Name: Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende a diseccionar, inmunotincionar y montar cerebros de larvas y adultos de Drosophila para visualizar el lóbulo óptico con estrategias de orientación óptima. Este protocolo mejora la claridad de imagen en neurociencia.

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Nos gustaría agradecer a Claude Desplan por compartir con nosotros una alícuota del anticuerpo Bsh. Los anticuerpos monoclonales DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up y Bruchpilot se obtuvieron del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo, creado por el NICHD de los NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242. Este trabajo fue apoyado por una beca NSERC Discovery Grant otorgada a T.E.. U.A. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado Alexander Graham Bell de NSERC Canadá. P.V. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado de Ontario.

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<li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li>
<li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En este protocolo, describimos un método para inmunoteñir cerebros de larvas y adultos de Drosophila y montarlos en varias orientaciones. Si bien los métodos para teñir cerebros de larvas y adultos se han descrito previamente 22,23,24,27,28, las estrategias de montaje para la visualización óptima de estructuras específicas del lóbulo óptico han recibido menos atención <sup c...

El sistema visual de Drosophila, compuesto por el ojo compuesto y el lóbulo óptico subyacente, ha sido un excelente modelo para el estudio del desarrollo y la función de los circuitos neuronales. En los últimos años, el lóbulo óptico en particular ha surgido como un poderoso sistema en el que estudiar los procesos del neurodesarrollo como la neurogénesis y el cableado de circuitos 1,2,3,4,5,6,7,8. Está formado por cuatro neurópilas: la lámina, la médula, la lóbula y la placa de lóbula (estas dos últimas forman parte del complejo lóbula)1,2,3,4,5,6. Los fotorreceptores del ojo, se dirigen a las neuronas de la lámina y la médula, que procesan las entradas visuales y las transmiten a los neuropilos del complejo lóbulo 1,2,3,4,5,6. Las neuronas de proyección en el complejo lóbulo envían posteriormente información visual a los centros de procesamiento de orden superior en el cerebro central 1,5,9. La compleja organización del lóbulo óptico, necesaria para mantener la retinotopía y procesar diferentes tipos de estímulos visuales, lo convierte en un sistema atractivo para estudiar cómo se ensamblan circuitos neuronales sofisticados. En particular, la médula comparte sorprendentes similitudes tanto en su organización como en su desarrollo con la neurorretina, que ha sido durante mucho tiempo un modelo para el desarrollo de circuitos neuronales de vertebrados 3,8.
El desarrollo del lóbulo óptico comienza durante la embriogénesis, con la especificación de ~ 35 células ectodérmicas que forman la placa óptica 2,4,5,6,7,8. Después de la eclosión de las larvas, la placa óptica se subdivide en dos primodios distintos: 1) el centro de proliferación externa (OPC), que genera las neuronas de la lámina y la médula externa y 2) el centro de proliferación interna (IPC), que genera neuronas del complejo de médula y lóbulainterna 4,5,6,10 . En la larva de segundo estadio tardío, las células neuroepiteliales de OPC e IPC comienzan a transformarse en neuroblastos que posteriormente generan neuronas a través de células madre ganglionares intermedias 4,5,11,12. Los neuroblastos del lóbulo óptico están modelados por factores de transcripción restringidos espacial y temporalmente, que actúan juntos para generar diversidad neuronal en su progenie 11,12,13,14. En la pupa, los circuitos de los neuropilos del lóbulo óptico se ensamblan a través de la coordinación de varios procesos, incluida la muerte celular programada 11,15, la migración neuronal12,16, la orientación axonal/dendrítica10,17, la formación de sinapsis18,19 y las rotaciones de neuropilas10,17.
Aquí, describimos la metodología por la cual los cerebros de larvas y adultos son diseccionados, inmunoteñidos y montados para obtener imágenes del lóbulo óptico. Dada su compleja organización tridimensional, el análisis del lóbulo óptico requiere que se comprenda cómo se colocan sus neurópilos adultos y sus progenitores larvarios en relación con el cerebro central. Por lo tanto, ponemos especial énfasis en cómo la orientación del montaje se relaciona con la organización espacial de las estructuras de los lóbulos ópticos. Describimos tres estrategias de montaje para cerebros de larvas (anterior, posterior y lateral) y tres para cerebros adultos (anterior, posterior y horizontal), cada una de las cuales proporciona un ángulo óptimo para obtener imágenes de una población específica de progenitores del lóbulo óptico o neuropilo.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehído</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (cabra) uso secundario</td><td>de Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>a 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (ratón) uso secundario</td><td>de Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>a 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (conejillo de indias) uso secundario</td><td>de Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>a 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (rata) secundario</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>uso a 1:500</td></tr><tr><td>cubrecubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Plato de disección</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas secas</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-Bgal de cabra</td><td>Uso de</td><td></td> biogénesis <td>a 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-Bsh para conejillos de indias</td><td>Regalo de Claude Desplan</td><td></td><td>uso a 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-Vsx1 para conejillos de indias</td><td>Erclik et al. 2008</td><td></td><td>uso a 1:1000</td></tr><tr><td>Película de laboratorio</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de</td> <td>microcentrífugaSarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-dac de ratón</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas (DSHB)</td><td>uso de mabdac2-3</td><td>a 1:20</td></tr><tr><td>Ratón anticuerpo primario anti-eya</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>uso a 1:20</td></tr><tr><td>Ratón anticuerpo primario anti-nc82</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>uso a 1:50</td></tr><tr><td>ratón anticuerpo primario anti-SVP</td><td>DSHB</td><td>Seven-up 2D3</td><td>uso a 1:100</td></tr><tr><td>Arcilla polimérica</td><td>Se puede utilizar</td><td></td><td></td>cualquier tipo de arcilla</tr><tr><td>Conejo anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>uso a 1:1000 Rata</td></tr><tr><td>anticuerpo primario anti-DE-Cadherina</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>uso a 1:20</td></tr><tr><td>Medio de montaje Slowfade</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>También se puede utilizar el medio de montaje Vectashield (cat# H-1000)</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de drosophila para la visualización del lóbulo óptico

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

El lóbulo óptico de Drosophila , compuesto por cuatro neuropilas: la lámina, la médula, la lóbula y la placa de lóbula, es un excelente sistema modelo para explorar los mecanismos de desarrollo que generan la diversidad neuronal e impulsan el ensamblaje de circuitos. Dada su compleja organización tridimensional, el análisis del lóbulo óptico requiere que se comprenda cómo se colocan sus neurópilos adultos y sus progenitores larvarios en relación con el cerebro central. Aquí, describimos un protocolo para la disección, inmunotinción y montaje de cerebros de larvas y adultos para la obtención de imágenes del lóbulo óptico. Se hace especial hincapié en la relación entre la orientación del montaje y la organización espacial del lóbulo óptico. Describimos tres estrategias de montaje en la larva (anterior, posterior y lateral) y tres en el adulto (anterior, posterior y horizontal), cada una de las cuales proporciona un ángulo de imagen ideal para una estructura de lóbulo óptico distinta.

En la Figura 1 y la Figura 2 se presentan imágenes confocales de lóbulos ópticos larvales y adultos montados en las orientaciones descritas en el protocolo.
La Figura 1 muestra esquemas y cortes confocales representativos de cerebros de larvas colocados en las orientaciones anterior, posterior y lateral. En la orientación de montaje anterior, el epitelio OPC (DE-Cadherin), los neuroblastos del bulbo raquí...

Este protocolo describe tres pasos para preparar los lóbulos ópticos de larvas y adultos de Drosophila para la obtención de imágenes: 1) disecciones cerebrales, 2) inmunohistoquímica y 3) montaje. Se hace hincapié en el paso 3, ya que se requieren distintas orientaciones de montaje para visualizar estructuras específicas de lóbulos ópticos.

Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Describimos un protocolo para diseccionar, inmunoteñir y montar cerebros de larvas y adultos de Drosophila con especial énfasis en los lóbulos ópticos. Dada la compleja organización tridimensional del lóbulo óptico, se anticipa que el protocolo descrito aquí proporcionará a los investigadores una mayor comprensión de la relación entre la orientación de montaje y las estructuras visualizadas del lóbulo óptico. Este protocolo describe tres estrategias de montaje para lóbulos ópticos larvales y adultos, cada una de las cuales proporciona un ángulo óptimo para visualizar una estructura específica del lóbulo óptico durante la obtención de imágenes.Antes de comenzar la disección, llene todos los pocillos de una placa de tres pocillos con 400 microlitros de PBS por pocillo, y use fórceps para seleccionar suavemente 15 larvas errantes del tercer estadio que se arrastran por el interior de un frasco o botella de Drosophila. Coloque todas las larvas en el primer pocillo de la placa de tres pocillos y transfiera una larva al pocillo central del plato. Con la mano no dominante, sujete el cuerpo de la larva en la base del pozo y use la mano dominante para agarrar suavemente el gancho bucal de l

dissection-immunohistochemistry-mounting-larval-adult-drosophila

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

Este video describe un método para montar cerebros intactos de moscas adultas debajo de un portaobjetos de puente y muestra el protocolo realizado en cerebros inmunoteñidos para microscopía fluorescente.

Montaje de cerebros adultos de Drosophila: un método para preparar portaobjetos para la obtención de imágenes confocales

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados ​​en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Aprende a diseccionar, inmunotincionar y montar cerebros de larvas y adultos de Drosophila para visualizar el lóbulo óptico con estrategias de orientación óptima. Este protocolo mejora la claridad de imagen en neurociencia.

Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico

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