2D-HELS MS Seq: Un método general basado en LC-MS para la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN con diferentes modificaciones de nucleótidos
10 de julio de 2020
Aquí, describimos un protocolo detallado para un método de secuenciación basado en LC-MS que se puede utilizar como método directo para secuenciar ARN corto (<35 nt por ejecución) sin un intermedio de ADNc, y como método general para secuenciar diferentes modificaciones de nucleótidos en un solo estudio con precisión de una sola base.
Este protocolo cubre todos los pasos esenciales necesarios cuando se utiliza el nuevo método desarrollado para secuenciar directamente el ARN, independientemente de si la muestra de ARN es monocatenaria, mixta o modificada. El método no se ve afectado por el error enzimático o la complementariedad de bases. Proporciona un flujo de trabajo directo y una solución general que permite secuenciar diferentes modificaciones de ARN simultáneamente en lugar de una modificación específica a la vez.
Esta tecnología puede convertirse en una herramienta de diagnóstico para determinar segmentos de ARN característicos para relacionarlos con enfermedades humanas y una herramienta precisa para estudiar las modificaciones del ARN a nivel epitranscriptómico. El método no se basa en ningún método de secuenciación anterior. En cambio, es un enfoque completamente nuevo, y nuestro objetivo es convertirlo en el método de referencia para secuenciar cualquier ARN modificado.
Algunas partes de este protocolo contienen aspectos críticos que se pueden transmitir con mayor precisión mediante una demostración visual, como el etiquetado del extremo 3' de la adquisición de datos de RNA LC-MS y el análisis de datos mediante el software MassHunter. Demostraré este procedimiento y configuraré el LC-MS y mediré nuestras muestras de ARN. Para realizar una reacción de etiquetado en un solo paso, combine 2 microlitros de 150 micromolares de AppCp-biotina, 3 microlitros de tampón de reacción de ligasa 10x, 1,5 microlitros de muestra de ARN de 100 micromolares, 3 microlitros de DMSO anhidro, 10 unidades de ARN ligasa T4 y 19,5 microlitros de agua tratada con DEPC para un volumen total de 30 microlitros.
Incubar la reacción durante la noche a 16 grados centígrados, luego realizar la purificación en columna de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Después de dividir el ARN en tres alícuotas y agregar un volumen igual de ácido fórmico, incube las reacciones a 40 grados centígrados. Una vez finalizada cada reacción, congele inmediatamente la muestra en hielo seco para apagar la degradación del ácido.
Utilice un concentrador de vacío centrífugo para secar la muestra durante aproximadamente 30 minutos. Vuelva a suspender las muestras secas en 20 microlitros de agua tratada con DEPC y combínelas. Almacene las muestras a 20 grados centígrados hasta la medición de LC-MS.
Transfiera la muestra de ARN al vial de muestra LC-MS después de preparar las fases móviles. Cada inyección debe contener de 100 a 400 picomoles de ARN y 20 microlitros. Después de adquirir los datos, utilice el flujo de trabajo de extracción de características moleculares para extraer información de compuestos, incluida la masa, el tiempo de retención, el volumen y la puntuación de calidad.
Utilice el formato de datos de centroide en configuraciones de moléculas pequeñas. Establezca la altura del pico en al menos 100, pero menos de 1.000, y la puntuación de calidad en al menos 50. Finalmente, exporte los datos como un archivo de Excel.
La separación de la escalera 3' de la escalera 5' y otros fragmentos no deseados se muestra aquí en un gráfico de tiempo de retención de masa en 2D. También es posible secuenciar muestras mezcladas que contienen dos cadenas de ARN de diferentes longitudes con una etiqueta de biotina 5'en cada ARN. Para diferenciar la uridina de una pseudouridina, el ARN se trató con CMC, que convierte una pseudouridina en un aducto de CMC-pseudouridina.
El aducto tiene una masa diferente en una uridina y se puede diferenciar en el 2D-HELS MS Seq. El perfil de HPLC del producto bruto de la reacción que convierte la pseudouridina en su aducto CMC se utilizó para calcular el porcentaje de conversión, que fue del 42%Una mezcla de cinco hebras de ARN diferentes se secuenció mediante el enfoque 2D-HELS MS Seq con marcaje de 3'end y se normalizó para una mejor visualización de múltiples secuencias de ARN. Sin la normalización, los códigos de letras para las secuencias de los cinco ARN se amontonarían.
Al intentar este procedimiento, configure la reacción de etiquetado con cuidado para obtener un alto rendimiento de muestras de ARN marcadas. Además, controle cuidadosamente el tiempo de degradación para crear escaleras de masa confiables y recoja la cantidad máxima de muestras secas con 20 microlitros de agua. Una pregunta que se puede hacer después de realizar este protocolo es cómo aumentar el ancho, la longitud y el rendimiento del método de secuenciación.
Un mejor algoritmo y un instrumento más avanzado con mayor resolución y sensibilidad pueden ayudar. Después del desarrollo de este protocolo, fue posible secuenciar directamente una gama más amplia de muestras de ARN que contenían nucleótidos canónicos y modificados sin ningún error relacionado con la secuenciación de ARN basada en CDA.
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Descripción general
Este artículo presenta un novedoso método de secuenciación basado en LC-MS para ARN corto que elimina la necesidad de un intermediario de ADNc. El protocolo permite la secuenciación simultánea de diversas modificaciones del ARN con precisión de una sola base.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Secuenciación de ARN
- Epitrancriptómica
- Biotecnología
Antecedentes
- Los métodos actuales de secuenciación de ARN suelen depender de intermediarios de ADNc.
- Los errores enzimáticos pueden afectar la precisión de la secuenciación.
- La secuenciación simultánea de modificaciones del ARN es un desafío.
- Comprender las modificaciones del ARN es fundamental para estudiar enfermedades humanas.
Objetivo del estudio
- Introducir un método de secuenciación directa para ARN.
- Permitir el estudio de múltiples modificaciones del ARN en un solo análisis.
- Proporcionar una herramienta confiable para la investigación epitranscriptómica.
Métodos Utilizados
- Técnica de secuenciación basada en LC-MS.
- Secuenciación directa de ARN de cadena sencilla, mixto o modificado.
- Eliminación del paso de síntesis de ADNc.
- Flujo de trabajo diseñado para alta precisión y exactitud.
Resultados principales
- El método secuencia con éxito ARN corto (<35 nt) sin ADNc.
- Se logró la detección simultánea de diversas modificaciones del ARN.
- La técnica demostró resistencia frente a errores enzimáticos.
- Se identificaron aplicaciones potenciales en diagnósticos para enfermedades humanas.
Conclusiones
- Este nuevo método de secuenciación podría convertirse en un estándar para el análisis de ARN modificado.
- Ofrece un enfoque integral para estudiar las modificaciones del ARN.
- El protocolo tiene implicaciones para la investigación futura en biología del ARN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de secuenciación de ARN basado en LC-MS permite la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN modificadas sin síntesis de ADNc, abordando un cuello de botella clave en la validación de dianas epitranscriptómicas. Al proporcionar datos cuantitativos de secuenciación con resolución de modificaciones, apoya el descubrimiento temprano de biomarcadores basados en ARN y la reducción mecanicista de riesgos de oligonucleótidos terapéuticos. El enfoque mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes al ofrecer resultados específicos de modificaciones y confirmados por secuencia, directamente aplicables a los flujos de trabajo de cribado y desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la secuenciación directa de modificaciones del ARN, como la pseudouridina y la 5-metilcitosina, en contextos nativos.
- Valor operativo: Proporciona una solución general para la detección simultánea de nucleótidos canónicos y modificados, reduciendo la necesidad de ensayos secuenciales específicos para cada modificación.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en los blancos mediante la correlación directa del tiempo de retención con la masa de las bases nitrogenadas modificadas, facilitando la asignación precisa de las modificaciones a sitios específicos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera salidas cuantitativas de masa y tiempo de retención que permiten la discriminación fiable de secuencias de ARN en mezclas de hasta 12 oligonucleótidos distintos.
- Valor operativo: Proporciona datos reproducibles y listos para normalización, compatibles con sistemas estándar de LC-MS de alta resolución, lo que favorece la estandarización de ensayos en paneles de ARN cortos.
- Escalabilidad: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para cribados posteriores al producir estándares de ARN con secuencias verificadas y patrones de modificaciones definidos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Apoya la verificación de secuencias de oligonucleótidos de ARN terapéuticos modificados, vinculando las modificaciones de la fase de descubrimiento con la evaluación de candidatos preclínicos.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite la detección de cambios de masa inducidos por modificaciones (por ejemplo, aducto de CMC-pseudouridina) para distinguir la señal real de artefactos de degradación en muestras complejas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Proporciona confirmación de secuencia sin sesgo enzimático, reduciendo los falsos negativos en el cribado de modificaciones y mejorando la fiabilidad de las decisiones de avance o interrupción.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano como una herramienta de secuenciación inicial para el análisis de ARN guiado por hipótesis, contribuyendo a la identificación de candidatos al confirmar la secuencia y el estado de modificación de los ARN sintéticos o endógenos antes del cribado funcional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al proporcionar evidencia directa de la co-ocurrencia de secuencias y modificaciones del ARN en mezclas nativas o sintéticas.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante la generación de escalas de masa-tiempo de retención que sirven como referencias cuantitativas para el perfilado de modificaciones o degradación del ARN inducidas por compuestos.
- Análisis: Genera datos de características moleculares basados en centroides (masa, tiempo de retención, volumen, puntuación de calidad) exportables a Excel, lo que posibilita la comparación entre condiciones y la evaluación estadística de la estabilidad de las modificaciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar estándares de ARN modificado con secuencia verificada, adecuados para la alineación de biomarcadores y la validación funcional en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable basada en LC-MS para la secuenciación rápida de variantes de ARN corto (<35 nt), reduciendo la dependencia de secuenciación subcontratada y acelerando los ciclos internos de cribado de modificaciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al eliminar errores mediados por cDNA y permitir la observación directa de firmas de masa específicas de modificaciones.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante etiquetado estandarizado, detención ácida y pasos de normalización que minimizan la variabilidad entre corridas en mezclas complejas de ARN.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir el secuenciamiento interno de ARN modificado, reduciendo la dependencia de proveedores externos y acelerando los ciclos de iteración en la optimización de candidatos principales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos inequívocos de secuencia y modificación, disminuyendo la eliminación tardía debido a heterogeneidad no detectada del ARN o errores de anotación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ARN, operación de LC-MS y extracción de características moleculares basada en MassHunter para una interpretación precisa de los datos.
- Depende del acceso a sistemas de LC-MS de alta resolución capaces de adquirir datos en modo centroide con umbrales definidos de altura de pico (100–1000) y puntuación de calidad (≥50).
- Necesita la estandarización entre equipos de la eficiencia de etiquetado, los tiempos de degradación y los protocolos de normalización para garantizar la generación consistente de escaleras de masas entre diferentes usuarios y plataformas.
- Requiere consideraciones de adaptación al extenderse más allá del ARN corto (<35 nt) o a muestras biológicas complejas, pendiente de futuras mejoras en algoritmos e instrumentos.
- Incluye limitaciones prácticas como las actuales restricciones de capacidad de procesamiento y la dependencia de la optimización manual de las reacciones de etiquetado (por ejemplo, AppCp-biotina, ligasa T4, DMSO) para maximizar el rendimiento y la resolución de la escalera.
