Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo
27 de abril de 2021
Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.
Este protocolo en hierbas medición continua de circuitos genéticos en E.coli y el cálculo de la variabilidad de la señal y la relación señal-ruido en células bacterianas individuales para evaluar el rendimiento del circuito. Las principales ventajas de esta técnica son que es fácilmente adaptable a diferentes cepas y laboratorios, requiere un entrenamiento mínimo y sin equipo especial, y es relativamente barato. El ruido es un papel importante en la determinación de la funcionalidad de los sistemas biológicos.
Actualmente, existe interés en construir circuitos genéticos a gran escala. Estos sistemas pueden ser inhibidos por el ruido Asegúrese de secar bien las muestras, para mantener esas almohadillas frías a cuatro grados Celsius durante el mayor tiempo posible, y para cortar y dividir las partes paciente y suavemente. Para preparar la bacteria para el análisis inocular una sola colonia de un cultivo de E.coli transfectado.
Por ejemplo, un circuito con un reportero GFP. En un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementarlo con los antibióticos relevantes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado.
Al final de la incubación, gire hacia abajo un mililitro de solución de dilución en una mini micro centrífuga de dos mililitros, y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución en un nuevo tubo de dos mililitros. Luego, incubar la cultura durante una hora con temblores antes de sembrar de 40 a 60 microlitros de esta suspensión en placas de cultivo M9. Para preparar la bacteria para el análisis, inocular una sola colonia de un cultivo de E.Coli transfectado.
Por ejemplo, un circuito con un reportero de GFP en un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementado con los antibióticos pertinentes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado. Al final de la incubación, gire un mililitro de solución de dilución en un mini tubo de micro centrífuga de dos mililitros y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución a un nuevo tubo de dos mililitros.
Luego incubar la cultura durante una hora con temblores. Para preparar placas de microscopio, mezcle 112,5 miligramos de agar de baja fusión con 40 miligramos de agar y un mililitro de 2% de ácido casamino en un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros. A continuación, añadir 8,92 mililitros de medio mínimo sobre los labios internos de un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros y microondas la solución resultante en ráfagas cortas de dos a tres segundos.
A continuación, ajuste el baño de agua a 55 grados Celsius. Cuando la solución esté clara, coloque el matraz Erlenmeyer de 25 mililitros en un baño de agua de 60 grados Celsius y deje que la solución del agar se enfríe hasta que su temperatura baje a unos 45 a 50 grados centígrados. Mientras el agar se enfría, limpie el banco de laboratorio con un 70% de etanol y sume un trozo de cinta de laboratorio en el banco limpiado.
Coloque un resbalón de cubierta de vidrio en la cinta y coloque un segundo resbalón de cubierta cerca. Agregue la solución de agar refrigerado a los antibióticos y la solución adecuados. Vierta 1,5 mililitros de solución recién preparada para gelear la solución en el resbalón de la cubierta colocado sobre la cinta y coloque el segundo resbalón de la cubierta en el gel, teniendo cuidado de evitar burbujas.
Devuelva el Erlenmeyer al baño de agua caliente y cubra los resbalones de la cubierta durante 20 minutos. Voltea los resbalones de la cubierta durante una hora de incubación a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, retire los resbalones de la cubierta del gel seco y corte una pequeña almohadilla de la agarose.
Durante la incubación, agregue seis gotas de microlitro de la suspensión bacteriana preparada en un plato de 35 milímetros y deje que las gotas se sequen durante al menos 15 a 30 minutos. A continuación, coloque cuidadosamente la almohadilla a la vez en una gota de bacterias y deje que las muestras se ajusten durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para colocar la cama de agar sin manchar la muestra, coloque cuidadosamente la almohadilla fría en la gota con suave roscado.
Para tomar imágenes de las muestras, retire el matraz del agua y deje que la solución de gel se enfríe a temperatura corporal. Vierta tres milímetros del gel sobre el perímetro de la placa de muestra. Cuando la agarose se haya solidificado, selle la placa con cinta adhesiva y utilice una aguja del calibre 25 para meter varios agujeros en la cinta.
Luego coloque la placa boca abajo a cuatro grados Celsius durante al menos 30 minutos para permitir que la agarose se solidifique completamente, evitando la mitosis celular. Dentro de las 24 horas, utilice un microscopio confocal de fluorescencia para localizar la muestra en el aumento más bajo e activar el sistema de enfoque automático del microscopio. Aplique aceite al objetivo adecuado y utilice el controlador de plataforma para mover la placa para extender cuidadosamente el aceite.
A continuación, vuelva a activar el enfoque automático y siga la sugerencia predeterminada de secciones transversales de paso Z para tomar imágenes del ejemplo. La E.coli debe aparecer como formas oblongas negras sobre un fondo blanco apagado. Y el rango dinámico de la luminancia debe mostrar un pico en su centro.
Los eventos de mitosis se pueden detectar primero mediante microscopía de fluorescencia después de 30 minutos. Aunque las células individuales pueden ser difíciles de detectar con baja magnificación. Los cultivos celulares bacterianos preparados con una relación de dilución incorrecta pueden demostrar un número inmutable de células, y las muestras preparadas sin sellado de placas pueden presentar una contracción excesiva, lo que resulta en una pérdida de enfoque.
Las células también pueden indentar el gel en su búsqueda de nutrientes, lo que resulta en el apilamiento de las células bacterianas uno encima del otro y comprometer la monocapa celular, evitando eficazmente la detección celular y la medición confiable de la señal fluorescente. Como sugieren estos datos, la etapa de celda en el ciclo de división no afecta al nivel de ruido, ya que diferentes rangos de área muestran la misma tendencia. Además, no se observa ningún cambio sustancial en la relación señal-ruido entre GFP y GFP superfoplicado, como ilustran estos datos representativos.
Al realizar este procedimiento, tenga cuidado de determinar la relación de dilución correcta para la cepa bacteriana utilizada para el experimento. La comparación de la relación señal-ruido de cada circuito regulado con esta línea base permite seleccionar el mejor circuito de rendimiento y puede revelar fenómenos interesantes
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Descripción general
Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la obtención de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y la cuantificación del comportamiento estocástico de circuitos génicos sintéticos. El protocolo permite la medición continua de circuitos genéticos en E. coli y evalúa el rendimiento del circuito mediante el cálculo de la variabilidad de la señal y la relación señal-ruido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Ingeniería Genética
- Imagenología de Células Vivas
Antecedentes
- El ruido afecta significativamente la funcionalidad de los sistemas biológicos.
- Existe un creciente interés en la construcción de circuitos génicos a gran escala.
- Las técnicas actuales a menudo requieren equipo especializado y capacitación.
- Este método es adaptable a diversas cepas y laboratorios.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la obtención de imágenes en vivo de células de E. coli.
- Analizar el comportamiento estocástico de circuitos génicos sintéticos.
- Evaluar el desempeño del circuito mediante análisis de señales.
Métodos Utilizados
- Inoculación de una colonia individual procedente de un cultivo de E. coli transfectado.
- Medición continua de circuitos genéticos.
- Cálculo de la variabilidad de la señal y de la relación señal-ruido.
- Adaptación del método para diferentes cepas y laboratorios.
Resultados principales
- La técnica es rentable y requiere una capacitación mínima.
- Proporciona información sobre el rendimiento de los circuitos genéticos.
- El ruido desempeña un papel fundamental en la funcionalidad del circuito.
- Las muestras deben manipularse con cuidado para mantener su integridad.
Conclusiones
- Este método mejora la comprensión de los circuitos genéticos sintéticos.
- Es una herramienta valiosa para investigadores en microbiología e ingeniería genética.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir la construcción de circuitos genéticos a gran escala.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación continua del ruido biológico en Escherichia coli mediante microscopía de lapso de tiempo permite una evaluación precisa del desempeño de circuitos genéticos sintéticos a nivel de célula individual. Esta capacidad es fundamental para reducir riesgos en diseños genéticos en etapas iniciales y optimizar constructos antes de avanzar hacia ensayos de alto rendimiento o estudios traslacionales. El método posibilita una confianza predictiva en las líneas de trabajo de biología sintética al proporcionar mediciones cuantitativas, reproducibles, del ruido y de la relación señal-ruido.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la robustez del circuito genético y la variabilidad de las vías en sistemas bacterianos vivos.
- Apoya la validación funcional de construcciones sintéticas mediante la cuantificación del ruido estocástico y la fidelidad de la señal.
- Facilita la predicción confiable en la selección y clasificación de circuitos candidatos para un desarrollo posterior.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas bacterianos validados para cribados posteriores mediante el establecimiento de métricas de señal y ruido de base.
- Normaliza salidas cuantitativas, como el coeficiente de variación (CV), para la comparación cruzada de diseños de circuitos.
- Permite la evaluación reproducible del rendimiento del circuito, apoyando el desarrollo escalable de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea las métricas de rendimiento del circuito sintético con los puntos de referencia establecidos del analizador de flujo para una continuidad traducible.
- Proporciona una reducción de riesgos mecanicista al revelar el comportamiento del circuito bajo agotamiento de nutrientes y estrés ambiental.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de la fiabilidad del circuito en condiciones fisiológicamente relevantes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y el desarrollo de ensayos, conectando el diseño de circuitos basado en hipótesis con la validación cuantitativa del rendimiento. Proporciona una plataforma reutilizable para la optimización iterativa y la evaluación comparativa de constructos sintéticos.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica el ruido genético y las relaciones señal-ruido para aclarar la función del circuito y la variabilidad biológica.
- Selección: Establece métricas cuantitativas y reproducibles para la selección de circuitos y la preparación de ensayos posteriores.
- Análisis: Proporciona coeficientes de variación y salidas de variabilidad de señal para comparaciones estadísticas robustas.
- Investigación Traducional: Alinea los datos de microscopía de célula individual con los estándares de citometría de flujo para una relevancia preclínica.
- Reutilización Empresarial: Un protocolo adaptable que soporta diversas cepas y laboratorios, permitiendo una aplicación amplia en el portafolio.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los flujos de trabajo de biología sintética.
- Valor operativo: Ofrece una medición estandarizada, reproducible y rentable del rendimiento de circuitos genéticos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos en los diseños de circuitos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de constructos sintéticos en diversos programas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos básicos de microbiología y familiaridad con la microscopía de fluorescencia.
- Necesita acceso a equipos de imagen estándar y herramientas computacionales para la cuantificación del ruido.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y adquisición de imágenes para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversas cepas de E. coli y constructos genéticos con modificaciones mínimas del protocolo.
- Las limitaciones prácticas incluyen el agotamiento de nutrientes, la deriva del enfoque óptico y la variabilidad ambiental que afecta el registro de imágenes a largo plazo.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Escherichia coli Preparation and Plasmid Construction
2:45
Microscope Plate Preparation
5:08
Microscopic Imaging
6:20
Results: Representative Continuous Time-Lapse Microscopy Escherichia coli Biological Noise Analysis
7:43
Conclusion
