Name: Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a preparar y administrar un cóctel de fagos contra Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra. Este método permite evaluar in vivo la eficacia de la terapia de fagos para contrarrestar infecciones bacterianas.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Italiana de Fibrosis Quística (FFC-22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo y FFC-23/2019; Un respiro en piá Onlus La Mano tesa Onlus).

El pez cebra adulto (Danio rerio) de la cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) se mantiene de acuerdo con las directrices internacionales (Directiva 2010/63/UE de la UE) y nacionales (decreto italiano 4 de marzode 2014, n. 26) sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Las condiciones estándar se establecen en la instalación de peces con un ciclo oscuro de 14 h de luz/10 h y una temperatura del agua del tanque a 28oC.
1. Preparación de soluciones y herramientas
<ol><li>Preparar una solución de stock 50x y 1x soluciones de trabajo para el medio embrionario E3 para el cultivo de embriones de pez cebra (ver Tabla 1).</li>
	<li>Hacer la solución de bloqueo de pigmentación, para bloquear la pigmentación del embrión de 24 horas después de la fertilización (24 hpf) (ver Tabla 1).</li>
	<li>Preparar 25x stock y 1x solución anestésica de tricano de trabajo como se describe en la Tabla 1. NOTA: Para evitar la congelación y descongelación repetidas de la solución que podría dañar la solución en stock, haga alícuotas de 2 ml de tricaína 25x y guárdelas a -20 oC.</li>
	<li>Preparar orugas para la microinyección embrionaria disolviendo 1 g de agarosa en 100 ml de H2O destilado en un matraz o frasco microwavable. Microondas durante 1-3 min hasta que la agarosa se disuelva por completo.</li>
	<li>Coloque los moldes de microinyección de pez cebra (ver Tabla de Materiales)al revés en una placa Petri (90 mm x 15 mm) y cubra toda la superficie vertiendo el gel de agarosa líquida con una anchura de aproximadamente 10 mm.</li>
	<li>Retire el molde una vez que la agaria se haya solidificado. Llene el plato Petri con 1x medio embrionario E3. Esto se puede almacenar a 4 oC durante aproximadamente una semana. Antes de su uso, sustituir por el medio E3 fresco que contenga Tricaine. NOTA: Los mohos más antiguos pueden desarrollar hongos o contaminaciones bacterianas.</li>
	<li>Utilice capilares de borosilicato pulidos al fuego de 10 cm para preparar agujas para la microinyección y fijarlas al tirador de micropipetas apretando las asas. Ajuste el tirador con los siguientes ajustes: calor 500, velocidad 100, tiempo 150, tirar 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) preparación del inóculo
<ol><li>Inocular 1 colonia de GFP+P. aeruginosa cepa PAO119 en 5 ml de caldo LB (ver Tabla 1) y crecer durante la noche a 37 oC con temblores (200 rpm).</li>
	<li>Diluir el cultivo de la noche anterior aOD 600 a 0,1 en 10 ml de caldo de LB y crecer hastaOD 600 a 0,5 a 37 oC con agitación (200 rpm).</li>
	<li>Centrífuga 2 ml del cultivo durante 2 min a 4oC a 16.100 x g y resuspend el gránulo celular aOD 600o 1, equivalente a aproximadamente 1 x 109 cfu/ml, en 1 ml de la solución fisiológica (ver Tabla 1).</li>
	<li>Diluir la suspensión celular a aproximadamente 5 x10 7cfu/ml en solución fisiológica y almacenar a 4 oC.</li>
</ol>3. Preparación de material de phage
<ol><li>Inocular 1 colonia de P. aeruginosa cepa PAO1 en 5 ml de caldo de LB e incubar durante la noche a 37 oC con temblor. Diluir el cultivo nocturno aOD 600 a 0,01 en 500 ml de caldo de LB y crecer a 37 oC con agitación aOD 600 a 0,05, equivalente a aproximadamente 2,5 x 107 cfu/ml.</li>
	<li>Al cultivo diluido de P. aeruginosa,añadir alrededor de 1,25 x 107 fagos, para obtener la multiplicidad de infección (M.O.I.) de 10-3. Incubar a 37oC con temblor hasta que el OD600 caiga a aproximadamente 0,1-0,3 (en aproximadamente 3 a 5 h, dependiendo del fago utilizado). NOTA: Se seleccionaron cuatro fagos para este experimento que infectan la cepa PAO1: dos Podoviridae, números de adhesión de GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 y vB_PaeP_DEV, MF490238 y dos Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 y vB_PaeM_E217, MF490240. Realice los pasos a continuación para cada fago individualmente.</li>
	<li>Incubar el izado con 1 mg/ml de DNase y RNase durante 30 min a 37oC. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 min a 4oC y recuperar cuidadosamente el sobrenadante (SN). Filtrar el SN con un filtro con un diámetro de poro de 0,8 m.</li>
	<li>Al SN, agregue 58 g/L de NaCl y 105 g/L de PEG6000. Disolver con agitación a RT 20 min y luego mantenerlo durante la noche a 4oC. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 min a 4oC para la precipitación del fago. Retire el SN y disuelva cuidadosamente el pellet de fago en 15 ml de tampón TN (ver Tabla 1).</li>
	<li>Purifique los fagos con gradiente de densidad CsCl como se describe en los pasos a continuación.<ol>
<li>En un tubo de ultracentrífuga poliallomer para rotor SW41, prepare un gradiente de densidad de paso CsCl estratificando 2 ml de las cuatro soluciones CsCl descritas en la Tabla 1.  Añadir 3,5 ml de suspensión de fagos en cada uno de los 4 tubos. NOTA: CsCl es tóxico, adoptar procedimientos de seguridad adecuados para manejarlo y desecharlo.</li>
		<li>Introducir los tubos en el rotor y asegurarse de que los tubos están equilibrados (la diferencia de peso entre los dos tubos de orientación debe ser ≤ 0.01g).</li>
		<li>Centrífuga para 2 h a 4oC y 100,000 x g (25.000 rpm para rotor SW41). Después de la centrifugación, retire lentamente los tubos e inmovilícelos cuidadosamente en un soporte. Usando una jeringa con aguja de 19 G, extraiga la banda blanca/opalescente que se encuentra generalmente entre la d-1.5 y la región de densidad d-1.4.</li>
		<li>Transfiera las suspensiones de la jeringa a nuevos tubos de poliallomer para el rotor SW60 y utilice la solución d-1.4 para equilibrar con precisión los tubos.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión a 4oC y 150.0000 x g (38.000 rpm para el rotor SW60) durante al menos 16 h.</li>
		<li>Recoja la banda visible como arriba (consulte el paso 3.3.3) y transfiéralas a tubos de diálisis con 6.000 Da de corte. Dialyze la banda visible obtenida 2x durante 20 min contra 500 mL de agua y durante la noche contra 500 mL de tampón TN. Filtrar con un filtro de poro de 0,22 m y conservar a 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparación de cócteles de phage
<ol><li>Hacer una mezcla de cuatro fagos que infectan la cepa PAO1, previamente aislada y caracterizada8. Antes de mezclar, estime el título de cada material de fagos por ensayo de placa20.</li>
	<li>Montar el cóctel de fagos, con un título general de 5 ×10 8 pfu/ml, mezclando igualmente cuatro preparaciones de fago en el mismo pfu/ml inmediatamente antes de cada experimento, para asegurar títulos de fago precisos.</li>
</ol>5. Recolección y preparación de embriones de pez cebra para la microinyección de cftr morpholinos
NOTA: Recoger 1-2 embriones celulares de peces cebra de tipo salvaje para la microinyección cftr morpholinos (cftr-MOs).
<ol><li>Dos días antes del experimento de microinyección bacteriana, configure parejas reproductoras y recoja embriones como se describió anteriormente21. El pez cebra adulto (Danio rerio) de la cepa AB se compró en el Centro Europeo de Recursos de Peces Debras, EZRC.</li>
	<li>Al día siguiente, recoger los embriones inmediatamente después de la fertilización con una pipeta de plástico o utilizando un colador de malla fina. Coloque los embriones recogidos en un plato de Petri que contenga el medio embrionario E3 y retire cuidadosamente los residuos con una pipeta de plástico para evitar la contaminación que pueda dañar el desarrollo embrionario.</li>
	<li>Preparar 5 l de solución inyectable de morfolino diluyendo las dos soluciones de stock de morfolino (1 mM) en agua estéril a una concentración final de 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splice-MO. Para rastrear la inyección de embriones, añada 0,5 l de rojo fenol a la mezcla de solución inyectable de morfolino.</li>
	<li>Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 ml de la solución de mezcla de morfolino utilizando una micropipeta de 20 l con una punta de carga de gel fino. Fije la aguja al micromaniprógrafo conectado a un soporte y colóquela debajo de un estereomicroscopio. NOTA: No es necesario que la solución llegue a la punta de la aguja, ya que la presión de la bomba microinyector la empujará.</li>
	<li>Sujete la punta de la aguja cortando la punta de la aguja con pinzas estériles finas. Mida el diámetro de la gota utilizando una barra de escala en el ocular del microscopio. Alternativamente, cree una gota de aceite mineral en un portaobjetos de micrómetros y ajuste el volumen de microinyección inyectando la solución en la gota de aceite para evaluar el tamaño de la gota. Utilice una gota con un diámetro de 156 m para inyectar un volumen de 2 nL.</li>
	<li>Ajuste el microinyector ajustando la presión de compensación a 15 hPa, el tiempo de inyección a 0,5 s y la presión de inyección entre 300 y 600 hPa para obtener el volumen de inyección correcto en función de la aguja utilizada.</li>
	<li>Con una pipeta de plástico, coloque los embriones del paso 5.2 en un vidrio colocado en una placa Petri de 96 mm de diámetro. NOTA: Demasiado medio E3 evitará la correcta penetración de la aguja de microinyección en la tarea de los embriones.</li>
	<li>Penetrar la tarea y luego la yema con la aguja para inyectar 2 nL en el embrión como se describió anteriormente22.</li>
	<li>Colocar embriones inyectados en un plato de Petri con E3 medio y ponerlos en una incubadora a 28 oC para que se desarrollen hasta el día siguiente.</li>
</ol>6. Microinyección de embriones de pez cebra con bacterias y cóctel de fagos
NOTA: Para realizar una infección sistémica, el embrión debe tener circulación sanguínea que generalmente comienza después de 26 cvf.
<ol><li>Después de 26 hpf (para las etapas de desarrollo del pez cebra se refieren a Kimmel21)embriones de descorionato con solución de pronasa preparada mediante la disolución de polvo de pronasa en E3 medio a una concentración de 2 mg/ml. Pipetear suavemente los embriones para romper el coro. Deseche el medio pronasa/E3 y enjuague el plato varias veces con E3 fresco para eliminar toda pronasa.</li>
	<li>Anesthetizar embriones de pez cebra en medio E3 que contenga Tricaine aproximadamente 5 minutos antes de las inyecciones.</li>
	<li>Pipetear los embriones anestesificados en la pista preparados en el paso 1. Utilice una punta de carga de gel fino para forrar los embriones en la posición lateral.</li>
	<li>Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 oL de la preparación de P. aeruginosa como se describe en la parte 5.</li>
	<li>Inserte la aguja dorsalmente hasta el punto de partida del conducto de Cuvier donde comienza a extenderse sobre el saco de yema. Inyectar un volumen de 1-3 nL y asegurarse de que el volumen se expande directamente dentro del conducto y entra en la circulación.</li>
	<li>Aproximadamente después de cada 50 embrión inyectados, inyecte una gota de la bacteria en un tubo centrífugo de 1,5 ml con 100 ml de PBS estéril para comprobar si el volumen de inyección sigue siendo el mismo. Encuado el inóculo en el agar LB (ver Tabla 1) a 37oC durante la noche para evaluar la CFU.</li>
	<li>Transfiera los embriones microinyectados en dos platos Limpios de Petri con medio E3 fresco + PTU e incubarlos a 28oC.</li>
	<li>En dos puntos de tiempo seleccionados: 30 min o 3 h después de la inyección bacteriana, saque uno de los platos De Petri con embriones inyectados bacterianos de la incubadora y alinee en la pista como se describe en 6.3 para la inyección de cóctel de fagos.</li>
	<li>Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 ml del cóctel de fagos (preparado en el paso 4) con una punta de carga de gel fino y fíjela al microinyector (ver paso 5).</li>
	<li>Inyectar el cóctel de fagos en el conducto de Cuvier de los embriones previamente inyectados con bacterias.</li>
	<li>Transfiera los embriones microinyectados en dos platos Limpios de Petri con medio E3 fresco + PTU e incubarlos a 28oC.</li>
</ol>7. Evaluación de la carga bacteriana de embriones inyectados con PAO1 y fagos
<ol><li>A 8 hpi, pipeta 15 embriones anestesiados de la placa Petri a un tubo centrífugo de 1,5 ml.</li>
	<li>Sustituya la solución anestésica por 300 l de 1% Tritón X-100 en PBS (PBSTritonX) y homogeneice los embriones pasándolos al menos 15 veces a través de una jeringa de insulina con una aguja estéril de 27 G.</li>
	<li>Preparar diluciones en serie de homogeneados en PBS estéril mediante la transferencia de 100 l del homogenerato diluido a 900 l de PBS estéril.</li>
	<li>Para seleccionar la cepa PAO1 resistente a los amplificadores de forma natural, la placa de 100 ml de las diluciones en el agar LB añadido con ampicilina (100 g/ml) e incubar a 37 oC durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, contar el número de colonias, multiplicar por el factor de dilución para determinar el número total de UFC, y dividir por el número de embriones homogeneizados para obtener el número promedio de UFC/ embrión infectado.</li>
</ol>8. Evaluación de la letalidad de embriones inyectados con PAO1 y fagos
<ol><li>Para evaluar la letalidad de la infección PAO1, puntúe los embriones inyectados a 20 hpi bajo un estereomicroscopio y cuente para los embriones muertos (blanco/no transparente).</li>
	<li>Calcular la concentración letal medio máxima 50 (LD50) dosis de PAO1 que determina la muerte del 50% de los embriones inyectados a 20 cvf.</li>
</ol>9. Preparación de embriones para imágenes de lapso de tiempo estereomicroscopio de la infección por GFP+ PAO1
<ol><li>Preparar el molde para la toma de imágenes de embrión vivo disolviendo un 1,5% de agarosa de baja fusión en 100 ml de solución E3.</li>
	<li>Añadir 1% Tricaine (ver Tabla 1) para anestesiar los embriones.</li>
	<li>A 4 hpi transfiera un embrión con una pipeta de plástico en un plato de fondo de vidrio y agregue la solución cálida de agarosa de punto de fusión baja.</li>
	<li>Coloque la placa inferior de vidrio debajo de un estereomicroscopio y con una punta coloque el embrión en la orientación deseada. Utilice una pipeta de plástico para añadir cuidadosamente una gota de agarosa en el embrión.</li>
	<li>Dejar enfriar la agarosa durante 5-10 min y llenar suavemente el plato de fondo de vidrio con E3 que contiene la solución anestésica para mantener el embrión húmedo.</li>
	<li>Coloque la placa inferior de vidrio con el embrión debajo del estereomicroscopio fluorescente con un filtro fluorescente (canal 488 nm) para GFP+ bacterias. No retire el plato Petri hasta nuevas adquisiciones con los mismos parámetros a 9, 14 y 18 hpi.</li>
</ol>10. Análisis de expresión de citoquinas proinflamatorias
<ol><li>A 20 hpi anestesiar los embriones con solución de tricaína 1x y transferirlos de la placa Petri a un tubo centrífugo de 1,5 ml.</li>
	<li>Bajo una campana de humo retire la solución anestésica y sustitúyala con 200 l de reactivo de clorhidrato de guanidio.</li>
	<li>Homogeneizar los embriones pipeteándolos repetitivamente a través de una pipeta de 200 l primero y luego al menos 15 veces con una jeringa de insulina con una aguja estéril de 27 G.</li>
	<li>Extraiga el ARN total de embriones de pez cebra homogeneizados utilizando reactivos de clorhidrato de guanidio disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Tratar 1 g de cada muestra de ARN con 2 ml de 1U/L de DNase I (sin RNase), siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Utilice 1 g de ARN tratado con DNase I para la reacción de transcripción inversa (RT) utilizando un kit disponible comercialmente (ver Tabla de materiales),en un volumen total de 20 ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Realice la reacción RT qPCR en un volumen total de 10 l que contenga 1 mezcla maestra SYBR Green utilizando 1,5 l de una dilución de 1:6 de reacción RT. Para fines de normalización, utilice las imprimaciones para los genes de mantenimiento de la casa rpl8 y para las citoquinas proinflamatorias, utilice imprimaciones para TNF-α e IL-1 (ver Tabla 2). el protocolo qPCR fue: ciclo 1 paso 1: 95 oC, 2 min, repetir una vez; ciclo 2: paso 1 95 oC, 10 s, paso 2 55 oC, 30 s, repetir 40x; ciclo 3: paso 1 72 oC, 15 min.</li>
</ol>

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<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este manuscrito, describimos el protocolo para realizar la infección por P. aeruginosa (PAO1) en embriones de pez cebra y cómo aplicar la terapia de fagos con un cóctel de fagos previamente identificados como capaces de infectar PAO1 para resolverlo. El uso de bacteriófagos como alternativa a los tratamientos antibiótico ha sido de creciente interés desde los últimos años. Esto se debe principalmente a la difusión de infecciones bacterianas multirresistentes (MDR), que constituyen un problema grave para la sa...

La terapia de fagos, el uso de los enemigos naturales de las bacterias para combatir las infecciones bacterianas, está acayendo un renovado interés a medida que la resistencia bacteriana a los antibióticos se generaliza1,,2. Esta terapia, utilizada durante décadas en Europa del Este, podría considerarse un tratamiento complementario a los antibióticos en el curado de infecciones pulmonares en pacientes con FQ y una posible alternativa terapéutica para pacientes infectados con bacterias que son resistentes a todos los antibióticos actualmente en uso2,,3. Las ventajas de la terapia antibiótica son que los bacteriófagos se multiplican en el lugar de la infección, mientras que los antibióticos se metabolizan y eliminan del cuerpo4,,5. De hecho, la administración de cócteles de fagos virulentos aislados en diferentes laboratorios ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en modelos animales tan diferentes como insectos y mamíferos6,,7,,8. La terapia de fagos también demostró ser capaz de reducir la carga bacteriana en las heridas por quemaduras infectadas con P. aeruginosa y Escherichia coli en un ensayo clínico aleatorizado9.
El pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un modelo valioso para estudiar infecciones con varios patógenos, incluyendo P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus y Burkolderia cepacia12,13. Mediante la microinyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea embrionaria14 es fácil establecer una infección sistémica que es contrarrestado por el sistema inmune innato de pez cebra, que es evolutivo conservado con neutrófilos y generación de macrófagos similar a la contraparte humana. Además, durante el primer mes de vida, los embriones de pez cebra carecen de la respuesta inmune adaptativa, lo que los convierte en modelos ideales para estudiar la inmunidad innata, que es el mecanismo crítico de defensa en las infecciones pulmonares humanas15. Zebrafish surgió recientemente como un potente sistema de modelos genéticos para comprender mejor el inicio del CF y desarrollar nuevos tratamientos farmacológicos10,,16,,17. El modelo de pez cebra CF de derribo de cftr generado con inyección de morfolino en peces cebra presentó una respuesta amortiguada de ráfaga respiratoria y una migración de neutrófilos reducida10,mientras que el knock-out del cftr conduce a una alteración de la posición interna del órgano y a la destrucción del páncreas exocrino, un fenotipo que refleja la enfermedad humana16,,17. De mayor interés fue la constatación de que la carga bacteriana de P. aeruginosa fue significativamente mayor en embriones cftr-pérdida de función que en controles a las 8 horas posteriores a la infección (hpi), que es paralela a los resultados obtenidos con ratones y células epiteliales bronquiales humanas2,18.
En este trabajo, demostramos que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa en embriones de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>nombre común tricaína</td></tr><tr><td>Micromanipulador Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/marrón P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Azul</td> <td>de metiloSigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de microinyección</td><td>Aparato</td><td></td><td></td>Harvard</tr><tr><td>N-Phenylthiourea >=98%</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Morpholino</td><td>Gene Herramientas</td><td></td><td>diseñadas por el investigador</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Solución de rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio ACS reactivo, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Oxoide</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Microinyección</td><td>Word Instrumentos de</td><td></td><td></td> precisión</tr></tbody></table>

aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

La resistencia a los antimicrobianos, una consecuencia importante de la incertidumbre diagnóstica y la sobrescripción antimicrobiana, es una causa cada vez más reconocida de infecciones graves, complicaciones y mortalidad en todo el mundo con un enorme impacto en nuestra sociedad y en el sistema de salud. En particular, los pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos o patologías preexistentes y crónicas, como la fibrosis quística (CF), son sometidos a frecuentes tratamientos antibiótico para controlar las infecciones con la aparición y difusión de aislados multirresistentes. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de abordar terapias alternativas para contrarrestar las infecciones bacterianas. El uso de bacteriófagos, los enemigos naturales de las bacterias, puede ser una posible solución. El protocolo detallado en este trabajo describe la aplicación de la terapia de fagos contra la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra CF. Los embriones de pez cebra se infectaron con P. aeruginosa para demostrar que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa, ya que reduce la letalidad, la carga bacteriana y la respuesta inmunitaria proinflamatoria en embriones CF.

Los resultados y las cifras aquí presentados se refieren a embriones CF generados a través de la inyección de cftr morpholinos como se describió anteriormente10 y en el paso 5. Para validar el fenotipo CF, se consideró la posición deteriorada de órganos internos como el corazón, el hígado y el páncreas como se describió anteriormente17 (Figura 1). Se obtuvieron resultados similares en el caso de los embriones WT, como se informó en nue...

Aquí se presenta un protocolo para la infección por Pseudomonas aeruginosa y la aplicación de terapia de fagos en embriones de peces cebra de fibrosis quística (CF).

Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Este protocolo facilita la preparación y administración de un cóctel viral y de fagos contra pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación in vivo de la eficacia del fago en la contracción de la infección bacteriana. El cóctel de fagos es eficiente tanto en modelos de peces cebra de tipo salvaje como de fibrosis quística.Abrir la posibilidad de aplicar la terapia de fagos a las infecciones bacterianas en pacientes con fibrosis quística. La terapia de phage también se puede aplicar para contrarrestar infecciones bacterianas específicas en otros sistemas modelo. Para preparar un caldo de fagos para el experimento.Añadir 1,25 veces 10 a los séptimos fagos a un OD 600 de 0,05 P.aeruginosa cultivo a una multiplicidad de infección de uno por 10 a los tres negativos e incubar el cultivo durante tres a cuatro horas con temblor hasta que el OD 600 cae a 0.1 a 0.3. Al final de la incubación de incubación el lisato con un microgramo por mililitro de DNAse y RNAse durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Y peletiza las células por centrifugación.Al final del filtro de centrifugación el sobrenadante a través de un diámetro de poro de 0,8 micro metros y añadir 58 gramos por litro de cloruro de sodio y 105 gramos por litro de PEG 6000. Incubar la solución a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, precipitar el fago por centrifugación.Al final de la centrofuga eliminar el sobrenadante y disolver cuidadosamente el pellet de fago en 15 mililitros de tampón de cloruro de sodio Tris. Para purificar los fagos por gradiente de densidad de cloruro de cesio, primero estratifiquen dos mililitros de cuatro soluciones diferentes de cloruro de cesio en tubos de ultracentrífuga de poliallomertro para un rotor SW 41 y agregue 3,5 mililitros de la suspensión del fago a cada tubo. El cloruro de cesio es tóxico.Adoptar siempre los procedimientos de seguridad adecuados al manipular y desechar este compuesto. Cuando se hayan cargado todos los tubos, coloque los tubos en el rotor teniendo cuidado de que los tubos estén equilibrados. Y centrifugar las muestras durante dos horas a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados.Al final de la centrifugación, utilice una jeringa con una aguja de calibre 19 para aspirar la capa blanca entre la D es igual a 1.5 y la D es igual a 1.4 regiones de densidad. Y transfiera las suspensiones a nuevos tubos de poliallomer tamaño SW 60. Centrifugar las suspensiones durante al menos 16 horas a 150.000 veces g y cuatro grados centígrados.Y transfiera las bandas visibles a tubos de diálisis con un límite de 6.000 Dalton. A continuación, dializar las muestras recogidas dos veces contra 500 mililitros de agua durante 20 minutos por diálisis y durante la noche contra 500 mililitros de tampón de cloruro de sodio Tris. A la mañana siguiente, filtre el material de fagos resultante con un filtro de poro de 0,22 micromestros y almacene el stock en cuatro grados centígrados.En el día de la micro inyección diluir dos soluciones de stock de morfolo morpholinos micromolar en agua estéril a una concentración final de 0,25 picomolar por embrión para obtener una solución de cinco microlitro morpho injectionlino. Y añadir 0,5 microlitros de fenol rojo a cada solución. A continuación, utilice una micropipeta de 20 microlitrotros con una punta de carga de gel fino para cargar una aguja de micro inyección con todo el volumen de solución mixta de morfolino y fije la aguja a un micro manipulador conectado a un soporte bajo un microscopio estereoreo.Luego, con una o dos células, embriones de peces cebra dispuestos en un portaobjetos de vidrio colocado dentro de una placa Petri de 96 milímetros de diámetro, penetrar la tarea y la yema con la punta de la aguja de inyección micro e inyectar dos nanolitros de la mezcla de morlino en el embrión. A las 26 horas después de la fertilización, cargue una aguja de micro inyección con aproximadamente cinco microlitros de P.aeruginosa inoculum e inserte la aguja dorsalmente hasta el punto de partida del conducto de Cuvier en el que el conducto comienza a extenderse sobre el saco de yema. Inyectar de uno a tres nanolitros del inóculo PAO1 en el embrión asegurándose de que el volumen se expande directamente dentro del conducto y entra en la circulación.Después de la inyección, transfiera el embrión a uno de los dos nuevos platos de Petri que contengan un medio E3 fresco complementado con fenitmiourea durante una incubación de 30 minutos o tres horas a 28 grados centígrados. A continuación, cargue una aguja de micro inyección con aproximadamente cinco microlitros del cóctel de fagos y fije la aguja al microinyector. A continuación, inyectar de uno a tres nanolitros de cóctel de fago en el conducto de Cuvier de cada embrión previamente inyectado con bacterias y colocar los embriones en uno de los dos nuevos platos de Petri que contienen un medio E3 fresco complementado con fenitmiourea a 28 grados Celsius.A las cuatro horas después de la infección, utilice una pipeta de plástico para transferir un embrión anestesiado a un plato de fondo de vidrio. Y llene el plato con una solución de agarosa caliente de punto de fusión bajo. Cuando la agarosa esté fría, llene suavemente el plato con E3 medio complementado con solución anestésica.Coloque el plato debajo del microscopio estéreo y utilice una punta de pipeta para colocar el embrión en la orientación deseada. A continuación, coloque el plato bajo un microscopio estéreo fluorescente con un filtro fluorescente para bacterias positivas de GFP durante un máximo de 18 horas después de la infección e imagine el embrión para la progresión de la expresión de GFP a las nueve, 14 y 18 horas después de la infección. Para determinar la carga bacteriana a las ocho horas posteriores a la infección, transfiera 15 embriones microinyecizados anestesiados a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y reemplace la solución anestésica por 300 microlitros de 1%Triton X-100 en PBS.Pase las agujas a través de la aguja estéril de calibre 27 de una jeringa de insulina al menos 15 veces para homogeneizar los embriones. Y preparar las diluciones en serie del homogeneato transfiriendo 100 microlitros de la mezcla resultante a 900 microlitros de PBS estériles por dilución. Para seleccionar la cepa P.aeruginosa resistente a la ampicilina natural, placa 10 microlitros de las diluciones sobre el agar LB complementado con ampicilina y incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente cuenta el número de colonias. Permitir el cálculo del número total de unidades formadoras de colonias y el número medio de unidades formadoras de colonias por embrión infectado. Para evaluar la letalidad de la puntuación de la infección por P.aeruginosa, los embriones inyectados a las 20 horas después de la infección bajo un microscopio estéreo contando el número de embriones blancos opacos muertos.A continuación, calcule la concentración letal media 50 dosis de P.aeruginosa que resultó en la muerte del 50% de los embriones inyectados a las 20 horas después de la infección. Para validar el fenotipo de fibrosis quística se puede evaluar la posición deteriorada de órganos internos como el hígado cardíaco y el páncreas. La carga bacteriana se reduce mediante la terapia de fagos en embriones de fibrosis quística infectados con P.Aeruginosa.En 48 horas después de la fertilización, los embriones de fibrosis quística infectados con la bacteria P.Aeroginosa positiva de la GFP, una 30 unidades formadoras de colonias por dosis embrionaria demuestra una letalalidad del 50% a las 20 horas posteriores a la infección. La terapia de phage es igualmente eficaz a las 20 horas después de la infección cuando se administra 30 minutos o siete horas después de la inyección bacteriana. Aquí, se muestra una fibrosis quística y un embrión inyectado por P.Aeruginosa positivo A.Aeruginosa a las cuatro, nueve, 14 y 18 horas después de la infección.Por el contrario, la fibrosis quística más P.Aeruginosa más el embrión inyectado de fago demuestra una fluorescencia reducida debido a la acción del fago contra las bacterias. La respuesta inflamatoria generada por la infección por P.aeruginosa en embriones de fibrosis quística aumenta significativamente según lo revelado por la expresión de las citoquinas proinflamatorias, TNF alfa e interleucina 1 beta después de la inyección de P.aeruginosa en comparación con el control del pez cebra inyectado. Sin embargo, la expresión de ambas citoquinas inflamatorias se reduce en los animales co-inyectados de colistos de fagos.Los fagos deben purificarse cuidadosamente para eliminar cualquier endotoxina contaminante que pueda conservarse durante la preparación. Las preparaciones de fagos se pueden analizar mediante microscopía electrónica para evaluar la morfología del virión. Sería interesante probar si la infección en pacientes humanos por bacterias distintas de pseudomonas aeruginosa se puede curar con terapia de fagos en el modelo de peces cebra de fibrosis quística.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

El video muestra la técnica de terapia con fagos dirigida a la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra con fibrosis quística. La terapia con fagos disminuye eficazmente la carga bacteriana y mitiga las respuestas inmunitarias proinflamatorias en los embriones de pez cebra con FQ infectados con bacterias, lo que reduce la letalidad de los embriones con FQ.

Una terapia con fagos contra la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra

Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Se demuestran modelos de infección sistémica y localizada del pez cebra por el virus de la influenza A humana. Utilizando un modelo de infección sistémica, el pez cebra se puede utilizar para detectar medicamentos antivirales. Utilizando un modelo de infección localizada, el pez cebra puede utilizarse para caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Este protocolo describe el uso de hisopos de colector de aceite y análisis de lodos de sistemas de pez cebra, que conduce a aumento de detección en comparación con el uso de centinelas para detectar patógenos como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp.,  Pseudocapillaria tomentosa. También se propone un sistema para controlar la p. tomentosa huevos en cuarentena.

Proyección ambiental de hydrophila de la Aeromonasy Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa en los sistemas de pez cebra

Aquí se describe un protocolo para la inmunización del adulto pez cebra (Danio rerio) con una vacuna de ADN y demostrar la validación de un evento de éxito de la vacunación. Este método es adecuado para la investigación preclínica de candidatos vacunales en varios modelos de infección.

Inmunización de pez cebra adulto para la evaluación preclínica de vacunas basadas en ADN

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para generar y solucionar problemas de xenoinjertos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) humana a partir de líneas celulares y material fresco del paciente en embriones de pez cebra inmunosuprimidos transitoriamente, junto con pautas para la evaluación de la respuesta a los medicamentos mediante citometría de flujo. La tubería experimental también se puede adaptar para tumores sólidos.

Predicción rápida de la respuesta a fármacos in vivo mediante injertos de células de leucemia en embriones de pez cebra

En la actualidad hay una falta de modelos in vivo susceptibles de cribado de fármacos contra infecciones bacterianas crónicas. En este trabajo se describe un protocolo para la infección de heridas por un aislado clínico de Pseudomonas aeruginosa para generar una infección persistente en larvas de pez cebra.

Modelado de la infección persistente por Pseudomonas aeruginosa en larvas de pez cebra heridas

Aprende a preparar y administrar un cóctel de fagos contra Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra. Este método permite evaluar in vivo la eficacia de la terapia de fagos para contrarrestar infecciones bacterianas.

Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística (Video) | JoVE Journal

Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística

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