Especificación de progenitores hepáticos a partir de células madre pluripotentes utilizando un sistema de diferenciación definida

Este protocolo proporciona un sistema de diferenciación hepática derivado de células madre que ofrece una herramienta reproducible para el estudio de la biología hepática tanto para la investigación básica como para la clínica. Al combinar un protocolo estandarizado y fácil de seguir con reactivos de cultivo listos para usar, este sistema permite la producción de progenitores hepáticos y células similares a los hepatocitos a gran escala. Mantener las células pluripotentes humanas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en un plato de 10 centímetros en laminina-531, alimentándolas diariamente con 10 mililitros de medio de mantenimiento de células madre por plato.

Para preparar placas de laminina 521, diluya la laminina 521 descongelada en DPBS helado con calcio y magnesio hasta una concentración final de ocho microgramos por mililitro. Agregue 250 microlitros de la solución de laminina a cada pocillo de placa de 24 pocillos o 50 microlitros a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Balancee suavemente la placa de lado a lado para cubrir uniformemente los pocillos, luego selle las placas con una película flexible semitransparente y guárdelas a cuatro grados centígrados durante la noche.

El día de la siembra de células, caliente las placas prerrecubiertas en una incubadora de cultivos celulares durante 30 a 60 minutos. Aspire la solución de laminina 521 y agregue medio de mantenimiento de células madre suplementado con 10 inhibidores de ROCK micromolares a cada pocillo, luego devuelva la placa a la incubadora. Cuando la fluidez del recuento de células alcance el 70 al 80%, aspire el medio gastado de la placa de cultivo y lave cada placa de cultivo con cinco mililitros de DPBS sin calcio ni magnesio a temperatura ambiente.

Aspire el lavado DPBS de la placa de cultivo, luego agregue cinco mililitros de reactivo de disociación sin enzimas a la placa e incube la placa a 37 grados Celsius durante ocho a 10 minutos hasta que las células se desprendan visiblemente de la placa. Separe suavemente las células de la placa de cultivo con un raspador de células, luego pipetee el contenido de cada pocillo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de cinco mililitros para producir una suspensión de una sola célula. Para cada línea celular, agrupa las células de todos los pozos de mantenimiento en un tubo estéril de 50 mililitros.

Lave cada placa de cultivo vacía con cinco mililitros de estos medios de mantenimiento de células madre y agregue los lavados al tubo correspondiente con las células agrupadas. Realice tres recuentos de células viables en cada muestra agrupada. Centrifugar las muestras agrupadas a 250 x g durante cinco minutos.

A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en uno a tres mililitros de temperatura ambiente como medio de mantenimiento de células madre suplementado con 10 micromolares inhibidor de ROCK Y27632. Después de calcular el número requerido de celdas necesarias para lograr la densidad de siembra deseada, vuelva a suspender las celdas a la concentración adecuada y dispense en las placas prerrecubiertas. El volumen total por pocillo debe ser de un mililitro para una placa de 24 pocillos y de 0,1 mililitros para una placa de 96 pocillos.

Mueva suavemente las placas de lado a lado y de un lado a otro para asegurar una dispersión uniforme de las células y coloque las placas sembradas en la incubadora, meciéndolas hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado. Preparar los medios para la inducción definitiva del endodermo y para la posterior diferenciación de la especificación de las células progenitoras hepáticas como se describe en el manuscrito del texto. El primer día de la diferenciación, retire el medio gastado de los pozos y reemplácelo con uno medio de la etapa uno.

En los días dos, tres y cuatro, retire el medio gastado y alimente cada pozo con el medio de la etapa uno, dos. Al quinto día, fije los pocillos destinados al análisis definitivo de la diferenciación del endodermo. Para los pocillos restantes, retire el medio gastado y alimente cada pocillo con medio progenitor hepático dif.

En el día 10, recoja células para el análisis de diferenciación de progenitores hepáticos o proceda con una mayor diferenciación celular similar a la de los hepatocitos. Para caracterizar los cultivos de diferenciación de progenitores hepáticos, se utiliza la inmunotinción para detectar la expresión de marcadores específicos definitivos del endodermo en el día cinco y de marcadores específicos del progenitor hepático en el día 10 y cuantificar el porcentaje de células alfa positivas para HNF4. El día 10, mida también la alfafetoproteína y la secreción de albúmina a través de ELISA.

Este protocolo se utilizó para diferenciar las células progenitoras hepáticas tanto de las células madre embrionarias humanas como de las células madre pluripotentes inducidas humanas. En el quinto día del protocolo de diferenciación, se evaluó la especificación definitiva del endodermo mediante la expresión de Sox 17. En ambas líneas celulares, Sox 17 se expresó altamente con 80 y 87,8% de células Sox 17 positivas para H9 y P106, respectivamente.

A los 10 días, los progenitores hepáticos mostraban una morfología similar a la de un adoquín. Además, se evaluó la especificación del progenitor hepático para la expresión de HNF4 alfa, AFP, albúmina y citoqueratina 19. Ambos cultivos progenitores hepáticos expresaron marcadores hepáticos fetales, como HNF4 alfa, AFP y CK 19.

La secreción de alfafetoproteína se detectó en el día 10 en ambas líneas celulares, mientras que la secreción de albúmina no se detectó con ELISA. La variabilidad del número celular y la eficiencia de la diferenciación de los progenitores hepáticos se evaluaron mediante la cuantificación de la expresión de HNF4 alfa. A los 10 días, los progenitores hepáticos no mostraron variabilidad significativa entre hileras con más del 95 y el 97% de células alfa positivas para HNF4 por pocillo para H9 y P106, respectivamente.

Una distribución celular uniforme antes del inicio de la diferenciación es clave para asegurar una población homogénea de células progenitoras hepáticas. Para lograr esto, balancee suavemente las placas de lado a lado y de adelante hacia atrás para asegurar una dispersión uniforme de las células. Las células progenitoras hepáticas producidas por este protocolo se pueden diferenciar aún más a las células similares a los hepatocitos para otros ensayos, lo que ofrece una herramienta reproducible y estandarizada para el modelado de enfermedades o el cribado de fármacos.