéter, tasas de perfusión y tiempos de llenado óptimos. Por lo tanto, varios animales serán necesarios para lanzar múltiples órganos.
<ol><li>Para las camas vasculares sistémicas superiores o inferiores al diafragma siga los pasos 1.1-2.5 como se indica arriba. Véanse las notas adicionales sobre el sistema del portal y el diafragma (Tabla 1).</li>
	<li>Agarre el proceso de xifoide con un hemostat y corte la caja torácica bilateralmente (aproximadamente en la línea media axilar) justo antes de las arterias torácias internas.</li>
	<li>Doblar la caja torácica todavía conectada sobre tal manera que está descansando sobre el cuello / cabeza del animal, exponiendo completamente la cavidad torácica.</li>
	<li>Siga el paso 3.1 anterior y, a continuación, retire los pulmones. Una vez que la aorta torácica (TA) es visible, enganchar las puntas de los fórceps curvos debajo de ella, 10 mm superior al diafragma. Agarre una longitud de 3 cm de seda 7-0, tire hacia atrás a través de la abertura debajo del TA y cree una sutura suelta de un solo tiro. Repita este procedimiento 8 mm por encima del diafragma.</li>
	<li>Para estructuras superiores al diafragma, utilice tijeras de resorte para crear un pequeño agujero (30% de la circunferencia total) en la porción ventral del TA, inferior a las suturas sueltas colocadas en el paso 6.4.<ol>
<li>Para las estructuras inferiores al diafragma, en su lugar, cree un pequeño agujero de 2 mm superior a las suturas sueltas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dependiendo del tamaño del animal, introduzca la Unidad 1 o 2 en el recipiente, avance más allá de las suturas sueltas y liga suavemente el recipiente.</li>
	<li>Siga el paso 3.7, ajustando la bomba de la jeringa a una velocidad de 1,0 ml/min y perfundiendo un mínimo de 5 ml. Persate saldrá a través del CIV.</li>
	<li>Siga los pasos 5.1 - 5.4 ajustando la velocidad de perfusión a 0,05 ml/min, monitoreando visualmente el tejido objetivo en tiempo real. NOTA: El volumen de perfusión será específico de la edad de órganos y animales. El volumen puede limitarse aún más mediante la ligadura de ramas arteriales que conducen a lechos vasculares no objetivo (es decir, cerebro, hígado, riñón, intestino).</li>
	<li>Siga 5.6 y luego retire el tejido objetivo y colóquelo en formalina.</li>
</ol>7. Montaje de muestras, escaneo y reconstrucción para micro-CT
<ol><li>Usando película de parafina, cree una superficie plana en la cama de escaneo y centre la muestra húmeda en esta superficie (Figura 3A). NOTA: Si se detecta un artefacto de movimiento, es posible que la muestra requiera una estabilización adicional.</li>
	<li>Ligeramente tentar / cubrir la muestra con película de parafina adicional para prevenir la deshidratación. Tenga especial cuidado de no apoyar la película de parafina en la muestra causando deformación en el tejido (Figura 3B).</li>
	<li>Escanee el ejemplo utilizando la configuración descrita en la Tabla 2 y estandarice estos parámetros dentro de un experimento determinado. NOTA: Esto depende del experimento/punto final. Estandarice los parámetros elegidos para facilitar la comparación entre muestras.</li>
	<li>Transfiera los escaneos reconstruidos para el postprocesamiento y el análisis.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Ejecutado correctamente, este método produce imágenes impactantes de redes arteriales pulmonares, lo que permite la comparación y experimentación en modelos de roedores. Varios pasos críticos en el camino aseguran el éxito. En primer lugar, los investigadores deben heparinizar al animal en la etapa preparatoria para evitar que se formen coágulos de sangre en la vasculatura pulmonar y las cámaras del corazón. Esto permite el tránsito arterial completo del compuesto de polímero. En segundo lugar, al perforar el diafragma y...

El enfoque de esta técnica es la visualización de la arquitectura arterial pulmonar utilizando un compuesto a base de polímeros en ratones. Si bien se ha realizado un trabajo extenso en lechos vasculares sistémicos como el cerebro, el corazón y los riñones1,2,3,4,5, se dispone de menos información sobre la preparación y llenado de la red arterial pulmonar. El objetivo de este estudio, por lo tanto, es ampliar el trabajo anterior6,7,8 y proporcionar una referencia detallada escrita y visual que los investigadores pueden seguir fácilmente para producir imágenes de alta resolución del árbol arterial pulmonar.
Si bien existen numerosos métodos para etiquetar y tomar imágenes de vasculatura pulmonar, como la resonancia magnética, la ecocardiografía o la angiografía por TC9,10, muchas de estas modalidades no logran llenar y/o capturar adecuadamente los vasos pequeños, lo que limita el alcance de lo que se puede estudiar. Métodos tales como sección en serie y reconstrucción proporcionan alta resolución, pero son intensivos en tiempo/trabajo11,12,13. La integridad de los tejidos blandos circundantes se ve comprometida en la fundición de corrosión tradicional10,13,14,15,16. Incluso la edad y el tamaño de los animales se convierten en factores al intentar introducir un catéter o, la resolución es deficiente. La técnica de inyección de polímero, por otro lado, llena las arterias al nivel capilar y cuando se combina con el TCT, permite una resolución sin igual5. Las muestras de los pulmones de ratón tan jóvenes como el día 14 postnatal se han echado con éxito8 y se han procesado en cuestión de horas. Estos pueden ser reencaneados indefinidamente, o incluso enviados para preparación histológica / microscopía electrónica (EM) sin comprometer el tejido blando existente17. Las principales limitaciones de este método son el costo inicial de los equipos/software de TC, los desafíos con el monitoreo preciso de la presión intravascular y la incapacidad de adquirir datos longitudinalmente en el mismo animal.
Este documento se basa en el trabajo existente para optimizar aún más la técnica de inyección de la arteria pulmonar y empujar los límites relacionados con la edad/tamaño hasta el día posnatal 1 (P1) para producir resultados sorprendentes. Es más útil para los equipos que quieren estudiar redes vasculares arteriales. En consecuencia, proporcionamos nuevas directrices para la colocación/estabilización del catéter, un mayor control sobre la tasa de llenado/volumen y destacamos los notables escollos para un mayor éxito de fundición. Los moldes resultantes se pueden utilizar para futuras caracterizaciones y análisis morfológicos. Tal vez lo más importante, esta es la primera demostración visual, a nuestro conocimiento, que guía al usuario a través de este intrincado procedimiento.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 cc</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>viales de centelleo de vidrio de 20 ml</td><td>Fisher</td><td>03-340-25P</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 30 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 50 ml</td><td>Cornin</td><td>352098</td><td>para almacenamiento y escaneo de muestras</td></tr><tr><td>Jeringa de 60 cc</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>7-0 seda sutura</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 12.0 Software</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>Software principal</td></tr><tr><td>Amira 6.7 Software Thermo</td><td>Scientific</td><td>N/A</td><td>Software alternativo</td></tr><tr><td>Tijeras CeramaCut 9cm</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva con recubrimiento cerámico</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de CO2</td><td>Robert's Oxygen Co.</td><td>n/a</td> Bomba de jeringa <td></td></tr><tr><td>doble</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-74900-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Mini-Forceps</td><td>Herramientas de Fine Science</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma - Ciencias de la</td><td>Vida HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Covidien 441215</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Herramientas de Fine Science</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparina (1000USP Unidades/ml)</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Horos Software</td><td>Horos Project</td><td>N/A</td><td>Cámara</td></tr><tr><td>de inducción</td> de software alternativo <td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>toallita de limpieza de fibra óptica</td></tr><tr><td>Cinta de etiquetado</td><td>Fisher</td><td>15966</td><td></td></tr><tr><td>Base magnética</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Micro-CT</td><td>PerkinElmer</td><td>Quantum GX</td><td></td></tr><tr><td>Microfil (Compuesto polimérico)</td><td>Flowech Inc.</td><td>Kit B - MV-122</td><td>8 onzas de compuesto MV; 8 onzas de diluyente; MV-Agente de curado</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Stoelting</td><td>56131</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 1/2 ml Jeringa de insulina</td><td>Covidien 1188528012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octagon Pinzas Dientes rectos Herramientas</td> de <td>ciencia fina</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis company, Inc.</td><td></td><td></td>#PM999</tr><tr><td>Tubo PE-10</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte tamponado solución salina</td><td>BioRad</td><td>#161-0780</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de anillo</td><td>Fisher</td><td>S13747</td><td>Altura 24in.</td></tr><tr><td>Nitroprusside de sodio</td><td>sigma</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Placa de acero</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>16 x 16 pulgadas de área, 1/16 pulgadas de espesor</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte recto</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>SURFLO 24G Teflón I.V. Catéter</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>360103</td><td></td></tr><tr><td>Tablero quirúrgico</td><td>Fisher</td><td>12-587-20</td><td>Este es un soporte de portaobjetos convertido</td></tr><tr><td>Abrazadera universal de 3 puntas</td><td>Fisher</td><td>S24280</td><td></td></tr><tr><td>Winged Inf. Set 25X3/4, Tubo de 12"</td><td>Nipro</td><td>PR25G19</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi-508 Visor de disección</td><td>Zeiss n</td><td>/a</td><td></td></tr></tbody></table>

fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-ct

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Los vasos sanguíneos forman redes intrincadas en el espacio tridimensional. Por lo tanto, es difícil apreciar visualmente cómo interactúan y se comportan las redes vasculares observando la superficie de un tejido. Este método proporciona un medio para visualizar la compleja arquitectura vascular tridimensional del pulmón.
Para lograr esto, se inserta un catéter en la arteria pulmonar y la vasculatura se enjuaga simultáneamente de sangre y se dilata químicamente para limitar la resistencia. Los pulmones se inflan a través de la tráquea a una presión estándar y el compuesto del polímero se infunde en el lecho vascular a un caudal estándar. Una vez que toda la red arterial se llena y se le permite curar, la vasculatura pulmonar puede visualizarse directamente o ser imagen en un escáner de micro-CT .
Cuando se realiza con éxito, se puede apreciar la red arterial pulmonar en ratones que van desde edades posnatales tempranas hasta adultos. Además, mientras se demuestra en el lecho arterial pulmonar, este método se puede aplicar a cualquier lecho vascular con la colocación optimizada del catéter y puntos finales.

Un molde exitoso exhibirá un llenado uniforme de toda la red arterial pulmonar. Lo demostramos en ratones C57Bl/6J que varían en edad: día posnatal P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) y P1 (Figura 4D). Mediante el control de la velocidad de flujo y la supervisión visual del relleno en tiempo real, se lograron puntos finales fiables de la vasculatura más dist...

El objetivo de esta técnica es la visualización ex vivo de redes arteriales pulmonares de ratones postnatales y adultos tempranos a través de la inflación pulmonar y la inyección de un compuesto radioopaco a base de polímeros a través de la arteria pulmonar. También se discuten las posibles aplicaciones para los tejidos fundidos.

Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Este protocolo proporciona una guía precisa paso a paso para la fundición de la vasculatura arterial pulmonar en ratones postnatales adultos y tempranos. Esta técnica permite a los usuarios lanzar completamente toda la red vascular para su visualización mediante una variedad de métodos, incluyendo micro-CT, manteniendo al mismo tiempo la integridad de los tejidos blandos. Esta técnica es particularmente útil para examinar la morfología y la arquitectura pulmonar-vascular, pero se puede adaptar fácilmente para la focalización de otras camas vasculares.Al igual que muchas cirugías y disecciones, no hay sustituto para visualizar realmente un procedimiento, y los espectadores pueden beneficiarse de ver algunas de las maniobras más desafiantes que se están realizando. Una vez expuesto el proceso de xifoide, agarre y eleve suavemente la caja torácica. Haga cuidadosamente una incisión en el diafragma semitransparente ahora expuesto.Los pulmones colapsarán visiblemente y se alejarán del diafragma. Después de exponer el pulmón y la tráquea, enhebra 15 centímetros de tubo de PE10 en el cubo de una aguja de calibre 30. Y conecte esta unidad a una jeringa de un mililitro, que contenga 10 al molar 4 de nitroprusido sódico, en PBS.Avance el émbolo para preparar el tubo hasta que todo el aire haya sido purgado. Como alternativa eficaz al texto, penetra el ápice del corazón en un lado, y pasa las puntas de los fórceps curvos a través del músculo, y hacia fuera el otro lado del tejido. Sujete un extremo de una longitud de 10 centímetros de seda de 7-0 y tire de aproximadamente dos centímetros a través del tejido.Después de atar la sutura, utilice los ocho centímetros restantes de sutura para tirar del corazón caudalmente. Y pegue el extremo de la sutura a la placa quirúrgica. Enganche las puntas de los fórceps curvos bajo la aorta ascendente y el tronco de la arteria pulmonar.Y tire de una longitud de tres centímetros de 7-0 de la seda hacia atrás a través de la abertura para crear una sutura suelta de un solo tiro. Usa tijeras para hacer una incisión de uno a dos milímetros hacia el ápice del corazón, penetrando en el ventrículo derecho de paredes delgadas. E introducir el tubo cebado en el ventrículo derecho, avanzando suavemente el catéter en el tronco de la arteria pulmonar semitransparente, de paredes delgadas.Verifique visualmente que el catéter no ha avanzado hacia las ramas pulmonares izquierda o derecha, y no se encuentra con el punto de rama de la arteria pulmonar. Pegue la parte distal del tubo en la placa quirúrgica y apriete suavemente la sutura suelta alrededor de ambos vasos grandes. Corte la pieza de sutura de ocho centímetros para devolver el corazón a una posición de reposo natural.Y corta el oráculo izquierdo del corazón para permitir que el perfuto salga de la vasculatura. A continuación, utilice una bomba de jeringa, para infundir nitroprusido de sodio a un caudal de 0,5 ml/min para vaciar la sangre, y para dilatar al máximo la vasculatura, hasta que la perfusión se despeje. Para construir la unidad de inflado pulmonar, corte el catéter intravenoso de plástico flexible de calibre 24 de una bañera y conéctelo a la aguja de un conjunto de infusión de mariposas.Fije esta unidad a la llave y conecte el llave de tope a una jeringa abierta de 50 mililitros. Después de cargar la jeringa con formalina y cebar el catéter, con el llavero cerrado, coloque la jeringa en un soporte de anillo, hasta el punto en el que el menisco esté 20 centímetros por encima de la tráquea. Coloque dos suturas sueltas, de dos a cuatro milímetros de distancia, inferiores al cartílago cricoide, y use tijeras para hacer una pequeña incisión en el ligamento cricotiroido, superior a las suturas.Inserte el catéter en la abertura y avance la punta más allá de las dos suturas sueltas. Apriete las suturas alrededor de la tráquea, y abra el llave para permitir que el formol entre en los pulmones por gravedad. Espere cinco minutos para que los pulmones se inflan por completo.Si los pulmones se adhieren a la caja torácica durante la inflación, utilice fórceps con puntas contundentes para agarrar el exterior de la caja torácica, y mueva las costillas en todas las direcciones para ayudar a liberar los lóbulos sin hacer contacto directo con los pulmones. Después de cinco minutos, retraiga el catéter detrás de la primera sutura y ligato. Luego retraiga el catéter detrás de la segunda sutura y ligate.Los pulmones ahora deben inflarse en un estado cerrado y presurizado. Para fundir la vasculatura, cargue un mililitro de una solución 8-1-1 de agente de curado diluyente de polímero en una jeringa de un mililitro. E inserte cuidadosamente el émbolo.Con la jeringa invertida, presione el émbolo para extraer el aire y para permitir la formación de un menisco en la punta de la jeringa. Retire la jeringa de nitroprusido sódico del cubo de la aguja, y la adición de goteo PBS en el cubo, para crear un menisco. Une la jeringa compuesta por polímero al cubo e inicia la perfusión a 0,02 milímetros por minuto.Supervise el compuesto a medida que se mueve libremente a través del tubo, observando el volumen de la jeringa a medida que entra en el tronco de la arteria pulmonar. Continúe la profusión hasta que todos los lóbulos estén completamente llenos, hasta el vaso más pequeño. Detenga la bomba y, una vez más, observe el volumen de la jeringa.Cubra los pulmones con una toallita limpiadora de fibra óptica y aplique liberalmente PBS. Deje que la muestra se siente intacta durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiente. Una vez que el compuesto del polímero se cura y endurece, cortar las extremidades y la mitad inferior del ratón.Y coloque la cabeza y el tórax en una formalina cónica llena de 50 mililitros 10%, durante la noche. A la mañana siguiente, agarre la tráquea para separar suavemente el corazón y la unidad pulmonar de la caja torácica y el tórax restantes. Coloque el bloque de tejido cosechado en un vial de centelleo lleno de formalina.Un molde exitoso resultará en un llenado uniforme de toda la red arterial pulmonar. Si hay daño en las vías respiratorias pulmonares o pulmonares, pequeñas fugas evitarán que los pulmones mantengan presión. El llenado irregular o incompleto puede surgir de una esclusa de aire como resultado de la introducción de aire en el sistema vascular a través del catéter, bloqueando el flujo aguas abajo del compuesto.El relleno se produce cuando se introduce muy poco compuesto en la vasculatura. Alternativamente, el sobrellenado, o la introducción de demasiado compuesto de polímero demasiado rápido, puede causar ruptura arterial, o, más comúnmente, tránsito venoso. Avanzar demasiado por el tronco pulmonar puede hacer que la punta se a cuña en una rama de la arteria pulmonar, creando un desequilibrio en el flujo, y haciendo que un lado se llene más rápido que el otro.El rendimiento cuidadoso de la técnica como se ha demostrado, utilizando el control directo adecuado de los puntos finales de la vasculatura distal, y las tasas de perfusión estándar pueden resultar en un llenado óptimo de la vasculatura pulmonar. Además, la adaptación de esta técnica a la vasculatura sistémica puede producir resultados igualmente favorables en otros lechos vasculares. Después de la fundición, las muestras se pueden procesar para la exploración de tomografía microcalculcó.Para el postprocesamiento, se puede utilizar un paquete de software comercial para generar una representación de volumen 3D del árbol pulmonar-vascular. Al intentar esta técnica por primera vez, tenga especial cuidado alrededor de los pulmones frágiles, y la arteria pulmonar. Lo más importante, evitar introducir aire en el circuito vascular.Después de un molde exitoso, una muestra puede ser escaneada por micro-CT, y se pueden explorar preguntas relacionadas con la morfometría vascular y la arquitectura.

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