Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal
13 de junio de 2020
Aquí se presentan métodos para comprender los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS). Las líneas celulares de cáncer colorrectal muestran muertes celulares cuando se tratan con LCFS en cultivos 3D. El proceso de generación de esferoides se puede optimizar dependiendo del andamio y los métodos de análisis presentados son útiles para evaluar las vías de señalización involucradas.
Este protocolo se ha optimizado para facilitar la investigación del efecto anticancerígeno del sobrenadante libre de células Lactobacillus en múltiples tipos de esferoides de células de cáncer de colon. Esta técnica es el primer enfoque que investiga los efectos anticancerígenos de LCFS en esferoides de cáncer de colon en condiciones de mimetismo in vivo. Comience colocando una placa de agar MRS esterilizada en autoclave en una cámara anaeróbica de hidrógeno a 37 grados Celsius con 20 partes por millón de oxígeno e inoculando la placa con caldo bacteriano de Lactobacillus recién descongelado.
Agregue de dos a tres mililitros de caldo MRS, suplementado con l-cisteína al tubo y selle el tubo con el tapón de caucho butílico y la tapa del tubo. A continuación, utilice un bucle para recoger una sola colonia y colóquela en un tubo de cultivo de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de PBS. Resuspenda la colonia homogéneamente dentro de la solución salina y cargue toda la suspensión bacteriana en una jeringa de un mililitro.
Inserte la aguja en el centro de la tapa del tubo de cultivo y administre la colonia en el medio. Coloque el cultivo en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 200 revoluciones por minuto. Después de dos días, mida el OD620 del cultivo en un espectrofotómetro.
Cuando el OD620 sea igual a dos, sedimente las bacterias por centrifugación y lave la pastilla de bacterias con PBS. Después de la segunda centrifugación, vuelva a suspender las bacterias en cuatro mililitros de RPMI 1640, suplementado con un 10% de suero fetal bovino sin antibióticos y coloque las bacterias en la incubadora agitadora durante cuatro horas a 100 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, granule las bacterias por centrifugación y filtre estérilmente el sobrenadante recuperado a través de un colador de 0,22 micras para un almacenamiento de menos 80 grados centígrados.
Para preparar líneas celulares de cáncer colorrectal para la formación de esferoides, cultive las células de interés como monocapas en placas de Petri de 100 milímetros en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80%, lavar los cultivos dos veces con cuatro mililitros de PBS por lavado antes de separar las células con un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25% por placa. Después de dos minutos, verifique si hay disociación bajo un microscopio óptico.
Si las células se han desprendido, neutralice la reacción enzimática con cinco mililitros de medio de crecimiento. Recoja las células por centrifugación en un tubo cónico de 15 mililitros por cultivo celular y vuelva a suspender suavemente los gránulos con tres mililitros de medio de crecimiento por tubo. A continuación, cuente el número de células viables por exclusión de azul de tripano.
Después de contar, diluya las células a una o dos veces 10 a la quinta célula por mililitro de concentración en medio fresco y agregue metilcelulosa a las células hasta una concentración final del 0,6%. Transfiera las células a un depósito estéril y utilice una pipeta multicanal para dispensar 200 microlitros de células a cada pocillo de una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultrabaja. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante 24 a 36 horas antes de comprobar la formación de esferoides mediante microscopía óptica.
Para el tratamiento de LCFS, diluya en serie la solución madre de LCFS descongelada preparada en un medio de crecimiento fresco a concentraciones de 25, 12,5 y 6% y use una pipeta de 200 microlitros para eliminar cuidadosamente la mayor cantidad posible de sobrenadante de cada pocillo de los cultivos de líneas celulares de cáncer colorrectal en placas. Luego, agregue suavemente 200 microlitros de medio de crecimiento suplementado con LCFS por triplicado a cada conjunto de células cancerosas y devuelva la placa a la incubadora durante 24 a 48 horas adicionales. Una concentración de metilcelulosa del 0,6% transforma las células de la línea celular cancerosa analizadas en esferoides compactos, lo que indica que se pueden generar esferoides a partir de varios tipos de cáncer colorrectal utilizando este protocolo.
Los esferoides cultivados con un 25% de LCFS presentan superficies alteradas y una disminución de la viabilidad celular en función de la dosis. De hecho, las células cocultivadas con LCFS muestran niveles más altos de expresión de yoduro de propidio en comparación con las células de control viables. El análisis de PCR con transcriptasa inversa, Western blot y el análisis de anexina V/7-AAD por citometría de flujo también se pueden realizar para evaluar los efectos de los LCFS en la apoptosis de las células cancerosas.
Asegúrese de manipular los esferoides con cuidado al retirar el medio de crecimiento, ya que los esferoides pueden romperse fácilmente, lo que hace imposible observar el efecto del tratamiento con LCFS. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar ensayos de viabilidad celular, PCR cuantitativa en tiempo real, Western blot y análisis FACS para caracterizar el efecto anticancerígeno de LCFS con mayor detalle.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para investigar los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS) sobre esferoides de cáncer de colon. El estudio optimiza la generación de esferoides y evalúa las vías de señalización implicadas en la muerte celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación del cáncer
Antecedentes
- Se conoce a Lactobacillus por sus posibles beneficios para la salud.
- Los sobrenadantes libres de células pueden contener compuestos bioactivos.
- El cáncer colorrectal sigue siendo un desafío importante para la salud.
- Los cultivos celulares en 3D imitan mejor las condiciones in vivo.
Objetivo del estudio
- Explorar los efectos anticancerígenos de LCFS en esferoides de cáncer de colon.
- Optimizar las técnicas de generación de esferoides.
- Analizar las vías de señalización implicadas en los efectos observados.
Métodos Utilizados
- Preparación de placas de agar MRS en una cámara anaeróbica.
- Inoculación de placas con cepa bacteriana de Lactobacillus.
- Cultivo de bacterias en caldo MRS suplementado con l-cisteína.
- Recolección y resuspensión de colonias bacterianas para el tratamiento.
Resultados Principales
- Las líneas celulares de cáncer colorrectal exhibieron muerte celular cuando fueron tratadas con LCFS.
- Los métodos optimizados de generación de esferoides mejoraron los resultados experimentales.
- Las vías de señalización implicadas en la muerte celular se analizaron de manera efectiva.
- El estudio proporciona un enfoque novedoso para la investigación en tratamientos contra el cáncer.
Conclusiones
- El LCFS muestra potencial como agente anticancerígeno.
- Las técnicas de cultivo 3D son esenciales para una modelización precisa.
- Se necesita más investigación para comprender completamente los mecanismos implicados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite a los equipos de I+D de biofármacos evaluar los sobrenadantes derivados de probióticos por su actividad anticancerígena en modelos fisiológicamente relevantes de cáncer colorrectal en 3D. Al utilizar el sobrenadante libre de células de Lactobacillus fermentum (LCFS) en cultivos estables de esferoides, el método facilita la desvinculación mecanicista de candidatos de productos naturales y mejora la confianza predictiva en los esfuerzos de validación de dianas. El enfoque conecta el cribado en fase de descubrimiento con relevancia traslacional mediante la modelización de las interacciones del microentorno intestinal que influyen en la viabilidad de las células cancerosas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas respecto a los metabolitos microbianos y su impacto en las vías de muerte celular en el cáncer colorrectal.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mediante lecturas de viabilidad dependientes de la dosis en modelos de esferoides tridimensionales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al vincular la apoptosis inducida por LCFS con marcadores moleculares medibles mediante qRT-PCR, inmunotransferencia (Western blot) y citometría de flujo (FACS).
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos posteriores mediante la formación reproducible de esferoides en placas de adherencia ultrabaja.
- Resultados cuantitativos: Genera datos de respuesta frente a la dosis (25%, 12,5%, 6% de SLCF) que permiten la estimación de la IC50 y la modelización de relaciones estructura-actividad.
- Escalabilidad: Utiliza un formato de 96 pocillos compatible con manipulación automática de líquidos y cribado de viabilidad de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la fisiopatología del cáncer colorrectal mediante esferoides derivados de pacientes o de líneas celulares establecidas que reflejan la arquitectura tumoral in vivo.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica al mantener condiciones de cultivo 3D consistentes a lo largo de las etapas del ensayo.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Facilita criterios de avance/no avance basados en la inducción de apoptosis y umbrales de viabilidad observados en cultivos co-culturales de esferoides.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano tras la identificación del blanco y antes de la optimización del fármaco líder, proporcionando un sistema relevante para la enfermedad para evaluar los sobrenadantes bioactivos procedentes de fuentes microbianas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos microbianos contra el cáncer y la aclaración de vías en modelos 3D que predicen mejor las respuestas in vivo.
- Selección: Proporciona estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante protocolos estandarizados de formación de esferoides y tratamiento con LCFS.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes (viabilidad, marcadores de apoptosis) que facilitan la comparación estadística entre condiciones de tratamiento y líneas celulares.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad desde la selección basada en esferoides hasta la validación preclínica, preservando la fidelidad del cultivo 3D.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para seleccionar sobrenadantes de probióticos, extractos de alimentos fermentados o terapéuticos derivados del microbioma en múltiples tipos de cáncer.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los falsos positivos de los modelos en 2D y capturar efectos dependientes del microentorno.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de generación y tratamiento de esferoides, mejorando la reproducibilidad entre sitios y reduciendo la variabilidad del ensayo.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en intervenciones dirigidas al microbioma antes de estudios in vivo costosos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de productos naturales prometedores basada en la inducción de apoptosis y la respuesta a la dosis en modelos clínicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo bacteriano anaeróbico, manipulación de esferoides 3D y técnicas de ensayo de apoptosis (qPCR, WB, FACS).
- Depende de instrumentación que incluye cámaras anaeróbicas, incubadoras con agitación, espectrofotómetros y citómetros de flujo.
- Necesita estandarización entre equipos para garantizar la preparación consistente de LCFS y el control de calidad de los esferoides por parte de los equipos de microbiología y biología del cáncer.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otras cepas bacterianas o tipos de cáncer más allá de los modelos de cáncer colorrectal.
- Se ve limitado por la fragilidad de los esferoides durante el cambio de medio, lo que requiere un manejo cuidadoso para mantener la integridad estructural y obtener lecturas precisas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
