Name: Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a realizar un cribado genético directo en Arabidopsis utilizando aequorina como reportadora de calcio para identificar genes involucrados en la señalización del calcio. Este método permite estudiar respuestas de defensa en plantas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal - Phytotron Facility por el crecimiento de las plantas, Bombay Locale por la sesión de vídeo y el Departamento de Biotecnología- Consorcio eLibrary por proporcionar acceso a los recursos electrónicos. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología de la India a través del National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programa Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; y la Beca de Investigación CSIR-Junior (a D.M y S.M) y al Departamento de Biotecnología-Beca de Investigación Junior (a R.P).

1. Mutagénesis de EMS y colección de semillas única basadas en pedigrí (1-3 meses)
<ol><li>Pesar 150 mg de semillas (7500) de aequorin para EMS mutagénesis (semillas M0). Pesar otros 150 mg de semillas para ser utilizadas como control.</li>
	<li>Transfiera las semillas a un tubo de 50 ml y añada 25 ml de 0,2% emS (v/v) (CAUTION) (para tratamiento) o 25 ml de agua autoclavada (para control). NOTA: El sulfonato de etil-metano es un agente químico para mutagenizar el material vegetal.</li>
	<li>Selle el tubo con parafilm y envuélvalo en papel de aluminio. Gire el extremo final del tubo durante 18 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deje que las semillas se asienten. Retire la solución EMS cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos que contenga 1 M de NaOH en volúmenes iguales (NaOH ayuda a neutralizar/inactivar emS, lo que hace que sea seguro desechar). Deseche el material plástico usado en una solución NaOH de 1 M. NOTA: Después de 24 h, deseche los descartes de acuerdo con las prácticas de laboratorio de materiales peligrosos.</li>
	<li>Lavar bien las semillas mutagenizadas con 40 ml de agua autoclaveda al menos 8 veces. Deseche el SME que contenga agua en un contenedor de residuos NaOH como se mencionó anteriormente.</li>
	<li>Para el lavado final, añadir 40 ml de tiosulfato sódico de 100 mM y enjuagar 3 veces para eliminar los restos de EMS.</li>
	<li>Remoje las semillas en 40 ml de agua autoclavada durante 1 h para difundir EMS de las semillas y luego colóquelas en papel de filtro hasta que estén completamente secas.</li>
	<li>Transfiera las semillas a un tubo de microcentrífuga y estratifique las semillas a 4 oC en 40 ml de agua autoclavada durante 2-4 días. Esto ayuda a romper la latencia de las semillas y asegura un crecimiento homogéneo.</li>
	<li>Transfiera tanto las semillas mutagenizadas (M0) como las semillas de control al suelo (composición del suelo: agropetta: soilrite, 1:1) y transfieralas a salas de crecimiento con un fotoperiodo oscuro de 16 horas de luz/8 h, una intensidad de luz de 150émol-m-m-2y 70% de humedad relativa. </li>
	<li>Para determinar si la mutagénesis tuvo éxito, busque una velocidad de germinación reducida y crecimiento de plántulas, y la sectorización de la clorofila18 (Figura 1A). Compare las plantas mutagenizadas con las plantas de control para identificar estas diferencias fisiológicas y de desarrollo. NOTA: Se pueden utilizar diferentes métodos para la cosecha de semillas de plantas M1. En este protocolo, hemos utilizado el método de colección de semillas basado en pedigrí único. Cada planta M1 recibe un número único, comenzando desde A1 hasta A3500.</li>
	<li>Actualice plantas numeradas individualmente como líneas de planta discretas (Figura 1B).</li>
	<li>Tras la maduración, cosecha las semillas de estas plantas mutantes individuales y guárdalas como líneas M1 individuales(Figura 2). De la colección de semillas basada en pedigrí único, obtuvimos alrededor de 5000 M1 líneas de las cuales se proyectaron 3500 M1 líneas.</li>
</ol>2. Examen de alto rendimiento para seleccionar mutantes (8 meses)
<ol><li>Identifica mutantes novedosos basados en la respuesta de Ca2+ a un estímulo seleccionado. Aquí, usamos H2O2 como ejemplo.</li>
	<li>Para identificar mutantes, examina la generación M2. Dado que los mutantes recesivos se segregan a una frecuencia de 1/8 en la generación M2 tras la mutagénesis de EMS14, el cribado de 8-12 M2-plantas segregantes cubre una línea M1 e identifica un mutante recesivo homocigoto (usando 12 plántulas aumenta la probabilidad de encontrar un mutante). Desde cada línea M1 independiente, pruebe 12 M2 plántulas para la respuesta Ca2+ a H2O2 (12 M2 plántulas por línea M1).</li>
	<li>Utilice un protocolo de crecimiento de semillas hidropónicas de alto rendimiento y de crecimiento de plantas hidropónicas19. Colocar casi 12-15 M2 semillas por línea M1 en pozos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos y esterilizar utilizando gas cloro (40 ml de 12% hipoclorito de sodio y ácido clorhídrico, 3:1, v/v) en un desecador durante 4 h en una campana de humo. Después del procedimiento, abra el desecador y deje durante la noche para que el gas cloro se evapore.</li>
	<li>Después de la esterilización, lleve las placas al exterior y agregue medios líquidos de 1/2 MS (MS de media resistencia sin agar) a pozos individuales. Sellar las placas con parafilm y estratificar las semillas durante 2-4 días a 4oC y luego mover las semillas a una cámara de crecimiento con 10 h de luz / 14 h de fotoperiodo oscuro a 20-22 oC con 70% de humedad relativa.</li>
	<li>Una vez que las plántulas tienen 8-12 días de edad, coloque 12 M2 plántulas de cada línea individualmente en una placa luminómetro de 96 pozos. Para medir la respuesta Ca2+ a H2O2,utilice un lector de placas luminómetros.</li>
	<li>Después de la transferencia de plántulas, añadir 150 l de solución de coelentrazina de 5-10 m (diluida en agua autoclavizada a partir de un stock de 5 mM en metanol) (PRECAUC) en pozos individuales en un área oscura/baja luz y almacenar en la oscuridad a 21 oC durante 8 h. NOTA: Coelentrazina es un grupo protésico que se une a la apo-aequina y la reconstituye a la aequrina funcional. Coelentrazina es sensible a la luz y por lo tanto se almacena en botellas de color oscuro, protegido de la luz.</li>
	<li>Al día siguiente, realice la pantalla mutante usando 10 mM H2O2 como estímulo y mida la respuesta posterior de Ca2+. </li>
	<li>Para la medición simultánea de 24 pozos, cree un programa cinético automatizado que mida el fondo durante 1 min, seguido de la adición de estímulos (40 l) y la medición durante 10 min, seguido de la descarga total de aequorin (2 M CaCl2 en 150 l 20% etanol) durante 1-2 min. NOTA: Se necesita una descarga final para la aequorin total para cuantificar la Ca2+ medida y como control adicional para la aequrón funcional. La descarga final es una carrera corta de 1-2 min y no causa la muerte significativa de la planta. Alternativamente, si las plantas mueren después del paso de descarga, vuelva a examinar la línea M1 específica y rescate sin descarga. Estos mutantes se pueden confirmar en las generaciones M3 y M4 utilizando el paso de descarga.</li>
	<li>Utilice un método de escaneo de formato de 24 pozos que mida cada fila en un intervalo de 7 s con un tiempo de integración de 300 ms por pozo por punto de medición. Utilice una plántula de tipo salvaje como control en cada fila para la comparación y evaluación del mutante. NOTA: Una sola placa de 96 pozos que contiene plántulas M2 cubrirá 8 líneas M1 individuales (8 M1*12o 96 M2)y se puede proyectar en 2,5 h y cada día se proyectarán 32 líneas M1, 640 M1 plantas al mes. Todo el procedimiento de cribado después de que las plantas estén listas tomaría alrededor de 8 meses.</li>
	<li>Identificar mutantes en función de la pérdida o reducción de la respuesta de Ca2+ con H2O2. Rescata a los mutantes seleccionados a través de un proceso de lavado basado en antibióticos. Lavar la plántula con 25 mg/L de solución de cefotaxime dos veces y luego transferir a un medio de rescate que contenga 25 mg/L de cefotaxime en 1/2 MS de agar.</li>
	<li>Cultivar las placas a una luz de 10 h / 14 h fotoperiodo oscuro para obtener una planta mutante. El lavado de cefotaximo ayuda a eliminar cualquier microorganismo dañino en la plántula. Dado que las plántulas después de la reconstitución se mantienen sin sellar, minimice la contaminación al transferir de nuevo a una condición estéril.</li>
	<li>Transfiera la planta mutante al suelo para obtener la población homocigota M3.</li>
</ol>3. Análisis de datos e identificación mutante (1-3 meses)
NOTA: Las lecturas proporcionadas del método anterior se encuentran en unidades de luz relativa (RLU).
<ol><li>Para calcular la concentración de [Ca2+]cyt, utilice la siguiente ecuación de concentración20. pCa a 0.332588(-log (L/Lmax)) + 5.5593 Recuentos de luminiscencia () y recuentos restantes totales (máx.).</li>
	<li>Convierta los valores de pCa obtenidos en valoresde citt [Ca2+]en M multiplicando por 106. A continuación, trazar gráficamente contra un control de aequorin (Col-0 transgénico) para identificar mutantes putativos H2O2 a la respuesta ca2+. </li>
	<li>Las plántulas de rescate muestran una pérdida o una respuesta reducida a la aplicación H2O2 rescatada.</li>
	<li>Tras la maduración, cosecha semillas del mutante rescatado y vuelve a examinar para responder a H2O2 en plántulas M3. Si todas las plántulas de 12 M3 muestran una respuesta de Ca2+ similar a la planta madre, considere que la población es una población mutante homocigota M3. Si las 12 plántulas no muestran tal respuesta, entonces llévenlas a la generación M4 y vuelvan a examinar para obtener población homocigota.</li>
	<li>Una vez que se ha obtenido una línea vegetal homocigota, identifique el gen que conduce al fenotipo alterado utilizando la secuenciación de próxima generación.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+The+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: The lead currency of plant information processing.</a> The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Wasternack, C., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonates%3A+biosynthesis%2C+perception%2C+signal+transduction+and+action+in+plant+stress+response%2C+growth+and+development.+An+update+to+the+2007+review+in+Annals+of+Botany%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany.</a> Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).</li>
<li>Kiep, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cytosolic+Ca2%2B+elevation+is+activated+upon+wounding+and+herbivory+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+Luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>White, P. J., Broadley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Calcium in plants.</a> Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).</li>
<li>Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+impaired+in+intracellular+calcium+elevation+is+sensitive+to+biotic+and+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).</li>
<li>Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The language of calcium signaling.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).</li>
<li>Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+calcium+signalling+and+early+signalling+elements+during+defence+responses+to+microbe-+or+damage-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns.</a> The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).</li>
<li>Downie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals+in+plant+immunity%3A+a+spiky+issue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium signals in plant immunity: a spiky issue.</a> New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).</li>
<li>Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+interplay+of+Ca2%2B+and+ROS+signaling+in+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response.</a> Plant Science. 283, 343-354 (2019).</li>
<li>McAnish, M. R., Pittman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+calcium+signature%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Shaping the calcium signature.</a> New Phytologist. 181, 275-294 (2009).</li>
<li>Colbert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-throughput+screening+for+induced+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">High -throughput screening for induced point mutations.</a> Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).</li>
<li>Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoornneef%2C+M+%22Molecular+Plant+Biology%22">Molecular Plant Biology</a>. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).</li>
<li>Page, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+K+%22G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+in+Plants.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).</li>
<li>Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+aequorin+monitors+cytosolic+calcium+transients+in+soybean+cells+challenged+with+beta-glucan+or+chitin+elicitors%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors.</a> Planta. 207 (4), 566-574 (1999).</li>
<li>Arisha, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methane+sulfonate+induced+mutations+in+M2+generation+and+physiological+variations+in+M1+generation+of+peppers+%28Capsicum+annuum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.).</a> Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Rentel, M. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+calcium+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).</li>
<li>Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagenesis+of+seed+and+vegetatively+propagated+plants+using+EMS%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).</li>
<li>Espina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Phenotypic+Screening+of+an+Ethyl+Methane+Sulfonate+Mutant+Population+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetics+in+Arabidopsis%3A+Finding+Mutations+that+Cause+Particular+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).</li>
<li>Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaple%2C+J+%22Circadian+Rhythms.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology</a>. Rosato, E. , 362(2007).</li>
<li>Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQu%2C+LJ+%22Arabidopsis+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).</li>
<li>Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeyser%2C+HMO+%22Arabidopsis%3A+the+Complete+Guide+%28Electronic+v.+1.4%29%22">Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4)</a>. Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).</li>
<li>Pauly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+together+with+the+cytosol+generates+patterns+of+specific+cellular+calcium+signatures+in+tobacco+suspension+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells.</a> Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).</li>
<li>Mithöfer, A., Mazars, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+measurements+of+intracellular+Ca2%2B-signatures+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells.</a> Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).</li>
<li>Mehlmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signatures+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation.</a> The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).</li>
<li>Sello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Ca2%2B+fluxes+into+and+across+thylakoids+revealed+by+thylakoid-targeted+aequorin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes.</a> Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-localized+BICAT+proteins+shape+stromal+calcium+signals+and+are+required+for+efficient+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis.</a> New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+receptor+for+extracellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant receptor for extracellular ATP.</a> Science. 343 (6168), 290-294 (2014).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCA1+mediates+osmotic-stress-evoked+Ca2%2B+increases+vital+for+osmosensing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis.</a> Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

La mutagénesis del SME es una poderosa herramienta para generar mutaciones en la población. Las pantallas genéticas delanteras clásicas que utilizan EMS han sido una herramienta eficaz para identificar genes nuevos por dos razones principales: en primer lugar, no requieren ninguna suposición previa sobre la identidad génica y, en segundo lugar, no introducen ningún sesgo. Existen varios métodos para generar poblaciones de cribado como EMS, inserciones de ADN-T, radiaciones, etc. De todos los métodos, la mutagénesis basad...

Un cambio en la concentración de calcio citosólico (Ca2+)tras la percepción del estímulo biótico o abiótico es un evento de señalización temprana bien estudiado que activa muchas vías de señalización1,2,3,4. Una célula en su estado de reposo basal mantiene una menor concentración de Ca2+ en el citosol y secuestra el exceso de Ca2+ en varios orgánulos intracelulares y apoplasto extracelular que conduce a un pendiente de Ca2+ 5,,6. Tras la percepción de la señal, los niveles de Ca2+ aumentan en el citosol debido a una afluencia de Ca2+ de fuentes extracelulares y/o intracelulares y generan una firma de calcio específicade estímulos 7,8,9. Las elevaciones de Ca2+ en el citosol se activan por muchos estímulos, pero la especificidad se mantiene por diferentes almacenes liberando Ca2 +,una firma única de Ca2+ y proteínas de sensor apropiadas10,,11.
El uso de agente alquilante, sulfonato de etílico-metano (EMS) para la mutagénesis es una poderosa herramienta en las pantallas genéticas directas clásicas para identificar múltiples genes independientes implicados en un proceso. EMS es un mutágeno químico que induce predominantemente transiciones de C a T y G a A aleatoriamente en todo el genoma y produce un cambio de 1 bp en cada 125 kb del genoma. La mutagénesis de EMS inducirá cambios de par base única de 1000 euros, ya sea de inserción/eliminación (InDel) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) por genoma12. Las mutaciones inducidas por EMS son múltiples mutaciones puntuales con una frecuencia de mutación que oscila entre 1/300 y 1/30000 por locus. Esto reduce el número de plantas M1 necesarias para encontrar una mutación en un gen dado. Un rango de población de semillas M1 de 2000-3000 se utiliza típicamente para obtener mutaciones de interés en Arabidopsis thaliana13,14.
Las transgénicas de aequorin son las plantas ecotipos de Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) que expresan p35S-apoaequorin (pMAQ2) en el citosol15. La aequrina es una proteína de unión a Ca2+ compuesta de apoproteína y un grupo protésico formado por molécula de luciferina, coelenterazina. La unión de Ca2+ a aequorin, que tiene tres sitios DE-manos de unión Ca2+, da como resultado oxidado y ciclado de coelenterazina para dar el dioxetanono intermedio, seguido de un cambio conformacional de la proteína acompañado de la liberación de dióxido de carbono y coelenteramida singlete-excited16. La coelenteramida así producida emite unamaxluz azul (máx., 470 nm) que puede ser detectada por el luminómetro17. Por lo tanto, las elevaciones extremadamente rápidas de Ca2+ se pueden medir en tiempo real y explotarse para detectar pantallas genéticas de avance rápido. Este protocolo tiene como objetivo utilizar la especificidad de la respuesta al calcio para identificar a los nuevos actores clave que participan en la firma Ca2+. Para lograr esta tarea, utilizamos la mutagénesis ems en la aequorin transgénica e identificamos los SNP asociados con la señalización alterada de Ca2+. El protocolo identifica mutantes que no muestran elevaciones de Ca2+ o reducidas tras la adición de estímulos. Estos mutantes pueden ser mapeados para identificar los genes responsables de la respuesta de Ca2+. El método es aplicable a cualquier tipo de estímulo líquido en las plantas que resulta en una elevación de Ca2+. Dado que la elevación de Ca2+ es una de las primeras respuestas en la vía de señalización de defensa vegetal, la identificación de los componentes de respuesta aguas arriba puede proporcionar candidatos para la ingeniería genética para desarrollar plantas resistentes.

<table><tbody><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>para el cultivo de plántulas</td></tr><tr><td>cliniplate blanco de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>para mediciones de luminómetro</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>para el crecimiento de las plantas</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>para descarga solución</td></tr><tr><td>Celenterazina</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>grupo protésico para aequorina</td></tr><tr><td>Sultoneato de etilaminano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>para mutagénesis</td></tr><tr><td>de semillas Etanol</td><td>Reactivo analítico</td><td>1170</td><td>para solución de descarga</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>solución de esterilización</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>15465</td><td>como estímulo para la elevación del calcio</td></tr><tr><td>Ascenso de Luminoskan</td><td>Thermo Scientific</td><td>5300172</td><td>medición de luminiscencia de aequorin</td></tr><tr><td>Tampón MES</td><td>Himedia</td><td>RM1128-100G</td><td>crecimiento de plantas</td></tr><tr><td>Murashige y skoog media</td> Himedia <td>PT021-25L</td> crecimiento de <td>plantas</td><td>Hidróxido</td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>para neutralizar EMS</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>solución de esterilización</td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>para el lavado de semillas en el paso 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>para el crecimiento</td></tr><tr><td>de plantas macetas cuadradas</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>para el crecimiento de plantas</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>crecimiento de plantas</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem 7180720</td><td></td><td>para el rescate de plántulas</td></tr></tbody></table>

antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Las pruebas genéticas directas han sido herramientas importantes en la identificación imparcial de los componentes genéticos implicados en varias vías biológicas. La base de la pantalla es generar una población mutante que se puede examinar con un fenotipo de interés. El SME (sulfonato de metano etílico) es un agente alquilante comúnmente utilizado para inducir mutaciones aleatorias en una pantalla genética avanzada clásica para identificar múltiples genes implicados en cualquier proceso dado. La elevación del calcio citosólico (Ca2+)es una vía clave de señalización temprana que se activa tras la percepción del estrés. Sin embargo, la identidad de los receptores, canales, bombas y transportadores de Ca2+ sigue siendo esquiva en muchos sistemas de estudio. Aequorin es una proteína de reportero de calcio celular aislada de Aequorea victoria y expresada stably en Arabidopsis. Aprovechando esto, diseñamos una pantalla genética hacia adelante en la que el SME mutaba la aequorin transgénica. Las semillas de las plantas mutantes fueron recolectadas (M1) y la detección del fenotipo de interés se llevó a cabo en la población segregadora (M2). Usando un protocolo de medición Ca2+ de alto rendimiento de 96 pozos, se pueden identificar varios mutantes novedosos que tienen una respuesta de calcio variable y se miden en tiempo real. Los mutantes con el fenotipo de interés son rescatados y propagados hasta obtener una población de plantas mutantes homocigotas. Este protocolo proporciona un método para las pantallas genéticas directas en los antecedentes de los reporteros de Ca2+ e identificar nuevos objetivos regulados de Ca2+.

La población de EMS se hizo un anzado paralaelevación de Ca 2+ inducida por H 2 O2. 2+ Como se discutió anteriormente, 12 plántulas M2 individuales fueron examinadas desde cada línea M1. En la Figura 3,una de esas líneas M1 se traza con cada panel mostrando 12 plántulas M2 individuales. Una aequorin de tipo salvaje se utiliza como control para comparar y evaluar la respuesta mutante. Un mutante recesivo se separa en...

Una pantalla genética hacia adelante basada en la elevación de Ca2+ como lectura conduce a la identificación de los componentes genéticos involucrados en las vías de señalización dependientes del calcio en las plantas.

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

El objetivo de este protocolo es identificar un método que pueda utilizarse para identificar genes nuevos que intervienen en la señalización de calcio. Para ello, utilizamos la clásica pantalla genética directa. La señalización de calcio es una importante vía de respuesta de defensa en varios sistemas vegetales.Con el fin de identificar los genes involucrados en esta vía, hemos utilizado la clásica pantalla genética hacia adelante. En este método, EMS se utilizaría como un agente alquilante para introducir mutaciones aleatorias en los sistemas vegetales. La generación mutante desarrollada se puede utilizar para detectar un fenotipo de interés.Una vez identificado el fenotipo de interés, se puede mapear el gen causal. En este estudio, utilizamos la planta modelo Arabidopsis que tiene el reportero de calcio aequorin en su espectro. Pesar 150 mg de semillas de aequorin para la mutagénesis de EMS y otras semillas de 150 mg que se utilizarán como control.Transfiera las semillas a un tubo Falcon de 50 ml y añada 2%EMS o agua autoclavada. Durante el uso de EMS, tenga cuidado porque es cancerígeno. Se deben usar engranajes de protección durante el uso de EMS y se debe prevenir cualquier tipo de derrame.Selle los tubos Falcon con parafina y envuélvalo con papel de aluminio. Gire el extremo del tubo sobre el extremo durante 18 horas a temperatura ambiente. Deje que las semillas se asienten y retiren cuidadosamente la solución de EMS y deseche en un contenedor de residuos que contenga un NaOH molar.Lavar bien las semillas mutagenizadas con 40 ml de agua autoclaveda al menos ocho veces. Para el lavado final, agregue 100 tiosulfato sódico mili evolucionado y enjuague al menos tres veces para eliminar restos de EMS. Remoje las semillas en 40 ml de agua autoclavada durante una hora para difundir EMS fuera de las semillas y luego colocarlas en papel Whatman hasta que estén completamente secas.Transfiera las semillas a Eppendorf e incubar a cuatro grados Centígrados durante dos a cuatro días para la estratificación. Transfiera las semillas mutagenizadas y las semillas tratadas con agua al suelo y transfieralas a salas de crecimiento con 16 horas de luz y ocho horas de período de fotos oscuras a 22 grados centígrados y 70% de humedad relativa. Para determinar si la mutagénesis tuvo éxito, busque la sectoración de la clorofila.Hemos utilizado el método de recolección de semillas a base de pedigrí único y a cada planta M1 se le da un número único. Tras la maduración, las semillas se cosechan de estas plantas mutantes individuales y se almacenan como líneas M1 individuales. Se utiliza una esterilización de semillas de alto rendimiento y un protocolo de raíz de planta hidropónica, adaptado de Ranf et al.En el primer día, coloque casi 12 a 15 semillas M2 por M1 una línea en pozos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos y esterilice utilizando hipoclorito sódico y solución de ácido clorhídrico en una proporción de tres es a uno. Esto libera gas cloro que esteriliza las semillas. Deje la placa durante la noche para evaporar completamente el gas de cloro restante.Después de la esterilización, agregue medios de MS líquidos de media fuerza a los pozos individuales y estratifique las semillas durante dos a cuatro días a cuatro grados centígrados, y luego mueva las semillas a una cámara de crecimiento con un período fotográfico de 10 horas de luz y 14 horas de oscuridad a 22 grados Celsius, 70% de humedad relativa. El día 14, una vez que las plántulas tienen de ocho a 12 días, coloque las plántulas de 12 M2 de cada línea individualmente en una placa de luminómetro de 96 pozos. Después de la transferencia de plántulas, agregue 150 microlitros de cinco micromolares de solución de Coelenterazine en pozos individuales y guárdelo en la oscuridad a 21 grados centígrados durante ocho horas.Coelenterazine es un grupo protésico que se une a la apoaequrina para formar aequorin funcional. La coelenterazina es sensible a la luz y, por lo tanto, se almacena en botellas de color oscuro protegidas de la luz. Al día siguiente, los mutantes de la pantalla que usan peróxido de hidrógeno como estímulo y miden la elevación posterior del calcio.Para la medición simultánea de 24 pozos, se realiza un programa cinético automatizado, que incluye la medición del fondo durante un minuto, seguido de la adición de estímulo y la medición durante 10 minutos, seguido de la inyección de descarga 150 microlitro y la medición durante tres a cinco minutos. Y cualquier descarga para la hija aequorin se incluiría en la lectura para cuantificar el calcio medido y como control adicional para la aequorin funcional. Las lecturas proporcionadas del método anterior se encuentran en unidades de luz relativa.Para calcular la concentración citosólica de iones de calcio, se utiliza una ecuación de concentración previamente descrita dada por Rental y Knight en 2004, que se describe en el protocolo. Las RLU obtenidas a partir del luminómetro se añaden a la ecuación para calcular la concentración de iones de calcio. Los valores de iones de calcio citosólicos obtenidos se trazan gráficamente contra un control de tipo salvaje para identificar mutantes de peróxido de hidrógeno putativo en la respuesta al calcio.Este es un resultado representativo del protocolo mostrado. Hemos mostrado una línea M1 con 12 plántulas individuales que se han medido para la elevación de la concentración de iones de calcio. La línea verde en el gráfico indica aequorin de tipo salvaje que se midió junto con mutantes.El rojo es el promedio de todas las 12 plántulas, y la línea negra es plántulas M2 individuales medidas para la elevación de iones de calcio. Las plántulas que muestran una respuesta muy reducida a la aplicación de peróxido de hidrógeno son rescatadas. Los mutantes rescatados son reconfirmados en la próxima generación, seguidos de mapeo para identificar genes causales.Se debe tener precaución al usar EMS como mutágeno ya que es un carcinógeno. El engranaje de protección debe usarse en todo momento y cualquier derrame realizado debe tratarse con buenas prácticas de laboratorio. Además, al hacer una recolección de semillas a base de pedigrí, las plantas individuales deben ser cosechadas con el máximo cuidado para que no haya mezcla de ninguna semilla en ninguna etapa.Esto ayudará a uno a volver y rastrear la planta madre, que es la planta mutante homocigota. Además, dado que este método no introduce ningún sesgo ni ninguna suposición previa en el método de cribado, se puede utilizar para una o más condiciones para identificar un fenotipo de interés. Además, también se podrían identificar múltiples genes independientes utilizando el mismo protocolo.El protocolo es fácil de usar ya que con la pequeña dosis, un gran número de plantas pueden ser mutagenizadas. Estos enormes números de plantas mutantes se pueden utilizar para varias poblaciones y para varias condiciones e identificar varios genes. Una pérdida parcial de la función, una función alterada, una pérdida completa de la función, o también la función genética constitutiva se puede identificar a través de este método.La asignación debe ser una tarea fácil dado el avance en las tecnologías de mapeo en los escenarios actuales. Un sistema de mapeo basado en novo, una trama racial basada en SNP y muchos otros se pueden utilizar para identificar el gen causal que causa el fenotipo de interés. Dada la aplicabilidad de este método, se puede utilizar no sólo en las plantas modelo Arabidopsis, sino también en otras plantas modelo, siempre que se pueda establecer un fenotipo de lectura de interés.

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video presenta los conceptos detrás de las imágenes de calcio e incluye un protocolo de ejemplo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de gusanos contenidos en pocillos de agarosa moldeados.

Imágenes de calcio: un método para visualizar la actividad neuronal en C. elegans vivos

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y...

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de...

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

El presente protocolo describe el control totalmente óptico y la observación de la actividad celular desencadenada en cardiomiocitos derivados de iPSC (iPSC-CM) para la detección de fármacos de alto rendimiento y pruebas de toxicidad. Se muestra la cuantificación multiparamétrica de patrones fenotípicos en el tiempo y el espacio. Se demuestran los efectos a largo plazo de los medicamentos durante horas, o mediciones secuenciales durante días.

Control óptico de alto rendimiento y registro de la señal de calcio en cardiomiocitos derivados de iPSC para pruebas de toxicidad y detección fenotípica de fármacos

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Las prótesis de retina tienen la capacidad de generar percepciones visuales. Para avanzar en el desarrollo de nuevas prótesis, se necesitan métodos ex vivo para probar los dispositivos antes de su implantación. Este artículo proporciona un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina cuando se somete a estimulación eléctrica.

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Aprende a realizar un cribado genético directo en Arabidopsis utilizando aequorina como reportadora de calcio para identificar genes involucrados en la señalización del calcio. Este método permite estudiar respuestas de defensa en plantas.

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio (Video) | JoVE Journal

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Explorar más videos