Name: Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a abrir la barrera hematoencefálica en roedores mediante ultrasonido enfocado con neuronavegación estereotáctica. Este protocolo automatizado facilita la evaluación preclínica de fármacos para gliomas.

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Este proyecto fue financiado por el KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Damos las gracias a Ilya Skachkov y Charles Mougenot por sus aportaciones al desarrollo del sistema.

Todos los experimentos in vivo fueron aprobados por el comité ético holandés (número de permiso de licencia AVD114002017841) y el Organismo de Bienestar Animal de la Vrije Universiteit Amsterdam, Países Bajos. Los investigadores fueron entrenados en los fundamentos del sistema FUS con el fin de minimizar las molestias de los animales.
1. Sistema de ultrasonido enfocado
NOTA: La configuración descrita es un sistema de interrupción BBB construido en casa basado en componentes disponibles comercialmente e incluye un cono hecho a medida impreso en 3D y una plataforma estereotáctica desmontable. El sistema está diseñado de forma modular, lo que facilita las modificaciones según el equipamiento disponible y el uso específico. El protocolo describe el procedimiento para el sonoporation de un área más grande en la región del pontine del cerebro del ratón. Al ajustar la ubicación objetivo, se podrían atacar diferentes partes del cerebro. En este estudio se utilizó un transductor monoelemento de 1 MHz con una distancia focal de 75 mm, una apertura de 60 mm y un área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de presión pico). El plano focal del transductor se coloca a través del cráneo del animal en el plano horizontal que se cruza con las barras de los oídos.
<ol><li>Seleccione un transductor apropiado para la apertura de BBB en roedores. NOTA: Sobre la base de las propiedades de las microburbujas y la frecuencia empleada, los ajustes acústicos, en particular el índice mecánico (MI), están sujetos a cambios13,38.</li>
	<li>Coloque el transductor en el cono impreso en 3D.</li>
	<li>Emplear una membrana de mylar acústicamente transparente en el extremo inferior del cono para lograr el acoplamiento acústico de la ruta de propagación del haz, y llenar el cono con agua desgastada.</li>
	<li>Monte el transductor por encima del animal en una etapa lineal motorizada como se muestra en la Figura 1 permitiendo el posicionamiento vertical automático del transductor.</li>
	<li>Diseñar una plataforma estereotáctica desmontable basada en los requerimientos del estudio, que incluya calentamiento regulado por temperatura, mordeduras y barras auriculares, anestesia y marcadores fiduciales multimodales, como se muestra en las Figuras 1 y 2. El montaje de la plataforma estereotáctica consiste en un sistema de etapa lineal 2D, que permite el posicionamiento automático preciso (< 0,1 mm) del animal bajo la viga.</li>
	<li>Conecte el transductor a la cadena de emisión acústica que se muestra en la Figura 1 que consiste en un transductor, un generador de funciones y un amplificador de potencia.</li>
	<li>Diseñe una tubería de procesamiento de imágenes para detectar los marcadores fiduciales multimodales que permiten la focalización precisa de la sonoporación del área cerebral de interés y la recopilación de los datos de cavitación detectados por el hidrófono de la aguja.</li>
	<li>Calibrar el sistema y determinar el punto de enfoque del transductor en correspondencia con el posicionamiento vertical del animal en la plataforma estereotáctica.</li>
</ol>2. Preparación animal
NOTA: El siguiente protocolo se especifica para ratones, pero se puede adaptar para ratas. Para estos experimentos se utilizaron ratones desnudos atímicos femeninos Foxn1-/- (6-8 semanas de edad).
<ol><li>Deje que el animal se aclimate durante al menos una semana en la instalación animal y pesar al animal regularmente.</li>
	<li>Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) mediante inyección subcutánea (s.c.) 30 min antes del tratamiento con FUS para iniciar el tratamiento analgésico.</li>
	<li>Anestesiar al animal con isoflurano al 3%, 2 L/minO2 y verificar que el animal esté profundamente anestesiado. Mantenga a los animales anestesiados durante todo el procedimiento y controle la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca para ajustar la concentración de isoflurano según sea necesario.</li>
	<li>Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad de los ojos y evitar posibles lesiones.</li>
	<li>Retire el vello en la parte superior de la cabeza con una maquinilla de afeitar y crema depilatoria y lave después con agua para eliminar cualquier residuo y evitar la irritación de la piel.</li>
	<li>Para experimentos con modelos de tumores BLI, inyecte 150 μL de D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de insulina de 29 G para la guía de imágenes de BLI.</li>
	<li>Inserte un catéter de 26-30 G en la vena de la cola y enjuague el catéter y la vena con un pequeño volumen de solución de heparina (5 UI/mL). Llene el catéter con una solución de heparina para evitar la coagulación de la sangre. NOTA: Se observa un buen cateterismo cuando hay un reflujo de sangre en el catéter. Evite las burbujas de aire en el catéter para prevenir los émbolos. Para evitar una presión de inyección excesiva, asegúrese de que la longitud del catéter sea lo más corta posible.</li>
	<li>Coloque al animal en la plataforma estereotáctica regulada por temperatura para evitar la hipotermia. NOTA: La hipotermia reduce la circulación sanguínea, lo que puede afectar la inyección/circulación de microburbujas y la farmacocinética de los fármacos39.</li>
	<li>Inmovilizar y fijar la cabeza del animal en la plataforma estereotáctica usando barras para los oídos y una barra de mordida. Fijar el cuerpo con una correa y pegar la cola del animal a la plataforma.</li>
</ol>3. Ultrasonido enfocado guiado por imágenes in vivo
NOTA: Para este protocolo se utilizó un transductor monoelemento de 1 MHz con un pulso de ráfaga de tono con una duración de 10 ms, un MI de 0,4 y una frecuencia de repetición de pulsos de 1,6 Hz con 40 ciclos para 240 s. El protocolo está optimizado para microburbujas estabilizadas por fosfolípidos que contienen hexafluoruro de azufre (SF6)como gas inocuo, por lo que el diámetro medio de la burbuja es de 2,5 μm y más del 90% de las burbujas son inferiores a 8 μm.
<ol><li>Coloque la plataforma estereotáctica con el animal montado en la modalidad de imagen (porejemplo, BLI o rayos X) y tome imágenes del animal.</li>
	<li>Utilice los marcadores fiduciales multimodales en combinación con la tubería de procesamiento de imágenes para marcar la posición del animal de acuerdo con el punto de enfoque del transductor.</li>
	<li>Determinar el área objetivo colocando un contorno cerebral sobre la imagen de rayos X adquirida o utilizando imágenes BLI para determinar el centro del tumor (Figura 2). La posición de partes específicas del cerebro se especifican en el Paxinos Brain Atlas40 utilizando las marcas del cráneo bregma y lambda como puntos de referencia. Por ejemplo el puente de Varolio se encuentra x=-1.0, y=-0.8 y z=-4.5 de lambda.</li>
	<li>Proteja las fosas nasales y la boca del animal con cinta adhesiva para evitar que el gel de ultrasonido interfiera con la respiración.</li>
	<li>Aplique gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza del animal.</li>
	<li>Retraer la piel del cuello de los animales, lubricar el hidrófono de la aguja con gel de ultrasonido y colocar el hidrófono de la aguja en las inmediaciones del hueso occipital.</li>
	<li>Guíe el transductor a la posición correcta utilizando la tubería de procesamiento de imágenes y el punto de enfoque.</li>
	<li>Aplique la configuración preconfigurada a todos los dispositivos conectados y diríjase a la región cerebral de interés. NOTA: Dependiendo de la pregunta de investigación, las regiones tumorales o cerebrales pueden ser sonoporadas como un único punto focal o como forma volumétrica, como se muestra en la Figura 2.</li>
	<li>Active las microburbujas según lo descrito por el fabricante. Inyecte un bolo de 120 μL (5,4 μg) de microburbujas.</li>
	<li>Enjuague el catéter de la vena de la cola con solución salina para verificar la apertura del catéter.</li>
	<li>Inyecte las microburbujas e inicie la insonación.</li>
	<li>Registre la cavitación de microburbujas con el hidrófono de la aguja.</li>
	<li>Administrar un agente de contraste intravascular o fármaco después de la sonoporación. La dosis, el momento y la planificación dependen del propósito del estudio y del fármaco. NOTA: El azul de Evans es un agente de color común para evaluar la apertura de BBB41.</li>
	<li>Supervise al animal hasta el punto de tiempo predeterminado o antes del punto final humano.</li>
</ol>4. Análisis de cavitación de microburbujas
NOTA: Aquí se describe el procedimiento aplicado, quees adecuado para la experimentación in vivo para microburbujas de sf 6-fosfolípidos con un diámetro promedio de 2,5 μm (80% de las burbujas por debajo de 8 μm) excitado con un pulso de tono de ráfaga de 10 ms de duración a una frecuencia de 1 MHz, como se sugirió originalmente por McDannold et al.12.
<ol><li>Fourier-transforme la señal PCD grabada del dominio del tiempo en el dominio de la frecuencia.</li>
	<li>Integrar la potencia espectral resultante para la detección de cavitación estable alrededor del2º y3º armónico (± 50 kHz), como se muestra en la Figura 3 (caja verde a 2 y 3 MHz).</li>
	<li>Integrar la potencia espectral para la detección de cavitación inercial, entre la frecuencia principal, el2º,3º armónico, el1º y2º ultraarmónico y el primer sub-armónico (± 150 kHz), como se muestra en la Figura 3 (cajas rojas).</li>
	<li>Integrar la potencia espectral alrededor de la frecuencia principal (1 MHz ± 50 kHz) para la normalización de ambas señales PCD previamente obtenidas. NOTA: La señal PCD, para experimentos in vivo de microburbujas de fosfolípidos SF6a 1 MHz, no muestra ultraarmónicos o subarmónicos antes de que se establezca la cavitación inercial, como se muestra en la Figura 3.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, desarrollamos un sistema fus basado guiado imagen rentable para la interrupción transitoria de BBB para la entrega creciente de la droga en la parenquimia del cerebro. El sistema fue construido en gran parte con componentes disponibles comercialmente y en conjunto con rayos X y BLI. La modularidad del diseño propuesto permite el uso de varias modalidades de imágenes para la planificación y evaluación en flujos de trabajo de alto rendimiento. El sistema se puede combinar con modalidades de imágenes 3D de ...

La barrera hematoencefálica (BBB) es un obstáculo importante para la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. La mayoría de los fármacos terapéuticos que se han desarrollado no cruzan el BBB debido a sus parámetros fisicoquímicos (por ejemplo, lipofilia, peso molecular, aceptores de enlaces de hidrógeno y donantes) o no se retienen debido a su afinidad por los transportadores de eflujo en el cerebro1,2. El pequeño grupo de fármacos que pueden atravesar el BBB son típicamente pequeñas moléculas lipofílicas, que sólo son eficaces en un número limitado de enfermedades cerebrales1,2. Como consecuencia, para la mayoría de las enfermedades cerebrales, las opciones de tratamiento farmacológico son limitadas y se necesitan nuevas estrategias de administración de fármacos3,4.
El ultrasonido terapéutico es una técnica emergente que se puede utilizar para diferentes aplicaciones neurológicas como la interrupción de BBB (BBBD), la neuromodulación y la ablación4,5,6,7. Para lograr una apertura de BBB con un emisor de ultrasonido extracorpóreo a través del cráneo, el ultrasonido enfocado (FUS) se combina con microburbujas. Fus mediada por microburbujas resulta en un aumento de la biodisponibilidad de los fármacos en el parénquima cerebral5,8,9. En presencia de ondas sonoras, las microburbujas comienzan a oscilar iniciando la transcitosis y la interrupción de las uniones estrechas entre las células endoteliales del BBB, permitiendo el transporte paracelular de moléculas más grandes10. Estudios previos confirmaron la correlación entre la intensidad de la emisión acústica y el impacto biológico en la apertura BBB11,12,13,14. Fus en combinación con microburbujas ya se ha utilizado en ensayos clínicos para el tratamiento del glioblastoma utilizando temozolomida o doxorrubicina liposomal como agente quimioterapéutico, o para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica5,9,15,16.
Puesto que el ultrasonido medió los resultados de la abertura de BBB en las posibilidades enteramente nuevas para la farmacoterapia, la investigación preclínica para la traducción clínica es necesaria evaluar la respuesta de la terapia de candidatos seleccionados de la droga. Esto normalmente requiere un flujo de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial y preferiblemente una detección de cavitación integrada para la supervisión de la apertura BBB dirigida con una alta reproducibilidad. Si es posible, estos sistemas deben ser rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento para ser escalables de acuerdo con el tamaño del estudio. La mayoría de los sistemas fus preclínicos se combinan con mri para la imagen-dirección y la planificación del tratamiento15,17,18,19. Aunque la RMN proporciona información detallada sobre la anatomía y el volumen del tumor, es una técnica costosa, que generalmente es realizada por operadores capacitados /calificados. Además, la RMN de alta resolución puede no estar siempre disponible para los investigadores en instalaciones preclínicas y requiere largos tiempos de exploración por animal, lo que la hace menos adecuada para estudios farmacológicos de alto rendimiento. Cabe destacar que, para la investigación preclínica en el campo de la neurooncología, en particular los modelos tumorales infiltrativos, la posibilidad de visualizar y atacar el tumor es esencial para el éxito del tratamiento20. Actualmente, este requisito sólo se cumple por RMN o por tumores transducidos con una fotoproteína, lo que permite la visualización con imágenes de bioluminiscencia (BLI) en combinación con la administración del sustrato fotoproteico.
Los sistemas FUS guiados por RMN a menudo utilizan un baño de agua para asegurar la propagación de ondas de ultrasonido para aplicaciones transcraneales, mediante el cual la cabeza del animal está parcialmente sumergida en el agua, los llamados sistemas ''bottom-up''15,17,18. Si bien estos diseños funcionan generalmente bien en estudios con animales más pequeños, son un compromiso entre los tiempos de preparación de los animales, la portabilidad y los estándares higiénicos realistas y mantenibles durante el uso. Como alternativa a la RMN, otros métodos de guía para la navegación estereotáctica abarcan el uso de un atlas anatómico de roedores21,22, 23,avistamiento visual asistido por puntero láser24,dispositivo de escaneo mecánico asistido por agujero de alfiler25o BLI26. La mayoría de estos diseños son sistemas "de arriba hacia abajo" en los que el transductor se coloca en la parte superior de la cabeza del animal, con el animal en una posición natural. El flujo de trabajo ''de arriba hacia abajo'' consiste en un baño de agua22,25,26 o un cono lleno de agua21,24. La ventaja de usar un transductor dentro de un cono cerrado es la huella más compacta, el menor tiempo de configuración y las posibilidades de descontaminación directa que simplifican todo el flujo de trabajo.
La interacción del campo acústico con las microburbujas depende de la presión y va desde oscilaciones de baja amplitud (denominadas cavitación estable) hasta colapso transitorio de burbujas (denominada cavitación inercial)27,28. Existe un consenso establecido de que la ECOGRAFÍA-BBBD requiere una presión acústica muy por encima del umbral de cavitación estable para lograr una BBBD exitosa, pero por debajo del umbral de cavitación inercial, que generalmente se asocia con daño vascular/neuronal29. La forma más común de monitoreo y control es el análisis de la señal acústica (retro)dispersada utilizando la detección pasiva de cavitación (PCD), como sugieren McDannold et al.12. Pcd se basa en el análisis de los espectros de Fourier de señales de emisión de microburbujas, en el que la fuerza y la apariencia de los sellos de cavitación estables (armónicos, subharmonics y ultraharmonics) y los marcadores de cavitación inercial (respuesta de banda ancha) se pueden medir en tiempo real.
Un análisis pcd de "talla única" para un control preciso de la presión es complicado debido a la polidispersidad de la formulación de microburbujas (la amplitud de la oscilación depende fuertemente del diámetro de la burbuja), las diferencias en las propiedades de la cáscara de la burbuja entre las marcas y la oscilación acústica, que depende fuertemente de la frecuencia y la presión30,31,32. Como consecuencia, se han sugerido muchos protocolos diferentes de detección de PCD, que se han adaptado a combinaciones particulares de todos estos parámetros y se han utilizado en varios escenarios de aplicación (que van desde la experimentación in vitro sobre protocolos de pequeños animales hasta PCD para uso clínico) para la detección de cavitación robusta e incluso para el control de retroalimentación retroactiva de la presión11,14,30,31,32,33,34,35. El protocolo PCD empleado en el alcance de este estudio se deriva directamente de McDannold et al.12 y monitorea la emisión armónica para la presencia de cavitación estable y ruido de banda ancha para la detección de cavitación inercial.
Hemos desarrollado un sistema de FUS de neuronavegación guiada por imágenes para la apertura transitoria del BBB para aumentar la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. El sistema se basa en componentes disponibles comercialmente y se puede adaptar fácilmente a varias modalidades de imágenes diferentes, dependiendo de las técnicas de imagen disponibles en la instalación animal. Dado que requerimos un flujo de trabajo de alto rendimiento, hemos optado por utilizar rayos X y BLI para la orientación por imágenes y la planificación del tratamiento. Las células tumorales transducidas con una fotoproteína (por ejemplo, luciferasa) son adecuadas para la obtención de imágenesBLI 20. Después de la administración del sustrato de fotoproteínas, las células tumorales pueden ser monitoreadas in vivo y el crecimiento y la ubicación del tumor se pueden determinar20,36. BLI es una modalidad de imagen de bajo costo, permite seguir el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo, tiene tiempos de exploración rápidos y se correlaciona bien con el crecimiento tumoral medido con MRI36,37. Hemos optado por sustituir el baño de agua por un cono lleno de agua unido al transductor para permitir flexibilidad para mover libremente la plataforma sobre la que está montado el roedor8,24. El diseño se basa en una plataforma desmontable equipada con la integración de (I) plataforma estereotáctica de animales pequeños (II) marcadores fiduciales con rayos X y compatibilidad de imágenes ópticas (III) máscara de anestesia desmontable rápida, y (IV) sistema integrado de calentamiento de animales regulados por temperatura. Después de la inducción inicial de la anestesia, el animal se monta en una posición precisa en la plataforma donde permanece durante todo el procedimiento. En consecuencia, toda la plataforma pasa por todas las estaciones del flujo de trabajo de toda la intervención, manteniendo un posicionamiento preciso y reproducible y anestesia sostenida. El software de control permite la detección automática de los marcadores fiduciales y registra automáticamente todo tipo de imágenes y modalidades de imagen (es decir, micro-CT, rayos X, BLI e imágenes de fluorescencia) en el marco de referencia de la plataforma estereotáctica. Con la ayuda de un procedimiento de calibración automática, la distancia focal del transductor de ultrasonido se conoce con precisión dentro, lo que permite la fusión automática de la planificación intervencionista, la entrega acústica y el análisis de imágenes de seguimiento. Como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2,esta configuración proporciona un alto grado de flexibilidad para diseñar flujos de trabajo experimentales dedicados y permite el manejo intercalado del animal en diferentes estaciones, lo que a su vez facilita los experimentos de alto rendimiento. Hemos utilizado esta técnica para la entrega acertada de la droga en xenografts del ratón de la glioma de alto grado tal como glioma difuso del midline.

<table><tbody><tr><td>Jeringa Luer-lock de 1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>Aguja 19 G</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 23 G</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>3M Cinta quirúrgica Transpore</td><td>Ciencia aplicada a</td><td>la vida 7000032707</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Generador de formas de onda arbitrarias</td><td>Siglent</td><td>n.a.SDG1025</td><td>, 25 MHz, 125 Msa/s</td></tr><tr><td>Stereotact automatizado</td><td>de fabricación propia</td><td>n.a.Stereotact</td> <td>con todos los elementos de fabricación propia</td></tr><tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.Incluye</td> <td>software</td></tr><tr><td>Solución de NaCl tamponada</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina</td><td>Indivior UK limitado</td><td>n.a.0.324</td> <td>mg</td></tr><tr><td>Enriquecimiento de la jaula: pulpa de papel hogar inteligente</td> Bio <td>servicios</td><td>n.a.Filtro</td><td></td></tr> de <tr><td>carbón</td><td>Bickford</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>Cuchara de cerámica</td><td>n.a</td><td>n.a.Hisopos</td><td></td></tr> <tr><td>de algodón</td><td>n.a.n.a.D-luciferina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, sal de potasio</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VUmc farmacia</td><td>n.a.70</td><td>%</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.NaCl</td> <td>0.9 %, 1000 mL</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>n.a.Histoacryl</td> <td>0.5 mL</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.Jeringa</td><td></td> de</tr> <tr><td>insulina</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0.5 mL y 0.3 mL</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Alfasan</td><td>n.a.10</td> <td>%, 10 mL</td></tr><tr><td>Alimento para ratones: Teklad global 18% proteína dieta para roedores</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Catéter de neoflón</td><td>Becton Dickinson</td><td>391349</td><td>26 GA 0,6 x 19 mm</td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Keysight technologies</td><td>n.a.InfiniiVision</td> <td>DSOX024A</td></tr><tr><td>Tubos de plástico</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Amplificador de potencia</td><td>Electrónica & Innovation Ltd</td><td>210L</td><td>Modelo 210L</td></tr><tr><td>Preamplificador Acoplador de CC</td><td>Precision Acoustics</td><td>n..</td><td>Número de serie: DCPS94</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Sedazine</td><td>AST Farma</td><td>n.a.2</td><td>%</td></tr><tr><td>SonoVue microburbujas</td><td>Bracco</td><td>n.a.8</td> <td>& l/ml</td></tr><tr><td>Agua estéril</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.1000</td> <td>mL</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>n.a.n.a.se</td><td></td> <td>pueden utilizar varias jeringas</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK limitado</td><td>n.a.3</td> <td>mg/ml</td></tr><tr><td>Transductor</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.1</td> <td>MHz</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido</td><td>Laboratorios Parker Inc.</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic gel</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.a.10</td> <td>g</td></tr></tbody></table>

un alto rendimiento de imagen guiada por neuronavegación estereotáctica y sistema de ultrasonido enfocado para la apertura de la barrera hematoencefálica en roedores

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

La barrera hematoencefálica (BBB) ha sido un obstáculo importante para el tratamiento de diversas enfermedades cerebrales. Las células endoteliales, conectadas por uniones estrechas, forman una barrera fisiológica que impide que moléculas grandes (>500 Da) entren en el tejido cerebral. El ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS) se puede utilizar para inducir una apertura local transitoria de BBB, permitiendo que fármacos más grandes entren en el parénquima cerebral.
Además de los dispositivos clínicos a gran escala para la traducción clínica, la investigación preclínica para la evaluación de la respuesta a la terapia de los candidatos a fármacos requiere configuraciones de ultrasonido de animales pequeños dedicados para la apertura de BBB dirigida. Preferiblemente, estos sistemas permiten flujos de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial, así como monitoreo de cavitación integrado, al tiempo que siguen siendo rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento.
Aquí, presentamos un sistema FUS de animales pequeños estereotáctico guiado por bioluminiscencia y rayos X que se basa en componentes disponibles comercialmente y cumple con los requisitos mencionados anteriormente. Se ha hecho especial hincapié en un alto grado de automatización que facilita los desafíos que suelen encontrarse en los estudios preclínicos de alto volumen de evaluación de fármacos. Ejemplos de estos desafíos son la necesidad de estandarización para garantizar la reproducibilidad de los datos, reducir la variabilidad dentro del grupo, reducir el tamaño de la muestra y, por lo tanto, cumplir con los requisitos éticos y disminuir la carga de trabajo innecesaria. El sistema BBB propuesto se ha validado en el alcance de los ensayos de administración de fármacos facilitados por la apertura de BBB en modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de glioblastoma multiforme y glioma difuso de línea media.

El sistema FUS descrito(Figura 1 y Figura 2)y el flujo de trabajo asociado se han utilizado en más de 100 animales y han producido datos reproducibles en ratones sanos y osos. Sobre la base de la cavitación registrada y la densidad espectral en los armónicos en el momento pico de la inyección en bolo de microburbujas, la potencia espectral de cada frecuencia se puede calcular utilizando el análisis de Fourier como se explica en el paso 4 del Protocolo. Basado en...

La barrera hematoencefálica (BBB) se puede interrumpir temporalmente con ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS). Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la apertura de BBB de alto rendimiento in vivo utilizando un sistema FUS modular accesible para expertos que no son de ultrasonido.

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Los gliomas de alto grado, como el glioma pontino intrínseco difuso, son tumores altamente invasivos con una alta mortalidad. A pesar de años de extensa investigación, la barrera hematoencefálica es un aspecto importante porque la quimioterapia no puede llegar eficazmente al cerebro. Afortunadamente, el ultrasonido focalizado es capaz de abrir temporal y localmente la barrera hematoencefálica para tratamientos efectivos.Desarrollamos un sistema de ultrasonido focalizado neuronavegado pequeño y rentable para la interrupción de la barrera hematoencefálica. Este sistema está construido con componentes disponibles en el mercado y con un alto grado de automatización, permite la realización de estudios preclínicos de evaluación de fármacos. La medicina de precisión se define como el fármaco adecuado en la dosis adecuada para el paciente adecuado en el momento adecuado.Para lograr esto, muchos medicamentos preseleccionados deben ser examinados. Nuestro sistema compacto de ultrasonido focalizado de alto rendimiento para la interrupción de la barrera hematoencefálica nos permite hacer precisamente eso. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Rianne Haumann y Elvin t Hart, dos estudiantes de doctorado de mi grupo de investigación.El flujo de trabajo para la ecografía estereotáctica focalizada en la neuronavegación guiada por imágenes incluye la obtención de imágenes intervencionistas y el acoplamiento acústico para la sonoporación en la plataforma de ecografía. Posteriormente, se pueden realizar imágenes de seguimiento. Seleccione un transductor adecuado en función de los requisitos del experimento diseñado.Colócalo en un cono impreso en 3D lleno de agua desgasificada y cerrado en la parte inferior con una membrana de Mylar acústicamente transparente. Conecte el transductor a un generador de funciones y a un amplificador de potencia. Monte el transductor en una platina lineal motorizada para el posicionamiento vertical automático y conéctelo al amplificador de potencia.Utilice una plataforma estereotáctica desmontable que incluya calefacción con temperatura regulada, barras de mordida y orejas, anestesia y marcadores fiduciales multimodales. Fije la plataforma a la platina lineal 2D. Antes de que se pueda utilizar el sistema FUS, calícelo y determine el punto de enfoque del transductor.El punto de enfoque corresponde a la posición vertical del animal en la plataforma estereotáctica. Aclimatar al animal a las instalaciones durante al menos una semana después de su llegada y péselo regularmente. El día del experimento, administre buprenorfina a través de una inyección subcutánea 30 minutos antes del tratamiento con FUS.Después de anestesiar al ratón, aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular. Si es necesario, retire el pelo de la parte superior de la cabeza del animal con una navaja y crema depilatoria. Lave la piel con agua para eliminar cualquier residuo.Para experimentos con modelos tumorales BLI, inyecte 150 microlitros de D-luciferina por vía intraperitoneal con una jeringa de insulina de calibre 29. Para la administración de microburbujas para la apertura de BBB, inserte un catéter de vena de cola de calibre 26 a 30 y enjuague la vena con un pequeño volumen de solución de heparina. Asegure el catéter con cinta de tejido para evitar que se desprenda.Si el cateterismo es exitoso, llene el catéter con la solución de heparina para evitar la coagulación de la sangre. Coloque al animal en la plataforma estereotáctica con temperatura regulada para evitar la hipotermia. Fije la cabeza del animal con una barra de mordida y barras para las orejas y pegue la cola y el catéter a la plataforma.Fija el cuerpo del ratón con una correa. Coloque la plataforma estereotáctica con el ratón montado en la modalidad de imagen y tome imágenes del animal. Determine si el animal está colocado correctamente en la plataforma.Marque la posición del animal utilizando los marcadores de referencia multimodales en combinación con la tubería de procesamiento de imágenes de acuerdo con el punto de enfoque del transductor. Determine el área objetivo colocando un contorno cerebral sobre la imagen de rayos X adquirida o usando imágenes BLI para determinar el centro del tumor. Antes de colocar el transductor, proteja las fosas nasales y la boca del animal con cinta adhesiva para evitar que el gel de ultrasonido interfiera con la respiración.Aplique gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza del ratón para una correcta conducción del sonido. Registre la cavitación de microburbujas con el hidrófono de aguja, que se coloca en las proximidades directas del hueso occipital. En función de los valores de calibración, guíe el transductor a la posición correcta por encima del animal.Aplique ajustes preconfigurados a todos los dispositivos conectados para dirigirse a la región cerebral de interés. Después de colocar el transductor en la posición correcta, disuelva y active las microburbujas como lo describe el fabricante. Antes de la inyección de microburbujas, enjuague el catéter de la vena de la cola con solución salina para confirmar el acceso a la vena de la cola.Iniciar la trayectoria de insonicación e inyectar simultáneamente las microburbujas. Al mismo tiempo, el hidrófono de aguja detectará y verificará la cavitación de microburbujas en tiempo real. Si lo desea, administre un agente de contraste intravascular o fármaco después de la sonoporación.Monitoree al animal hasta un punto de tiempo predeterminado. La presión acústica con un índice mecánico de 0,4 en combinación con microburbujas proporcionó un medio muy sensible y fiable para la detección de cavitación estable en comparación con la ausencia de detección de subarmónicos cuando no se inyectaron microburbujas o la observación de cavitación inercial cuando se aplicó un IM de 0,6. Mientras que la presión acústica con un IM de hasta 0,6 no produjo daño macroscópico, el daño microscópico se evidenció histológicamente con un IM de 0,6.Una amplitud de presión con un IM de 0,8 dio lugar a una hemorragia cerebral macroscópica de vasos más grandes y a una lisis tisular generalizada con extravasación de eritrocitos. Se inyectó azul de Evans por vía intravenosa para validar la apertura de la BHE en la región pontina. Se observó extravasación de albúmina conjugada con azul de Evans a nivel de la protuberancia y el cerebelo en el ratón tratado con FUS y microburbujas, lo que demuestra una orientación precisa de la región de interés.Los pasos más importantes de este protocolo son la correcta colocación del catéter de la vena de la cola, el posicionamiento y la focalización del animal, y la inyección de microburbujas con ultrasonido focalizado con detección de cavitación. Este sistema de ultrasonido focalizado de fabricación propia puede adaptarse y rediseñarse para múltiples preguntas de investigación, a la vez que es rentable y tiene un flujo de trabajo automatizado, lo que lo hace adecuado para investigadores relativamente inexpertos.

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Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores (Video) | JoVE Journal

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

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