Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo
9 de junio de 2020
El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.
Este protocolo describe un método noble y fácil para crear tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de partes corporales inducidas por el hombre y células cardíacas derivadas de células STEM. La flexibilidad de la geometría del tejido y la escalabilidad de la función de tejido preservado son las principales ventajas de esta técnica. Las ECT de forma de malla implantada pueden restaurar una estructura cardíaca y funcionar en un modelo de infarto de miocardio de rata.
Confirmando su viabilidad para su uso en terapia regenerativa cardíaca. Estas técnicas requieren el procesamiento reproducible de células STEM humanas y las habilidades de cultivo de tejidos para obtener resultados consistentes. Comience cortando una hoja PDMS curada al tamaño adecuado para permitir que la hoja se una con adhesivo de silicona para fabricar una bandeja rectangular de 21 por 20,5 milímetros con siete milímetros de largo 0,5 milímetros de ancho y postes rectangulares de 2,5 milímetros de alto en posiciones escalonadas.
El espaciado horizontal entre dos líneas de postes debe ser de 2,5 milímetros. Autoclave la bandeja a 120 grados Celsius durante 20 minutos antes de recubrir el molde con 1%Poloxamer 407 en PBS durante una hora. A continuación, enjuague bien el molde con PBS y coloque el molde en un pozo de una placa de seis pozos.
Para el análisis de linaje, combine las células del cardiomiocitos más los protocolos de células murales endoteliales y vasculares. De modo que la concentración final de células murales es de 10 a 20% en un número de célula total de seis veces 10 a las seis celdas por construcción. Mezclar 133 microlitros de colágeno de cola de rata soluble en ácido tipo una solución y 17 microlitros de tamampón alcalés a 17 microlitros de 10X Mínimo Esencial Medio sobre hielo.
A continuación, agregue 67 microlitros de matriz de membrana de sótano a la solución de colágeno. A continuación, centrifugar las células y resuspender el pellet en 167 microlitros de alto nivel de glucosa alta Dulbecco's Minimal Essential Medium complementado con suero bovino fetal y antibióticos. Mezclar las células en la solución de matriz en hielo.
A continuación, vierta cuidadosamente 400 microlitros de la suspensión de la matriz celular en el poloxámero 407 recubierto de molde de tejido PDMS. Incubar la mezcla de matriz celular en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 60 minutos. Cuando el tejido se haya formado, remoje cuidadosamente el molde con cuatro mililitros de medio de cultivo de TEC y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 14 días.
Antes de la implantación de la TEC, esterilizaste fórceps finos para eliminar cuidadosamente la TEC de los postes de carga. Los moldes de tejido se pueden fabricar con varios patrones, longitudes de poste y espaciado posterior para generar diferentes geometrías de ECT finales. Para este análisis, se utilizó un molde con postes de siete milímetros de largo con intervalos de 2,5 milímetros de ancho.
Poloxámero 407 evita la adhesión de las células al molde y permite la formación de una estructura de malla característica, después de una rápida compactación del gel en 14 días. La estructura se mantiene incluso después de que el ECT se libera del molde. La construcción del tejido fabricado tiene aproximadamente 1,5 centímetros de ancho y 0,5 milímetros de espesor.
Y el ancho de cada paquete en la malla es de aproximadamente 0,5 milímetros de media. Es posible generar un ECT de malla de 3 centímetros de ancho final que contiene 24 millones de celdas de un molde cuatro veces más grande con el mismo diseño de poste escalonado. Este ECT de malla más grande también se puede quitar fácilmente del molde y genera un acto local de fuerza equivalente a la malla más pequeña ECT.
Es importante verter la mezcla de matriz celular uniformemente en el molde de tejido sin generar burbujas para evitar que se sientan defectos en el gel final. Caracterización funcional del contratista. y las relaciones de cuarta frecuencia se pueden realizar utilizando sistemas incorporados.
Nuestro objetivo final es la traducción de paradigmas DE TEC en terapias clínicas que utilizan grandes estudios preclínicos animales.
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Resumen
Este protocolo describe un método novedoso y sencillo para crear tejidos cardíacos modificados en forma de malla derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. La técnica permite investigar la terapia mediante implante celular para enfermedades cardíacas, particularmente en un modelo de infarto de miocardio en ratas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos cardíacos
- Terapia con células madre
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- Los tejidos cardíacos ingenierizados pueden restaurar la estructura y la función cardíaca.
- Las células madre pluripotentes inducidas humanas son un recurso valioso para la obtención de células cardíacas.
- La flexibilidad de la geometría del tejido es crucial para un implante eficaz.
- La reproducibilidad en el procesamiento de células madre es esencial para obtener resultados consistentes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para crear tejidos cardíacos modificados con forma de malla.
- Evaluar la viabilidad de estos tejidos en la terapia regenerativa cardíaca.
- Investigar la recuperación de la función cardíaca tras el implante.
Métodos Utilizados
- Elaboración de una bandeja rectangular utilizando PDMS y adhesivo de silicona.
- Creación de postes para soportar los tejidos ingenierizados.
- Implantación de los tejidos cardíacos ingenierizados en un modelo de rata.
- Evaluación de la restauración de la estructura y función cardíacas.
Resultados principales
- Los tejidos cardíacos modificados en forma de malla restauraron con éxito la función cardíaca.
- El método demostró escalabilidad y flexibilidad en la geometría del tejido.
- Se obtuvieron resultados consistentes mediante un procesamiento reproducible de células madre.
- La técnica es factible para su uso en terapia regenerativa cardíaca.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para crear tejidos cardíacos ingenierizados.
- Los tejidos con forma de malla pueden restaurar eficazmente la función cardíaca en un modelo de infarto de miocardio.
- El enfoque tiene potencial para futuras terapias regenerativas cardíacas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la producción escalable de tejidos cardíacos modificados en forma de malla a partir de células cardiovasculares derivadas de iPSC humanas, ofreciendo una plataforma reproducible para estrategias de reparación miocárdica. El enfoque permite la evaluación preclínica de la integración del tejido y la recuperación funcional en modelos de lesión isquémica, abordando una brecha crítica en la cardiología regenerativa. Al proporcionar un constructo geométricamente ajustable y escalable, facilita la reducción de riesgos traslacionales de las terapias basadas en células madre para la insuficiencia cardíaca.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el análisis de la integración estructural y funcional de células cardíacas derivadas de hiPSC in vivo.
- Valor operativo: Proporciona un formato de tejido estandarizado y reproducible para obtener lecturas preclínicas consistentes entre estudios.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera métricas estructurales cuantificables (por ejemplo, alineación de los haces de miofibras, contracción sincrónica) para el desarrollo de ensayos funcionales.
- Valor operativo: Permite la escalabilidad hacia construccos más grandes (hasta 3,0 cm), facilitando pruebas de respuesta a la dosis y de consistencia entre lotes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la viabilidad de restaurar la estructura y función cardíacas en un modelo de infarto de miocardio en ratas, lo que apoya la desvinculación mecanicista de riesgos.
- Valor operativo: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante flujos de trabajo estandarizados de implantación y evaluación funcional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método posiciona los ECT en forma de malla como un puente entre el descubrimiento y la fase preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis en las etapas iniciales del descubrimiento y la validación funcional en fases preclínicas mediante la producción escalable y reproducible de tejidos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos mediante la evaluación controlada de la integración y la función electromecánica de células cardíacas derivadas de células iPS humanas.
- Selección: Proporciona tejidos estandarizados y listos para ensayos con resultados cuantificables (sincronía de latidos, alineación) para la comparación de compuestos o condiciones.
- Análisis: Ofrece lecturas estructurales y funcionales (dimensiones del constructo, diámetro de las miofibras, sincronía de la contracción) que permiten el análisis comparativo entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Garantiza la continuidad desde la maduración in vitro hasta la recuperación funcional in vivo, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una tecnología de plataforma adaptable a diversas geometrías y escalas, promoviendo la reproducibilidad entre proyectos y la eficiencia de recursos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en el injerto de células madre y su contribución funcional a la reparación cardíaca.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y escalabilidad mediante relaciones celulares definidas, formulación de la matriz y geometría del molde.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos preclínicos reproducibles de eficacia, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos para la regeneración cardíaca basada en el rendimiento tisular validado y la escalabilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la diferenciación de iPSC humanas, especificación de linajes cardiovasculares y técnicas de cultivo de tejidos en 3D.
- Depende del acceso a equipos para moldeo de PDMS, capacidades de esterilización y manipulación precisa de fluidos para la mezcla de matriz y células.
- Necesita la estandarización entre equipos en el abastecimiento celular, la preparación de la matriz y los protocolos de incubación para garantizar la consistencia entre lotes.
- Implica consideraciones de adaptación al escalar a construcciones más grandes o geometrías alternativas, particularmente en relación con la difusión de nutrientes y el acoplamiento eléctrico.
- Limitado por la dependencia actual en modelos de roedores para la validación funcional, lo que requiere sistemas preclínicos más grandes para la traducción clínica.
