Name: Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a cuantificar metástasis pulmonares mediante inyección en vena de la cola y análisis digital de imágenes en ratones. Este método eficiente y reproducible facilita el estudio de la carga tumoral metastásica en investigación oncológica.

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Los datos representativos se financiaron a través del Instituto Nacional del Cáncer (K22CA218549 a S.T.S). Además de su asistencia en el desarrollo del método de análisis integral que se informa en este documento, agradecemos a The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) por los servicios de histología e inmunohistoquímica y al Pathology Imaging Core por el desarrollo y análisis de algoritmos.

El uso de animales siguió las regulaciones de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad (ULAR) bajo el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de OSU 2007A0120-R4 (PI: Dra. Gina Sizemore).
1. Inyección de células de cáncer de mama en la vena de la cola
<ol><li>Preparación de células y jeringa para inyección<ol>
<li>Placa un número apropiado de células en función del número de ratones y la concentración de células que se utilizará. NOTA: El número de células inyectadas y el tiempo hasta el desarrollo de metástasis dependerá de la línea celular utilizada y deberá optimizarse. En esta demostración, 1 x 106 células MDA-MB-231 se inyectan por vía intravenosa en ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), y se observan lesiones pulmonares macroscópicas a más tardar 24 días después de la inyección. Para la línea celular tumoral mamaria murina MVT117, se inyectan 3 x 106 células en ratones FVB/N inmunocompetentes con numerosas metástasis pulmonares observadas a los 14 días22,23.</li>
		<li>Aspirar medios y enjuagar placas celulares con 1x PBS. Tripsinizar las células en un volumen mínimo, agregar el volumen apropiado de medios y contar las células utilizando un hematocitómetro u otro método preferido. El azul de tripano (0,4%) u otros colorantes de células vivas / muertas se pueden usar para determinar recuentos de células viables.</li>
		<li>Células de pellets girando a 180 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspender el número apropiado de células en 1x PBS estéril de tal manera que se inyecte un volumen de 100 μL por ratón. Mantenga la suspensión celular en hielo para mantener la viabilidad.</li>
		<li>Antes de la inyección, resuspenda completamente las células con una pipeta de 200 μL o 1 ml para evitar la aglomeración. Extraiga 100 μL en una jeringa de insulina de 28 G (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Elimine las burbujas de aire manteniendo la jeringa vertical, golpeando la jeringa y ajustando lentamente el émbolo. Es probable que la inyección de burbujas de aire en la vena cause una embolia de aire / gas que puede ser fatal.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección lateral de la vena de la cola NOTA: Para los ensayos experimentales de metástasis de cáncer de mama, las inyecciones se realizan en ratones hembra de > 6 semanas de edad.<ol>
<li>Manipule el ratón por la cola y deslice al animal en un tubo ranurado / dispositivo de sujeción de un tamaño apropiado (consulte la Tabla de materiales para el dispositivo de sujeción utilizado).</li>
		<li>Inserte la parte del tapón del dispositivo de sujeción y coloque el mouse de lado de modo que su vena de la cola lateral sea fácil de ver. El ratón tiene una arteria ventral en línea con los genitales, una vena dorsal y dos venas caudales laterales.</li>
		<li>Limpie la superficie de la cola del ratón con una toallita aséptica. Agarre la cola entre el dedo índice y el pulgar con la mano no dominante y aplique una ligera tensión.</li>
		<li>Comenzando en la porción distal de la cola, inserte la aguja paralela a la vena con el bisel terminado.</li>
		<li>Si está permitido, vuelva a tapar cuidadosamente la aguja y doblar a un ángulo de 20-30 °. Se recomienda encarecidamente un enfoque con una sola mano o un dispositivo de recapitulación con aguja. NOTA: No es necesario aspirar, ya que esto puede hacer que la vena colapse. Sin embargo, se puede ver un pequeño destello de sangre cuando se coloca por primera vez. La aguja avanzará suavemente hacia la vena con la colocación adecuada.</li>
		<li>Dispense lentamente el volumen completo en la vena. No debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo.</li>
		<li>Si se siente alguna resistencia, retire inmediatamente la aguja de la jeringa. Si es necesario, vuelva a insertar la aguja (idealmente no más de 3 intentos) moviéndose hacia el extremo proximal de la cola o la vena lateral opuesta.</li>
		<li>Es probable que un pequeño volumen de sangre se desplace después de la inyección. Aplique una presión suave con una gasa estéril y limpie con una toallita aséptica.</li>
		<li>Deseche rápidamente la jeringa en un recipiente apropiado para objetos punzantes.</li>
		<li>Devuelva el ratón a una jaula limpia y ventilada y monitoree los signos de angustia.</li>
		<li>Monitoree a los ratones 2-3 veces por semana para detectar signos de formación de metástasis (dificultad para respirar, postura encorvada, pérdida de peso) y angustia general. El tiempo hasta el desarrollo de la metástasis dependerá de la línea celular y la tensión del ratón.</li>
		<li>Si se utiliza un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, tome imágenes de ratones inmediatamente después de la inyección de la vena de la cola para confirmar la inyección exitosa de células y obtener datos de tiempo "cero" (los detalles específicos sobre las imágenes de bioluminiscencia in vivo no se incluyen aquí, pero se describen por Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fijación del tejido pulmonar y análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica
<ol><li>Inflado del tejido pulmonar para mantener el formato estructural de los pulmones para la histopatología<ol>
<li>Después de seguir los procedimientos de eutanasia aprobados (por ejemplo, dióxido de carbono al 30 - 70% de desplazamiento del volumen de la cámara / min), asegure la carcasa del ratón a una placa de disección con alfileres. Rocíe o aplique etanol al 70% para mantener el pelaje del ratón fuera del camino durante la disección. NOTA: La asfixia por dióxido de carbono puede causar hemorragia pulmonar como una lesión de fondo esperada, especialmente a velocidades de flujo más lentas.</li>
		<li>Abra el tórax con una incisión en la línea media, extienda la incisión cranealmente / caudalmente a través del peritoneo y corte el diafragma agarrando el proceso xifoideo.</li>
		<li>Usando un juego separado de tijeras para no opacar las cuchillas, corte las costillas a lo largo de cada lado del esternón y retire cuidadosamente la caja torácica dejando espacio para que los pulmones se expandan.</li>
		<li>Aislar la tráquea mediante la extirpación de las glándulas salivales submandibulares y la musculatura infrahioidea. Colocar alfileres a cada lado de la tráquea puede evitar el movimiento no deseado durante la inserción de la aguja.</li>
		<li>Llene una jeringa de 26 G con 2-3 ml de formalina tamponada neutra al 10% e insértela en la tráquea.</li>
		<li>Inyecte lentamente formalina y observe si los pulmones se expanden (generalmente requiere ~ 1.5 ml de formalina).</li>
		<li>Una vez que la formalina comienza a filtrarse de los pulmones (evite el inflado excesivo), pellizque la tráquea con un par de fórceps, retire la aguja de la jeringa y desprenda todo el aparato respiratorio. Coloque los pulmones, el corazón, etc. directamente en la formalina, ya que se puede realizar un recorte adicional del tejido después de la fijación.</li>
		<li>Procesamiento completo, incrustación, seccionamiento de tejido y tinción de hematoxilina y eosina (H&E) utilizando métodos estándar.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica<ol>
<li>Escanee las secciones pulmonares teñidas con H&E en un escáner deslizante de alta resolución con un aumento de 40x (Figura 3).</li>
		<li>Importe imágenes en software de análisis de imágenes (por ejemplo, Visiopharm Image Analysis) para la cuantificación de metástasis pulmonares. NOTA: Recomendamos que los nuevos usuarios obtengan capacitación in situ o en línea para usar el software de análisis de imágenes. Numerosos seminarios web también están disponibles a través de la página web comercial.</li>
		<li>Seleccione la aplicación Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis de la biblioteca de aplicaciones del software. NOTA: El propósito de esta aplicación es etiquetar y cuantificar la metástasis pulmonar en diapositivas teñidas de H&E. Como parte de la aplicación 10118 H&E Lung Metastasis, el primer paso de procesamiento de imágenes segmenta el tejido pulmonar con la aplicación de detección de tejidos. El segundo paso de procesamiento de imágenes utiliza la aplicación Metastasis Detect que identifica las metástasis dentro del tejido pulmonar. Las metástasis se identifican a través de la forma junto con regiones que están demasiado deformadas, demasiado rojas o demasiado escasas para ser identificadas como metástasis.</li>
		<li>Ajuste los parámetros que definen la forma y la dispersión para que se ajusten mejor a las imágenes representativas. Las áreas segmentadas de metástasis tumorales y tejido pulmonar normal se pueden mostrar utilizando etiquetas de diferentes colores para cada tipo de tejido. Nota : en el caso de que la aplicación no pueda separar con precisión las metástasis del tejido pulmonar normal, es posible que sea necesario escribir una aplicación personalizada que use el programa Bosque de decisión de Visiopharm como se hizo para los experimentos (consulte la Figura 2 y la Figura 3). Los detalles para escribir un algoritmo personalizado siguen a continuación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2.9.</li>
		<li>Abra el programa Decision Forest, que funciona entrenando múltiples clases [es decir, tejido pulmonar (no neoplásico), metástasis, glóbulos rojos, epitelio y / o espacio en blanco] en una imagen deseada. En la Figura 2, las metástasis tumorales son azules, el tejido normal es verde y el epitelio bronquiolar es amarillo. Además, los glóbulos rojos están en rojo y los espacios de aire en rosa.</li>
		<li>Siga la serie de preguntas de sí o no que se le indique para entrenar adecuadamente a cada clase para una imagen. La precisión del algoritmo determinará el número de preguntas sí/no. Para el análisis, el algoritmo / aplicación personalizado se escribió con una precisión establecida en 50 (rango 0-100).</li>
		<li>Ajuste las características de cada clase aplicando filtros para enfocar, desenfocar, ordenar por forma, etc. para mejorar la precisión del algoritmo/aplicación. Visiopharm ve cada clase a través de uno o varios objetivos conocidos como características. Las características cambian la forma en que la clase ve la imagen para resaltar ciertos colores o intensidades. NOTA: Para el algoritmo personalizado, las metástasis que miden 8500 μm2 y superiores se etiquetan y miden como metástasis. Esto explica la varianza de tamaño y las metástasis demasiado pequeñas para detectarlas. En la cuantificación normal de tejidos se incluyeron pequeñas áreas mal formadas y pequeñas áreas metastásicas inferiores a 8500 μm2 .</li>
		<li>Guarde la configuración modificada de la aplicación o del algoritmo personalizado y, a continuación, aplique el algoritmo/aplicación a un conjunto completo o serie de tejidos teñidos con H&E.</li>
		<li>Por último, exporte todas las variables de salida, que incluyen las enumeradas en la Tabla 1. El área en micras al cuadrado (μm2) se puede cuantificar para cada tipo de tejido y los porcentajes se derivan del área neta total de tejido de la muestra (es decir, el tejido total menos el espacio de aire).</li>
		<li>Al crear un algoritmo personalizado, revise las marcas de tejido en consulta con un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios para garantizar mediciones precisas y diferenciar entre los tipos de tejidos.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A medida que los investigadores continúan utilizando la inyección intravenosa de células tumorales como modelo experimental para la metástasis, faltan prácticas estándar para analizar la carga tumoral metastásica resultante. En algunos casos, se pueden observar diferencias significativas en la carga tumoral metastásica tras la manipulación de líneas celulares particulares y/o el uso de compuestos químicos por vía macroscópica. Sin embargo, en otros casos, las diferencias sutiles en la siembra y el crecimiento metastásico...

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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

A pesar de ser un proceso altamente complejo e ineficiente1, la metástasis es un contribuyente significativo a la morbilidad y mortalidad de los pacientes con cáncer2. De hecho, la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se atribuyen a la propagación metastásica de la enfermedad3,4. Para que las células tumorales hagan metástasis con éxito, deben desprenderse del sitio primario, invadir a través del estroma contiguo, intravasar en la circulación sanguínea o linfática, viajar al lecho capilar de un sitio secundario, extravasar en el tejido secundario y proliferar o crecer para formar lesiones metastásicas5. El uso de modelos de ratón ha sido fundamental para avanzar en la comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la siembra y el crecimiento metastásico6,7. Aquí, nos centramos en la metástasis del cáncer de mama, para la cual a menudo se utilizan tanto modelos de ratón modificados genéticamente como métodos de trasplante, cada uno con su propio conjunto de ventajas y limitaciones.
Los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados hacen uso de promotores específicos de la glándula mamaria, incluyendo MMTV-LTR (repetición terminal larga del virus tumoral mamario de ratón) y WAP (Proteína ácida de suero de leche), para impulsar la expresión de transgenes en el epitelio mamario8. Los oncogenes que incluyen el antígeno T medio del polioma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 y el virus simio 40 (SV40) se han expresado de esta manera9,10,11,12,13, y aunque estos modelos genéticos son útiles para estudiar el inicio y la progresión del tumor primario, pocos hacen metástasis fácilmente en órganos distantes. Además, estos modelos genéticos de ratón son a menudo más prohibitivos en tiempo y costo que los modelos de metástasis espontáneas o experimentales. Dada la limitación de la mayoría de los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados para estudiar la metástasis, las técnicas de trasplante se han convertido en métodos atractivos para estudiar este complejo proceso. Esto incluye la inyección ortotópica, de la vena de la cola, intracardíaca e intracraneal de líneas celulares adecuadas.
Aunque varias líneas celulares de cáncer de mama hacen metástasis fácilmente después de la inyección ortotópica en la almohadilla de grasa mamaria14,15, la consistencia y reproducibilidad de la carga tumoral metastásica puede ser un desafío, y la duración de dichos estudios puede ser del orden de varios meses. Para evaluar la metástasis pulmonar, en particular, la inyección intravenosa en la vena de la cola es a menudo un método más reproducible y efectivo en el tiempo con diseminación metastásica que generalmente ocurre en el lapso de unas pocas semanas. Sin embargo, dado que el modelo de inyección intravenosa omite los pasos iniciales de la cascada metastásica, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de estos estudios. En esta demostración, mostramos la inyección de células tumorales mamarias en la vena de la cola junto con un método de análisis preciso y completo.
A pesar de que la comunidad investigadora ha logrado avances significativos en la comprensión del complejo proceso de la metástasis del cáncer de mama, se estima que más de 150.000 mujeres tienen actualmente cáncer de mama metastásico16. De las pacientes con cáncer de mama en estadio IV, >36% de las pacientes presentan metástasis pulmonar17; sin embargo, el patrón específico del sitio y la incidencia de metástasis pueden variar según el subtipo molecular18,19,20,21. Las pacientes con metástasis pulmonares asociadas al cáncer de mama tienen una mediana de supervivencia de solo 21 meses, lo que pone de manifiesto la necesidad de identificar tratamientos efectivos y nuevos biomarcadores para esta enfermedad17. El uso de modelos experimentales de metástasis, incluida la inyección intravenosa de células tumorales, continuará avanzando en nuestro conocimiento de este importante desafío clínico. Cuando se combinan con la patología de imágenes digitales y el método de análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica descrito en este protocolo, las inyecciones de la vena de la cola son una herramienta valiosa para la investigación de metástasis del cáncer de mama.

<table><tbody><tr><td>almohadillas de preparación con alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td><fuerte>para limpiar la cola antes de la inyección</fuerte></td></tr><tr><td>tijeras de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td><fuerte>para disección de ratones e inflado de tejido pulmonar</fuerte></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>base de medios de cultivo celular para las líneas celulares MDA-MB-231 y MVT1</td></tr><tr><td>La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>utiliza para resuspender células tumorales para</td></tr><tr><td>inyección etanol (solución al 70 %)</td><td>OSU</td><td></td><td>utilizada para minimizar el pelaje de ratón durante la disección; tenga cuidado: inflamable</td></tr><tr><td>Tinte azul de Evan</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>utilizado al 1 % en PBS estéril para la práctica con el método de inyección en la vena de cola; use precaución - reactivo</td></tr><tr><td>peligroso Suero bovino fetal</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>aditivo para medios de cultivo celular; utilizado al 10% en DMEM</td></tr><tr><td>pinzas</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>para la disección y el inflado de tejido pulmonar</td></tr><tr><td>Ratones FVB/NJ</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>001800</td><td>cepa de ratón singénica para células MVT1</td></tr><tr><td>hemacitómetro (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>para su uso en cultivo celular para obtener recuentos celulares</td></tr><tr><td>jeringa de insulina (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>para inyecciones en la vena de cola (BD 329424)</td></tr><tr><td>Células MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td></td> línea <td>celular de cáncer de mama humano</td></tr><tr><td>células MVT1 células</td><td></td><td></td> tumorales <td>mamarias de ratón</td></tr><tr><td>agujas (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>utilizado para inflar el pulmones</td></tr><tr><td>formalina tamponada neutra (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>utiliza como fijador de tejidos y para inflar el tejido pulmonar; tenga cuidado: reactivo peligroso</td></tr><tr><td>NOD. Ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>005557</td><td>mantenido por OSUCCC Validación de objetivos Recurso compartido</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>aditivo para medios de cultivo celular</td></tr> gasa <tr><td>estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>para aplicar presión en la cola del ratón si se produce sangrado</td></tr><tr><td>jeringa (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>utilizado para inflar el retenedor</td></tr><tr><td>de venas de cola de</td> tejido pulmonar de ratón <td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>utilizado para inmovilizar a ratones para inyecciones en las venas de la cola</td></tr><tr><td>Azul de tripán (0,4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>utiliza en cultivo celular para evaluar la viabilidad</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>se utiliza en cultivo celular para separar células tumorales de la placa</td></tr></tbody></table>

análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

La metástasis, la principal causa de morbilidad y mortalidad para la mayoría de los pacientes con cáncer, puede ser difícil de modelar preclínicamente en ratones. Pocos modelos de metástasis espontáneas están disponibles. Por lo tanto, el modelo experimental de metástasis que implica la inyección de la vena de la cola de líneas celulares adecuadas es un pilar de la investigación de metástasis. Cuando las células cancerosas se inyectan en la vena de la cola lateral, el pulmón es su sitio preferido de colonización. Una limitación potencial de esta técnica es la cuantificación precisa de la carga tumoral pulmonar metastásica. Mientras que algunos investigadores cuentan macrometástasis de un tamaño predefinido y/o incluyen micrometástasis después de la seccionamiento del tejido, otros determinan el área de lesiones metastásicas en relación con el área normal del tejido. Ambos métodos de cuantificación pueden ser extremadamente difíciles cuando la carga metastásica es alta. Aquí, demostramos un modelo de inyección intravenosa de metástasis pulmonar seguido de un método avanzado para cuantificar la carga tumoral metastásica utilizando un software de análisis de imágenes. Este proceso permite la investigación de múltiples parámetros de punto final, incluido el tamaño promedio de la metástasis, el número total de metástasis y el área total de metástasis, para proporcionar un análisis completo. Además, este método ha sido revisado por un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios (SEK) para garantizar la precisión.

Si se utilizan células no marcadas para la inyección de la vena de la cola, puede ser difícil confirmar la colonización pulmonar hasta (1) el momento de la necropsia si se pueden observar macrometástasis o (2) después del análisis histológico si existen metástasis microscópicas. Con una extensa carga de tumores pulmonares metastásicos, los ratones tendrán dificultad para respirar. Al igual que con cualquier estudio de tumores, los ratones deben ser monitoreados cuidadosamente durante toda la duración del estudio. El uso ...

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

En la actualidad, no existe un estándar de oro para analizar las cargas tumorales de pulmón metastásicos inducidos por la inyección en las venas de cola. Utilizamos el análisis de imágenes digitales para cuantificar de manera precisa y reproducible las metástasis pulmonares de una manera altamente eficiente. Este método es efectivo en tiempo y costo.Y, cuando se combina con el análisis de imágenes digitales, permite un análisis altamente preciso y completo de la carga tumoral metastásica pulmonar resultante. Para preparar las células de cáncer de mama humano para la inyección, primero coloque un número adecuado de células en un medio de cultivo celular adecuado, en función del número de ratones y la concentración de células que se utilizarán. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90%, lave las placas con PBS y separe las células en un volumen mínimo de tripsina, de acuerdo con los protocolos estándar.Cuando las células se hayan desprendido, vuelva a suspender las células en un medio de cultivo fresco para contarlas y recoja las células por centrifugación. A continuación, vuelva a suspender las células a la concentración adecuada en 100 microlitros de PBS por ratón, en hielo. Justo antes de la inyección, vuelva a suspender completamente las células en hielo para evitar que se aglomeren y cargue 100 microlitros de las células en una jeringa de insulina de calibre 28.Manteniendo la jeringa vertical, golpee el eje mientras ajusta lentamente el émbolo para eliminar las burbujas. Si está permitido, vuelva a tapar la aguja con cuidado y doble la punta de la aguja en un ángulo de 20 a 30 grados. Sujete a un ratón hembra de más de seis semanas en un sujetador de plástico para ratones y coloque al ratón de lado de manera que se vea fácilmente la vena lateral de la cola.Ubique la arteria ventral en línea con los genitales, una vena dorsal y dos venas laterales de la cola, y use una toallita aséptica para limpiar la superficie de la cola. Agarrando la cola entre el dedo índice y el pulgar de la mano no dominante, aplique una ligera tensión y, comenzando en la parte distal de la cola, inserte la aguja, con el lado bisel hacia arriba, paralela a la vena. Entregue lentamente todo el volumen de células en la vena.Es probable que un pequeño volumen de sangre se desplace después de la inyección. Aplique una presión suave con una gasa estéril en el lugar de la inyección. A continuación, deseche la jeringa en un recipiente adecuado para objetos punzocortantes y coloque el ratón en una jaula limpia y ventilada con supervisión.En no más de una hora después de la inyección en la vena de cola, realice imágenes in vivo de animales vivos para confirmar una inyección exitosa de células y obtener datos de tiempo cero. Para mantener el formato estructural de los pulmones para la histopatología, asegure el ratón a una tabla de disección y humedezca el pelaje con etanol al 70%. Abra el tórax con una incisión en la línea media, extendiendo la incisión craneal y caudalmente a través del peritoneo, y agarre la apófisis xifoides para permitir la extracción del diafragma.Con un segundo par de tijeras, corte las costillas a lo largo de cada lado del esternón y retire con cuidado la caja torácica para dejar espacio para que los pulmones se expandan. Para aislar la tráquea, retire las glándulas salivales submandibulares y la musculatura infrahioidea, y coloque alfileres a cada lado de la tráquea para evitar movimientos no deseados durante la inserción de la aguja. Cargue una jeringa de tres mililitros, equipada con una aguja de calibre 26, con dos a tres mililitros de formelina tamponada neutra al 10%, e inserte la aguja en la tráquea.Inyecte lentamente la formelina, mientras observa si los pulmones se expanden. Una vez que la formelina comience a salir de los pulmones, use fórceps para pellizcar la tráquea y retirar la aguja. A continuación, separe todo el aparato respiratorio y coloque los órganos directamente en un recipiente de formelina fresca.Para el análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica, escanee secciones de tejido pulmonar teñidas con H&E en un escáner de portaobjetos de alta resolución con un aumento de 40 veces e importe las imágenes a un programa de software de análisis de imágenes adecuado. Ajuste los parámetros que definen la forma y la dispersión para que se ajusten mejor a las imágenes. Para mostrar las áreas segmentadas de las metástasis tumorales y el tejido pulmonar normal, utilizando etiquetas de diferentes colores para cada tipo de tejido, abra el programa Decision Forest y siga la serie de preguntas de sí o no que se le indiquen para entrenar adecuadamente a cada clase para una imagen.Para ajustar las características de cada clase, aplique filtros para enfocar, desenfocar u ordenar por forma para mejorar la precisión del algoritmo. En este análisis, las metástasis tumorales aparecen en azul. El tejido normal es verde y el epitelio bronquiolar es amarillo.Los glóbulos rojos se pueden observar en rojo y los espacios aéreos aparecen en rosa. Cuando se hayan establecido todas las características, guarde la configuración modificada y aplique el algoritmo a todo el conjunto o serie de tejidos teñidos con H&E. A continuación, exporte todas las variables de salida para permitir que el área en micras cuadradas se cuantifique para cada tipo de tejido y para permitir el cálculo de los porcentajes a partir del área neta total de tejido de la muestra.La presencia de una señal de bioluminiscencia dentro del espacio torácico menos de dos horas después de la inyección en la vena de cola de células de cáncer de mama epitelial humano marcadas con luciferasa puede considerarse la confirmación de una inyección precisa. En este experimento, los recuentos de fotones en la región torácica aumentaron con el tiempo y una fuerte señal de bioluminiscencia todavía estaba presente en el día 24 después de la inyección. En el momento de la necropsia, se observaron muchas lesiones pulmonares macroscópicas en estos ratones.Utilizando un software de análisis de imágenes y un algoritmo personalizado como se ha demostrado, el tejido pulmonar completo se puede segmentar por diferentes características del tejido. Al segmentar el tejido pulmonar de esta manera, el software puede cuantificar varios parámetros. Aquí, se muestran los datos brutos de un análisis realizado en tejido pulmonar de ratones inyectados con células epiteliales humanas de cáncer de mama seguido de un tratamiento con un fármaco diseñado para bloquear la colonización metastásica.Como se demuestra en estas imágenes, es posible que se haya pasado por alto fácilmente una diferencia en la carga tumoral metastásica entre estos grupos de tratamiento, ya que el número total de nódulos pulmonares no es diferente. Sin embargo, un análisis exhaustivo de todos los parámetros indicó una diferencia significativa en el porcentaje de área neta de metástasis pulmonar, lo que subraya la necesidad de un enfoque exhaustivo para el análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica. Una resuspensión celular adecuada sin burbujas de aire es fundamental para prevenir las embolias pulmonares, y una inflación pulmonar exitosa ayuda a mantener la integridad de la estructura del tejido para un análisis de imagen preciso. La inmunotinción del tejido pulmonar se puede realizar para determinar la presencia de células o proteínas de interés dentro de las lesiones pulmonares o el microambiente pulmonar.

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este artículo se describen los procedimientos de ensayo de metástasis experimental que se utiliza para determinar el potencial metastásico de líneas celulares de cáncer humano.

Ensayo experimental de metástasis

Este video describe una técnica de inyección de células cancerosas marcadas mediante inyección de venas de cola en un modelo de ratón. Además, monitorizamos la formación y el crecimiento del cáncer de mama mediante imágenes de animales vivos in vivo en tiempo real.

Inyección de venas de cola: un método para administrar células cancerosas para estudios metastásicos en un modelo de ratón

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Modelo experimental de ratón de melanoma metastásico: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de melanoma en los pulmones

Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

La metástasis desempeña un papel profundo en la virulencia del cáncer, representando aproximadamente el 90% de las muertes.  Presentamos un protocolo para un modelo de melanoma metastásico en ratones que es útil para determinar la eficacia de agentes terapéuticos frente a este fenómeno clínico.

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Se desarrolló un procedimiento quirúrgico para administrar células tumorales mamarias al hígado murino mediante inyección en la vena porta. Este modelo permite la investigación de las etapas tardías de la metástasis hepática en un huésped totalmente competente para el sistema inmunitario, incluida la extravasación de células tumorales, la siembra, la supervivencia y el crecimiento metastásico en el hígado.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del protocolo para el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA). Este modelo permite a los investigadores a estudiar el crecimiento de células de osteosarcoma metastásico (OS) en el tejido del pulmón usando un widefield fluorescencia o un microscopio de escaneo láser confocal.

Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Aprende a cuantificar metástasis pulmonares mediante inyección en vena de la cola y análisis digital de imágenes en ratones. Este método eficiente y reproducible facilita el estudio de la carga tumoral metastásica en investigación oncológica.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

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