Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

El protocolo actual analiza un método asequible y sencillo para el rastreo neuroanatómico y electrofisiológico combinado de neurocircuitos in vivo. La técnica permite el mapeo de terminales adjuntos de una población de neuronas específica a un sitio objetivo. Asimismo, el mapa anatómico de estos terminales puede ser verificado por estimulación optogenética durante el registro extracelular en el sitio diana.

Este protocolo se puede aplicar para estudiar múltiples circuitos neuronales asociados con la función sensorial, motora y cognitiva. La realización de este procedimiento requiere algunos conocimientos de cirugía estereotáxica en roedores y el manejo de electrodos neurales delicados. La conexión del sistema de grabación para evitar ruido en las grabaciones.

La demostración visual destaca los pasos básicos en la configuración de un sistema LED asequible para la optogenética in vivo. Además, muestra cómo conectar el amplificador con el controlador LED para la grabación y estimulación sincronizadas en un mouse anestesiado. Coloque una almohadilla térmica en el marco estereotáxico de modo que el cuerpo del ratón esté acostado sobre él, lo que ayudará a mantener su temperatura corporal durante todo el procedimiento, luego fije suavemente la cabeza en el aparato estereotáxico.

Prepare el área quirúrgica limpiándola primero con una solución de yodo y luego con alcohol para eliminar el yodo. A continuación, aplique lidocaína tópica para bloquear la sensación en el cuero cabelludo. Luego, con un bisturí, haga una incisión en la línea media que se extienda desde la región frontal hasta la occipital.

Para el área tegmental ventral o la inyección de VTA, coloque una jeringa de aguja ultrafina de punta roma en las coordenadas negativas de 3,08 milímetros anterior posterior y lateral medial de 0,5 milímetros en relación con el bregma. Use una herramienta de perforación para perforar un agujero de un milímetro en el cráneo en la coordenada marcada. Siga las instrucciones del fabricante para fijar el soporte de la jeringa en un micromanipulador y llene la jeringa con agua destilada doble para limpiar y probar el flujo de líquido.

A continuación, dispense el agua para comprobar el flujo de la jeringa. Descongele las alícuotas de los virus adenoasociados o el cóctel de AAV en hielo. Llene la jeringa montada con 1.000 nanolitros de solución de AAV y dispense 10 nanolitros de la solución para confirmar el flujo del líquido.

Utilice el micromanipulador para bajar la aguja hasta el lugar de inyección e inyectar de 600 a 800 nanolitros de AAV en el VTA, suministrando la solución a 60 nanolitros por minuto. Tres semanas después de la inyección de AAV, fije la cabeza del animal en un marco estereotáctico como se describió anteriormente y realice una craneotomía para exponer la duramadre. Use una herramienta de perforación para extraer parte del hueso parietal.

Bajo un microscopio de disección, use una punta de aguja doblada de calibre 27 para extirpar la duramadre expuesta, teniendo cuidado de no separar la delicada cubierta de cáscara y los tejidos corticales en esta área. Aplique gotas de líquido cefalorraquídeo artificial sobre el área de la craneotomía para prevenir la sequedad. Perfore un orificio en el hueso occipital para sujetar el tornillo de tierra y conectar un cable de tierra de acero inoxidable.

Antes de bajar la cánula, conecte el cable de fibra óptica a una fuente LED acoplada a fibra. Baje la fibra óptica de 400 micrómetros de diámetro en el VTA en las coordenadas de AP negativo 3,08 milímetros y ML 0,5 milímetros. Con un micromanipulador, coloque los sitios de contacto de los electrodos en la capa de la celda piramidal del CA1.

Para sincronizar el pulso de luz con la grabación neuronal, conecte el controlador LED y la importación digital del controlador de grabación a un emisor de impulsos lógicos de transistor-transistor con un divisor BNC. Ajuste la perilla para determinar la intensidad efectiva que puede generar una respuesta sin producir artefactos fotoeléctricos y conecte la tierra del cráneo a la tierra del adaptador. Conecte la etapa principal del preamplificador al controlador de grabación a través de un cable de interfaz periférica serie y verifique las luces de color LED en los puertos del controlador de grabación.

Los LED verdes y amarillos indican el voltaje adecuado en la placa amplificadora conectada y el LED rojo indica un control de etapa principal de software en funcionamiento. Después de iniciar el software, seleccione el formato de archivo de datos y cambie el nombre del archivo. Cambie al puerto para la etapa principal conectada y haga clic en deshabilitar todo en el puerto si el electrodo tiene menos canales que la etapa principal.

Seleccione el número adecuado de canales que se mostrarán en la pantalla. Para capturar la marca de tiempo TTL para la grabación neuronal sincronizada y la marca de tiempo activada por pulso de luz, haga clic en las importaciones digitales y habilite digital en cero uno. Esto debe corresponderse con la conexión BNC en las importaciones digitales del amplificador.

Ajuste la escala de tiempo y la escala de voltaje para una visualización de forma de onda adecuada y seleccione la frecuencia de muestreo, teniendo en cuenta que una frecuencia de muestreo y un número de canales más altos aumentarán el tamaño del archivo. A continuación, configure el ancho de banda del amplificador para la grabación de una sola unidad. Aquí se utilizó una frecuencia de corte de 300 a 5.000 hercios.

Para obtener un sonido de pico, haga clic en audio de salida analógica y habilite el puerto analógico. A continuación, ajuste la ganancia y el silenciador para obtener un sonido óptimo. Para sincronizar la grabación del amplificador y el tren de pulsos de luz, haga clic en la pestaña de visualización y habilite el marcador de espectáculo.

Cambie al canal apropiado que corresponda con la conexión BNC y vuelva a inspeccionar los puertos para asegurarse de que los canales de grabación y la entrada digital estén habilitados para capturar picos neuronales y marcas de tiempo de pulso de luz. Haga clic en el osciloscopio de picos para ver las formas de onda que constituyen el tren de picos registrado continuamente. Utilice el ratón para establecer el umbral de las formas de onda que se mostrarán.

A continuación, inspeccione el RMS para determinar el nivel de ruido de la grabación. La expresión del virus adenoasociado se verificó mediante imágenes de inmunofluorescencia de EYFP en el área tegmental ventral de ratones 21 días después de la inyección. Las imágenes de fluorescencia también se utilizaron para detectar proyecciones de glutamato VTA presináptico en las capas DG, CA3 y CA1 del hipocampo.

Una vez que se detectó la actividad de voltaje extracelular, se registró la actividad basal durante aproximadamente 10 minutos antes de activar el pulso de luz a la frecuencia deseada. Esto permitió comparar las tasas de disparo o ráfaga de las neuronas putativas CA1 antes y después de la fotoestimulación con glutamato VTA. Para respaldar este resultado, la comparación estadística de las tasas de disparo de la red CA1 antes y después de la fotoestimulación reveló un aumento significativo para el período posterior a la estimulación.

El análisis posterior del tren de ráster para detectar ráfagas también mostró un aumento de la tasa de ráfagas para las neuronas piramidales putativas CA1 después de la fotoestimulación. La respuesta a la fotosimulación se identificó mediante la fluorescencia de las expresiones reporteras de AAV en los sitios de estímulo. Además, la descripción de debe correlacionarse con el sitio de grabación para las unidades putativas que responden.

Este método también se puede realizar en ratones despiertos que realizan tareas conductuales. En este caso, se deben utilizar sondas implantables crónicas y cánula de fibra óptica. Esta técnica permitirá un rastreo robusto de los neurocircuitos a través de una combinación de la distribución de terminales presinápticas en el sitio objetivo y la modulación de las terminales presinápticas para detectar la respuesta del sitio objetivo in vivo.