Name: Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende a analizar el transporte de neurofilamentos en axones mielinizados de ratones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite medir la direccionalidad y velocidad del transporte axonal en tiempo real.

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Los autores desean agradecer a Paula Monsma por la instrucción y la asistencia con la microscopía confocal y la disección del nervio tibial y al Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger y Sana Chahande por su ayuda con la cría de ratones. Este trabajo fue apoyado en parte por la colaboración National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. y IOS1656765 a P.J., y los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud R01 NS038526, P30 NS104177 y S10 OD010383 a A.B. N.P.B. fueron apoyados por una beca del Programa de Becas Postdoctorales del Presidente de la Universidad Estatal de Ohio.

<ol><li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li>
<li>Brown, A. Slow Axonal Transport. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+A+%22Reference+Module+in+Biomedical+Sciences%22">Reference Module in Biomedical Sciences</a>. , (2014).</li>
<li>Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li>
<li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li>
<li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li>
<li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li>
<li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li>
<li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li>
<li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li>
<li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).</li>
<li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li>
<li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD%28P%29H+and+flavoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li>
<li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li>
<li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li>
<li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li>
<li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).</li>
<li>Cohen, J. The effect size index: d. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+Power+Analysis+for+the+Behavioral+Sciences+2nd+ed%22">Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed</a>. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li>
<li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+%22P301L%22+tau+knockin+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li>
<li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li>
<li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se debe tener cuidado en el análisis de los experimentos de fuga de pulsos y propagación de pulsos porque existe un potencial significativo para la introducción de errores durante el postprocesamiento, principalmente durante la corrección de campo plano, la alineación de la imagen y la corrección del lejía. La corrección de campo plano es necesaria para corregir la no uniformidad en la iluminación, lo que resulta en una caída de intensidad en todo el campo de visión desde el centro hasta la periferia. El grado de no unif...

El transporte axonal de neurofilamentos se demostró por primera vez en la década de 1970 mediante el etiquetado de pulsos radioisotópicos1. Este enfoque ha producido una gran cantidad de información sobre el transporte de neurofilamento in vivo,pero tiene una resolución espacial y temporal relativamente baja, típicamente en el orden de milímetros y días en el mejor2. Además, el etiquetado por pulsos radioisópicos es un enfoque indirecto que requiere la inyección y el sacrificio de múltiples animales para generar un solo curso de tiempo. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y los avances en la microscopía de fluorescencia en la década de 1990, posteriormente se hizo posible imaginar el transporte de neurofilamento directamente en las neuronas cultivadas en una escala de tiempo de segundos o minutos y con resolución espacial subcrómetro, lo que ofrece una visión mucho mayor del mecanismo de movimiento3. Estos estudios han revelado que los polímeros de neurofilamento en los axones se mueven rápida e intermitentemente en direcciones anterogradas y retrógradas a lo largo de las vías de los microtúbulos, propulsados por proteínas del motor de microtúbulos. Sin embargo, los neurofilamentos son estructuras limitadas por difracción de sólo 10 nm de diámetro que normalmente están espaciadas aparte de sus vecinos por sólo decenas de nanómetros; por lo tanto, los polímeros sólo pueden ser rastreados en neuronas cultivadas que contienen neurofilamentos escasamente distribuidos para que los polímeros en movimiento puedan ser resueltos de sus vecinos4. Por lo tanto, actualmente no es posible rastrear neurofilamentos individuales en axones que contienen abundantes polímeros de neurofilamento, como axones mielinados.
Para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones ricos en neurofilamento utilizando microscopía de fluorescencia, utilizamos un método de fotoactivación de fluorescencia de pulso-escape que desarrollamos para estudiar el comportamiento pausador a largo plazo de los neurofilamentos en las células nerviosas cultivadas4,,5. Los neurofilamentos etiquetados con una proteína de fusión de neurofilamento fluorescente fotoactivable se activan en un segmento corto de axón, y luego la velocidad de salida de esos filamentos de la región activada se cuantifica midiendo la descomposición de la fluorescencia con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que es un análisis a nivel de población del transporte de neurofilamento que se puede aplicar en una escala de tiempo de minutos u horas sin la necesidad de rastrear el movimiento de polímeros de neurofilamento individuales. Por ejemplo, hemos utilizado este método para analizar la cinética del transporte de neurofilamento en cultivos mielizantes6.
Recientemente, describimos el desarrollo de un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa bajos niveles de una proteína de neurofilamento etiquetada con paGFP M (paGFP-NFM) en las neuronas bajo el control del promotor Thy1 específico de la neurona humana7. Este ratón permite el análisis del transporte de neurofilamento in situ utilizando microscopía de fluorescencia. En este artículo, describimos los enfoques experimentales para analizar el transporte de neurofilamento en axones mielinados de nervios tibiales de estos ratones utilizando dos enfoques. El primero de estos enfoques es el método de escape de pulsos descrito anteriormente. Este método puede generar información sobre el comportamiento de pausa de los neurofilamentos, pero es ciego a la dirección en la que los filamentos salen de la región activada, y por lo tanto no permite la medición de la direccionalidad de la red y la velocidad de transporte8. El segundo de estos enfoques es un nuevo método de propagación de pulsos en el que analizamos no sólo la pérdida de fluorescencia de la región activada, sino también el aumento transitorio de la fluorescencia en dos ventanas de flanqueo a través de las cuales los filamentos fluorescentes se mueven a medida que salen de la región activada tanto en direcciones anterogradas como retrógradas. En ambos enfoques, se pueden obtener parámetros de transporte de neurofilamento como la velocidad media, la direccionalidad de la red y el comportamiento de pausa mediante el análisis matemático y el modelado de los cambios en la fluorescencia en las ventanas de medición. La Figura 3 ilustra estos dos enfoques.
Este protocolo demuestra la disección y preparación del nervio, la activación y la toma de imágenes de la fluorescencia paGFP, y la cuantificación del transporte de neurofilamento a partir de las imágenes adquiridas utilizando el paquete de distribución FIJI de ImageJ9. Usamos el nervio tibial porque es largo (varios cm) y no se ramifica; sin embargo, en principio cualquier nervio que exprese paGFP-NFM es apropiado para su uso con esta técnica si puede ser diseccionado y desenvado sin dañar los axones.

<table><tbody><tr><td>Junta rectangular de 14 x 22 0,1 mm</td> Junta <td>interior</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td></tr><tr><td>2-desoxi-D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Junta redonda con orificios</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>junta exterior</td>Plato de</tr><tr><td>35 x 10 mm</td><td>Platos de disección</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td></tr><tr><td>cubreobjetos redondos de 40 mm</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 60 ml - Punta Luer-lock</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD sistema confocal de discos</td> giratorios <td>Andor</td><td></td><td>equipado con sistemas Perfect Focus y FRAPPA</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>para solución de fluoresceína</td></tr><tr><td>portaobjetos D-(+)-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>pinza de punta fina</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de disección con cera</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>initial tijera de disección</td></tr><tr><td>FCS2 cámara de perfusión</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína sódica</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de solución en línea</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>pinza de laminectomía</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>pinza de disección inicial</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microacueducto</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>para portaobjetos de fluoresceína</td></tr><tr><td>inserto de platina para microscopio</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de calentamiento de objetivos</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch con collar de objetivo</td></tr><tr><td>Aceite de objetivo - tipo A</td><td>Nikon</td><td>descatalogado</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA objetivo</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodio iodoacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Sage Instruments Modelo</td><td>355</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de tubo - hembra</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Adaptador de tubo - macho</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo 1005012 Tygon</td><td>Bioptechs 1</td><td>/16" de diámetro interior, 1/32" de espesor de pared</td>Tijeras de resorte Vannas Tijeras finas Fine Science Tools 15018-10 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Los polímeros de proteína de neurofilamento se mueven a lo largo de los axones en el componente lento del transporte axonal a velocidades medias de 0,35-3,5 mm/día. Hasta hace poco el estudio de este movimiento in situ sólo era posible utilizando el etiquetado de pulsos radioisotópicos, lo que permite el análisis del transporte axonal en nervios enteros con una resolución temporal de días y una resolución espacial de milímetros. Para estudiar el transporte de neurofilamento in situ con mayor resolución temporal y espacial, desarrollamos un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa la proteína de neurofilament M etiquetada con GFP fotoactivable en las neuronas. Aquí describimos los métodos de fuga de pulsos y propagación de pulsos de fluorescencia para analizar el transporte de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios tibiales de estos ratones ex vivo. Los segmentos nerviosos aislados se mantienen en la etapa del microscopio por perfusión con solución salina oxigenada y se visualizan mediante microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio. La luz violeta se utiliza para activar la fluorescencia en una ventana axonal corta. La fluorescencia en las regiones activadas y flanqueantes se analiza a lo largo del tiempo, permitiendo el estudio del transporte de neurofilamento con resolución temporal y espacial en el orden de minutos y micras, respectivamente. El modelado matemático se puede utilizar para extraer parámetros cinéticos del transporte de neurofilamento, incluyendo la velocidad, el sesgo direccional y el comportamiento de pausa de los datos resultantes. Los métodos de escape de pulsos y propagación de pulsos también se pueden adaptar para visualizar el transporte de neurofilamento en otros nervios. Con el desarrollo de ratones transgénicos adicionales, estos métodos también podrían utilizarse para crear imágenes y analizar el transporte axonal de otras proteínas citoesqueléticas y citosólicas en axones.

La Figura 3 muestra imágenes representativas de experimentos de escape de pulsos y de propagación de pulsos. Hemos publicado varios estudios que describen los datos obtenidos utilizando el método de escape de pulsos y nuestros métodos para el análisis de esos datos5,6,7,8,17. A continuación, mostramos cómo los datos de propagación...

Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.

Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Este protocolo permite la toma de imágenes directas de la población de neurofilamento en axones mielinados de ratones juveniles o adultos utilizando microscopía de fluorescencia, lo que permite medir la direccionalidad y velocidad del transporte de neurofilamento en segmentos nerviosos aislados. Este método depende de la disponibilidad de ratones que expresen una fusión fluorescente fotoactivable de la proteína de interés, pero se puede adaptar para su uso en cualquier nervio fácilmente diseccionado. Para empezar, vierta la solución salina oxigenada en una jeringa de 60 mililitros y asegúrese de que quede un aire mínimo en la jeringa.Conecte la jeringa al tubo y, a continuación, coloque el tubo de salida en un matraz de residuos. Coloque la junta exterior en la carcasa de la cámara de perfusión, asegurándose de que los postes de entrada y salida de flujo estén alineados con los orificios de la junta, luego coloque la junta interior en un cubreobjetos circular número 1.5 y alisa cuidadosamente las arrugas en la junta para asegurar un sello hermético. Coloque el cubreobjetos y la junta en una toalla de papel o una toallita de tarea con la junta hacia arriba.Utilice un par de tijeras de disección grandes para hacer una incisión dorsal en la piel cerca de la mitad de la columna vertebral y continuar cortando alrededor del aspecto ventral del animal. Tire lentamente de la piel del músculo y corte la fascia. A continuación, usa tijeras de microdisección para hacer una incisión en los músculos del muslo a medio camino entre la cola y la rodilla para exponer el nervio ciático.Asegúrese de que el nervio, que es visible a través del músculo, no se corta. Extiende la incisión dorsal y ventralmente para eliminar el músculo, luego retira los músculos de la pantorrilla, manteniendo los cortes superficiales y cortos para evitar dañar los nervios. Continúe retirando los músculos hasta que el nervio tibial esté completamente expuesto desde el punto donde se ramifica desde el nervio ciático hasta el talón.Agarra el nervio tibial en el extremo proximal de la columna vertebral con un par de fórceps y córtalo con un par de tijeras de microdisección, asegurándote de no aplicar demasiada tensión al nervio. Levantar cuidadosamente del músculo y cortar cualquier accesorio, teniendo cuidado de no poner tensión en el nervio. Cortar el extremo distal de la columna vertebral del nervio tibial y transferirlo a un pequeño plato Petri de solución salina oxigenada a temperatura ambiente.A partir del extremo proximal del nervio, agarre suavemente los extremos del axón expuesto con un par de fórceps de punta muy fina. Con un segundo par de fórceps, agarre la vaina nerviosa de forma proximally y tire lentamente hacia el extremo distal del nervio asegurándose de que no se aplica ninguna tensión indebida durante este proceso. Sujete el extremo proximal del nervio y colóquelo lentamente sobre un cubreobjetos, luego enderecerlo bajo una tensión suave.Coloque el microaqueducto deslizar sobre el nervio con el deslizamiento ranurado hacia abajo y coloque la dirección del flujo paralela al nervio. Voltee el conjunto de cubreobjetos y microaqueductos y colóquelo en la carcasa de la cámara de perfusión con la corredera opuesta a la junta exterior. Para fijar la cámara de profusión, colóquela en la carcasa metálica y gire el anillo de bloqueo.Presione lentamente el émbolo de la jeringa salina y llene la cámara de perfusión. Mantenga el tubo de entrada y salida, el matraz de salida y la jeringa elevados por encima de la propia cámara en todo momento durante la configuración y la toma de imágenes. Transfiera el conjunto de profusión a una etapa de microscopio invertido y monte la jeringa salina en la bomba de la jeringa, luego encienda el motor y ajuste la velocidad para un caudal de 0,25 mililitros por minuto.Conecte el calentador de solución en línea y establézcalo en 37 grados Centígrados. Conecte el calentador objetivo y establézcalo en 37 grados Centígrados. Aplique aceite al objetivo e inserte la cámara de profusión en el soporte de la etapa.Aplique aceite a la almohadilla del calentador de la cámara y adjúntelo a la cámara de perfusión, luego conéctela y colóquela a 37 grados Centígrados. Bloquee la cámara de profusión en el adaptador de escenario y ponga el aceite objetivo en contacto con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara. Utilice la iluminación de Campo brillante para centrarse en la capa de axones en la superficie inferior del nervio más cercano a la superficie antideslizante.Los axones mielinados se pueden identificar por la presencia de una vaina de mielina que es visible bajo la iluminación de luz transmitida de Brightfield sin mejora de contraste. Adquiera una imagen de referencia de Brightfield, registrando la direccionalidad del nervio, luego adquiera una imagen confocal usando un láser de 488 nanómetros y un filtro de emisión apropiado para GFP fotoactivable. Establezca la potencia del láser en aproximadamente cinco veces la potencia normal de imagen y adquiera una imagen con un tiempo de exposición de tres a cuatro minutos, luego adquiera otra imagen confocal para registrar la autofluorescencia previa a la activación después del paso de blanqueo.Dibuje una línea paralela a los axones con una longitud igual al tamaño de ventana de activación deseado de la imagen de Brightfield. Usando esta línea como guía, dibuje una región rectangular de interés a través del campo de visión perpendicular a los axones. Active la fluorescencia GFP en esta región por excitación de patrón con la luz de 405 nanómetros, asegurándose de que una imagen se adquiere justo antes e inmediatamente después de la activación.Cuando finalice la activación, inicie un temporizador de un minuto. Cuando se apague, comience la adquisición de una serie timelapse. Añadir 250 miligramos de polvo de fluoresceína a 0,5 mililitros de agua doble destilada y mezclar hasta que no haya partículas visibles, a continuación, girar la solución durante 30 segundos en una centrífuga de mesa para sedimentar cualquier material no disuelto.Añadir ocho microlitros de solución de fluoresceína a una diapositiva y aplicar unuso de 1,5 cubreobjetos. Blot el exceso de líquido, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y deje que la diapositiva se seque. Coloque el lado del cubreobjetos deslizantes hacia abajo en la etapa del microscopio invertido y ajuste el enfoque en el plano delgado de la fluorescencia en la superficie del cubreobjetos.Mueva la diapositiva para encontrar un campo de visión que no contenga burbujas de aire ni partículas de fluoresceína grandes y adquiera una pila Z que abarque seis micrómetros a intervalos de 0,2 micrómetros de modo que la imagen central sea el plano de enfoque original. Cierre todas las persianas de trayectoria de luz, incluido el obturador de la cámara, y ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición a cero segundos. Adquiera una pila de 100 imágenes con estos ajustes, que se promediarán para generar la imagen de campo oscuro.Aquí se muestran imágenes representativas de experimentos de escape de pulsos y de propagación de pulsos. Para el método de escape de pulsos, la cinética de descomposición de fluorescencia en la región activada puede producir información sobre el comportamiento de pausa a largo y corto plazo. La región activada puede ser la abreviatura de estos experimentos.Una región activada más larga se utiliza para el método de propagación de pulsos con el fin de proporcionar una mayor piscina de neurofilamentos fluorescentes. Esto alarga el tiempo durante el cual el aumento de la fluorescencia en las regiones de flanqueo sigue siendo lineal. Aquí se utilizan 15 ventanas flanqueantes de 15 micrómetros.Se cuantificó la fluorescencia total de la ventana de medición. La descomposición es bifásica para el método de escape de pulsos con una descomposición exponencial inicial que representa la salida de neurofilamentos en pista y una segunda decadencia exponencial más lenta a los 10 a 20 minutos que representa la salida de filamentos fuera de pista. Para la estrategia de propagación de pulsos, los cálculos de la velocidad y la direccionalidad del movimiento dependen únicamente de los taludes en las ventanas de flanqueo.Para las longitudes de ventana utilizadas aquí, la fase lineal se extiende durante unos cinco minutos. Aquí se muestra un timelapse de un nervio inhibido glucolíticamente, lo que demuestra una aparente reducción en el transporte fuera de la región activada. De hecho, las pendientes distales y proximales son significativamente más bajas en los nervios tratados con inhibidores.También hay una disminución significativa en la velocidad de la población entre estas dos condiciones. Al intentar este protocolo, recuerde que es crucial apresurarse en la realización de las porciones de disección y montaje de la cámara a medida que la salud de los nervios disminuye después del sacrificio del animal. El cultivo celular neuronal puede permitir la medición y el análisis del movimiento de neurofilamentos individuales, lo que complementaría los datos de escala de población recopilados utilizando este protocolo.

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