Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la recolección de muestras, la preparación del extracto y la inmunoprecipitación para la confirmación de una extracción exitosa de proteínas y la detección de proteínas coinmunoprecipitadas de interés. La preparación del extracto de proteína se puede realizar para hasta 24 muestras y es compatible con una serie de aplicaciones posteriores, incluidos los experimentos de inmunoprecipitación y extracción de ARN. Este método se puede adaptar para facilitar la prueba de interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, marcadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de antecedentes genéticos.

La demostración visual de este protocolo tiene como objetivo hacer que los investigadores se sientan cómodos con la preparación del extracto de proteínas y la inmunoprecipitación, con la esperanza de alentar a aquellos nuevos en las técnicas a usarlas en sus investigaciones. Para recolectar una muestra de lombrices, primero siembre lombrices en etapa mixta o sincronizada en placas de medio de crecimiento de nematodos sólidos a la temperatura requerida y permita que las lombrices crezcan hasta la etapa deseada. Al final de la incubación, use tampón M9 para lavar los gusanos en un tubo cónico de 15 mililitros y pellet los gusanos por centrifugación.

Al final de la centrifugación, retire el sobrenadante y lave los gusanos de tres a cinco veces más con tampón M9 nuevo por lavado. Cuando el sobrenadante ya no esté turbio, realice un lavado final con agua destilada doble y transfiera la bolita de gusano suelta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Granule los gusanos con una centrifugación adicional y deseche el sobrenadante restante para obtener un pellet de lombriz empaquetado.

Para preparar el extracto del gránulo de gusano recolectado, agregue un volumen igual de tampón de lisis 2X helado a un gránulo de volumen recomendado de 300 microlitros y mezcle vigorosamente la suspensión resultante. Gire la muestra para recoger la mezcla en el fondo del tubo y transfiera el contenido del tubo a un tubo libre de ARNasa de 1,5 mililitros que contenga perlas de metal. Después de tapar herméticamente el tubo, coloque la muestra en un homogeneizador de molino de bolas a cuatro grados centígrados, teniendo cuidado de que la muestra esté equilibrada dentro del homogeneizador.

Homogeneizar la muestra a la velocidad máxima durante cuatro minutos antes de transferir la muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros sin cordones. Gire la muestra para clarificar el extracto de proteína y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros en hielo sin transferir el precipitado blanco turbio en la parte superior de la muestra. Reserve 10 microlitros del extracto clarificado para determinar la concentración total de proteína de acuerdo con los protocolos estándar e diluya inmediatamente la muestra a cinco o 10 miligramos de proteína por mililitro de tampón de lisis 1X frío en hielo.

Para la inmunoprecipitación de la proteína de interés, primero resuspenda las perlas magnéticas por inversión y transfiera 150 microlitros de la suspensión de perlas 50X a un tubo de 1,5 mililitros. Magnetice las cuentas en hielo contra un soporte magnético durante aproximadamente un minuto. Cuando la solución esté clara, deseche el sobrenadante.

Retire el tubo del soporte magnético y lave las perlas con tres volúmenes de 300 microlitros de tampón de lisis 1X. Después del último lavado, vuelva a suspender las perlas en 150 microlitros de tampón de lisis helada y transfiera 75 microlitros de la suspensión de perlas a dos miligramos de la muestra de extracto de proteína. Después de una incubación de una hora a cuatro grados centígrados con una agitación suave, coloque el tubo de muestra en el imán sobre hielo durante aproximadamente un minuto.

Cuando las perlas estén completamente magnetizadas y la muestra sea clara, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros sin alterar las perlas. Reserve el 10% de la muestra para el análisis de Western blot y agregue 20 microgramos de anticuerpo purificado de afinidad al lisado previamente aclarado para una incubación de una hora a cuatro grados Celsius con agitación suave. Al final de la incubación, agregue los 75 microlitros restantes de suspensión de perlas prelavadas a la mezcla de lisado de anticuerpos para una incubación adicional de una hora a cuatro grados centígrados con una agitación suave.

Al final de la incubación, vuelva a colocar la muestra en el imán durante aproximadamente un minuto. Cuando las perlas estén completamente magnetizadas y la muestra sea clara, lave las perlas que contienen el inmunoprecipitado tres veces en 450 microlitros de tampón de lavado con hielo. Después del último lavado, vuelva a suspender el gránulo de perlas en 20 microlitros de tampón de carga de gel de proteína beta-mercaptoetanol SDS 2X y hierva la muestra a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Para la detección de las proteínas inmunoprecipitadas mediante el análisis de Western blot, cargue la muestra de proteína desnaturalizada en un gel SDS-PAGE sin transferir las perlas y realice el análisis de Western blot de acuerdo con los protocolos estándar utilizando los anticuerpos apropiados para las proteínas de interés, luego detecte las bandas utilizando quimioluminiscencia basada en peroxidasa de rábano picante. El protocolo demostrado de homogeneizador de molino de bolas es comparable en la extracción total de proteínas a los métodos basados en dounces para la extracción eficiente de proteínas nucleares y citoplasmáticas. En este análisis, se determinó que las proteínas Argonaute interactúan con los miembros de la familia de proteínas GW182 formando los complejos de silenciamiento inducidos por microARN que se unen a los ARN mensajeros objetivo y reprimen su expresión.

Los protocolos de extracto e inmunoprecipitación demostrados también se pueden utilizar para recuperar con éxito coinmunoprecipitados específicos de ALG-1 y HRPK-1. Además, las pruebas de la interacción ALG-1:AIN-1 en una variedad de antecedentes genéticos revelaron que HRPK-1 es innecesaria para el ensamblaje del complejo de silenciamiento inducido por microARN ALG-1:AIN-1. Es importante asegurarse de que la extracción de proteínas y la inmunoprecipitación se realicen a cuatro grados centígrados o en hielo para mantener la estabilidad de las muestras.

Esta preparación de extracto de proteína total es compatible con la inmunoprecipitación de proteínas y los experimentos de extracción de microARN utilizando un oligonucleótido complementario de microARN y facilita la recolección posterior de componentes de proteínas y ARN.