Name: Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a medir el ruido biológico en Escherichia coli mediante microscopía de lapso de tiempo. Este método permite cuantificar la variabilidad de señal y la relación señal-ruido en circuitos genéticos sintéticos de células individuales.

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Agradecemos al Sr. Gil Gelbert (Facultad de Ingeniería Eléctrica, Technion) por ayudar con el código MATLAB. Agradecemos al Dr. Ximing Li (Facultad de Ingeniería Bio-médica, Technion) por ayudar con la prueba de este artículo. Esta investigación fue parcialmente apoyada por la Fundación de la Familia Neubauer y el Ministerio de Ciencia de Israel, subvención 2027345.

1. Preparación de los medios de comunicación y la cultura
<ol><li>Preparar solución de stock de 1.000x carbenicilina (50 mg/ml) o antibiótico relevante.<ol>
<li>. Pesar 0,5 g de carbenicilina. Añadir 10 ml de estéril H2O. Disolver por completo.</li>
		<li>Esterilizar el stock de carbenicilina a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot la solución antibiótica y almacenar a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar placas de caldo de lisógena (LB), mezcle 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura y 7,5 g de agar Bacto con 0,5 L de estéril H2O. Autoclave la solución a 121 °C durante 20 minutos.<ol>
<li>Sumerja parcialmente la mezcla de gel fundido en un baño de agua de 50 °C. Añadir 1.000 μL de carbenicilina (50 mg/ml).</li>
		<li>Prepare platos de Petri en un ambiente estéril. Deje los platos para ajustar antes de guardarlos en la nevera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para medios mínimos M9, prepare soluciones de stock separadas de lo siguiente: sales de 5x M9 (56,4 g/L), glucosa de 2 M y 2% de homeminoácidos libres de biotinas. Autoclave las soluciones a 121 °C durante 20 min.</li>
	<li>Para preparar 5 placas De Petri, mezclar 1125 mg de agar de baja fusión y 400 mg de agar con 89,2 ml de medios mínimos (1x M9). Añadir 10 ml de 2% de homeminoácidos (2% [vol/vol]) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. NOTA: Asegúrese de verter los medios en los labios internos del matraz.</li>
	<li>Microondas la solución en ráfagas cortas de 3 a 4 segundos. Repita la repetición hasta que la solución esté clara. NOTA: Asegúrese de no llegar al punto de ebullición.</li>
	<li>Coloque el matraz Erlenmeyer de 250 ml en un baño de agua caliente (60 °C) para mezclarlo aún más por difusión, y déjelo enfriar hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.</li>
	<li>Enciende la llama en el banco que vierte la placa.</li>
	<li>Añada rápidamente todas las soluciones en el siguiente orden: 800 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol]) 100 μL de tiamina (B1) 1100 μL de glucosa (2M) 100 μL de carbenicilina (50 mg/ml).</li>
	<li>Arremolina el matraz Erlenmeyer para asegurar una distribución uniforme de todos los ingredientes en todo el agar.</li>
	<li>Abra una placa a la vez junto a la llama y comience a verter.<ol>
<li>Deje las placas en el banco durante unos minutos hasta la solidificación inicial.</li>
		<li>Ponga las placas boca abajo para evitar que la condensación de agua gotee sobre el gel.</li>
		<li>Deje que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h.</li>
		<li>Una vez que las placas se han solidificado y secado, se pueden almacenar a 4 °C durante aproximadamente 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Construcción de cepas bacterianas y plásmidos
NOTA: El circuito genético contiene una parte; una proteína fluorescente verde (GFP) impulsada por un promotor deP tetO que resulta en expresión constitutiva. Todos los plásmidos de este trabajo fueron construidos utilizando técnicas básicas de clonación molecular y se transformaron en Escherichia coli 10β, utilizando un protocolo estándar de choque térmico24. La construcción final se transformó en cepa de tipo salvaje Escherichia coli MG1655 para pruebas.
<ol><li>Transforme el plásmido deseado en células Escherichia coli MG1655 con el protocolo de choque térmico estándar24.</li>
	<li>Cultiva las células transformadas en una placa de agar LB durante la noche a 37°C. NOTA: Es posible mantener las placas Petri desde el paso 2.2 hasta 3 días para uso de microscopía.</li>
	<li>Inocular una sola colonia en 5 ml de caldo LB complementado con los antibióticos relevantes en un tubo de vidrio.</li>
	<li>Cultivar células a 37 °C con 250 rpm de velocidad de agitación en incubadora durante 2 h hasta que el líquido esté nublado.</li>
	<li>Prepare 1 ml de solución de dilución de la siguiente manera: 892 μL de medios mínimos (1x M9) 8 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol]) 100 μL de 2% de ácidos Casamino (0,2% [wt/vol]) 1 μL de tiamina (B1) 11 μL de glucosa (2 M) 1 μL de antibióticos relevantes<ol>
<li>Mezcle y gire hacia abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir el cultivo celular (1:30) del paso 2.4 en un tubo de 2 ml añadiendo 30 μL de crecimiento de Escherichia coli a 1000 μL de solución de dilución (paso 2.5).</li>
	<li>Incubar el tubo durante 1 h con agitación (250 rpm) a 37 °C.</li>
	<li>Crecer 40 μL - 60 μL en placas M9 preparadas en el paso 1.10. Incubar la placa a 37 °C durante la noche. NOTA: La densidad óptica (OD600nm)para el chapado debe ser de alrededor de 0,1.</li>
	<li>Coloque hasta tres placas inferiores de vidrio de 35 mm en el banco. NOTA: Asegúrese de que el vidrio de la placa tenga el grosor correcto para las lentes del microscopio utilizadas.</li>
	<li>Preparar el cultivo para la siembra en placas de gel, repita los pasos 2.3 a 2.6 para las colonias de la placa preparada en las mediciones del microscopio del paso 2.9.</li>
	<li>Prepare la siguiente solución para hacer tres placas de microscopio.<ol>
<li>Precalentar el baño de agua a 60 °C.</li>
		<li>Mezclar 112,5 mg de agar de baja fusión y 40 mg de agar con 8,92 ml de medios mínimos (1x M9) y añadir 1 ml de 2% de homeminoácidos (0,2% [vol/vol]) en un matraz Erlenmeyer de 25 ml. NOTA: Asegúrese de verter los medios en los labios internos del matraz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microondas la solución en ráfagas cortas de 2 a 3 segundos. Repita la repetición hasta que la solución esté clara. NOTA:Asegúrese de no llegar al punto de ebullición.</li>
	<li>Coloque el matraz Erlenmeyer de 25 ml en un baño de agua caliente (60 °C) para mezclarlo aún más por difusión, y déjelo enfriar en el banco hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.</li>
</ol>3. Preparación de almohadillas de agarose
<ol><li>Banco limpio con 70% etanol. Estirar la cinta en el banco limpiado. Asegúrese de que la cinta esté lisa y nivelada.</li>
	<li>Prepare dos coverslips: uno en la cinta y otro cerca. Prepara un párpado.</li>
	<li>Retire el matraz (preparado en el paso 2.14) del baño de agua, limpie el exterior del matraz y déjelo enfriar hasta que su temperatura baje a unos 45-50 °C.</li>
	<li>Para hacer la solución de gel, mezcle rápidamente todas las soluciones en el siguiente orden: 80 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol]) 1 ml de 2% de homeminoácidos (0,2% [wt/vol]) 10 μL de tiamina (B1) 110 μL de glucosa (2 M) 10 μL de antibióticos relevantes.</li>
	<li>Vierta 1,5 ml del gel en el coverlip y cúbralo con la segunda pieza haciendo un "sándwich".</li>
	<li>Devuélvele el Erlenmeyer al baño de agua caliente. Cubra el sándwich con la tapa y ajuste el temporizador durante 20 minutos.</li>
	<li>Al mismo tiempo, incubar el tubo desde el paso 2.11 para 1 h a 37 °C con agitación (250 rpm)</li>
	<li>Después de 20 minutos voltea el sándwich (paso 3.5), cúbrelo y deja reposar durante 1 h. NOTA: Para obtener mejores resultados, deje que el "sándwich" descanse a 4 °C durante el paso 3.8.</li>
	<li>Cultivo de semillas escherichia coli desde el paso 3.7 pipeteando la muestra en el plato de 35 mm. NOTA: Pipetear 6 μL de células como pequeñas gotas separadas da los mejores resultados.</li>
	<li>Deje que las gotas se sequen durante al menos 15 minutos y hasta 30 minutos.</li>
	<li>Exponga el gel solidificado del sándwich desde el paso 3.8 deslizando el deslizamiento de las cubiertas.</li>
	<li>Corte el sándwich en pequeñas almohadillas individuales con ponche o punta de biopsia.</li>
	<li>Inclínate suavemente sobre la muestra (paso 3.9). Deje el plato durante 20 minutos en el banco.</li>
</ol>4. Preparación de la muestra para imágenes de microscopía
<ol><li>Retire el matraz del baño de agua del paso 3.6. Limpie el exterior del matraz y deje enfriar a temperatura ambiente (25 °C). NOTA: Retire el matraz en el paso 4.1 unos 3 minutos antes de que termine el temporizador.</li>
	<li>Vierta 3 ml del gel constantemente al perímetro de la placa en un movimiento circular. Dejar solidificar durante unos minutos.</li>
	<li>Sellar placas con cinta adhesiva y perforar varios agujeros con aguja de 25 G. Voltea todos los platos para evitar que la condensación de agua gotee sobre el gel.</li>
	<li>Incubar todos los platos a 4 °C durante 30 min para permitir la solidificación completa mientras se previene la mitosis celular. NOTA: Deje las muestras a 4 °C para mediciones sucesivas, no más de un día.</li>
	<li>Inicie el microscopio según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Encuentre el enfoque inicial utilizando la lente de amplificación más baja y enganche el sistema de enfoque automático (AFS).</li>
	<li>Utilice aceite si es necesario, ahogue la lente con aceite y esparce cuidadosamente moviendo la placa con un controlador de plataforma (no manualmente) y AFS se puede volver a enganchar.</li>
	<li>Utilice la sección transversal relativa en dirección Z, siguiendo la sugerencia predeterminada para las secciones transversales del paso Z. NOTA: Tomamos imágenes de campo brillantes cada 5 minutos e imágenes fluorescentes cada 20 minutos. A veces, el enfoque debe ajustarse durante los primeros 30 minutos. El precalentamiento de la caja de incubadora de microscopios y el aceite, mientras que la refrigeración de la muestra tiende a ayudar a reducir la pérdida inicial de enfoque.</li>
</ol>5. Análisis de datos
NOTA: Con el fin de procesar datos de microscopía, diseñamos un software basado en computadora en MATLAB. Este software facilita la identificación de los límites celulares de las imágenes y segmentos de tiff de campo brillante y clasifica las celdas por área. La salida de este análisis de imagen se puede utilizar como una máscara en imágenes fluorescentes tiff para derivar niveles de intensidad celular y cancelar artefactos en el dominio fluorescente como halo celular debido a los límites de resolución del microscopio. El software desarrollado se inspiró en obras similares7,25,26,27,28,29,30 y proporciona una solución elegante adaptada para el laboratorio.
<ol><li>En primer lugar, defina los siguientes parámetros en main_code.m.<ol>
<li>Defina la carpeta de las imágenes de adquisición.</li>
		<li>Defina el período de tiempo de imagen - paso de tiempo de canal de campo brillante en minutos.</li>
		<li>Defina la frecuencia GFP - tasa de adquisición de imágenes GFP.</li>
		<li>Defina la resolución del microscopio (es decir, cuántos píxeles son iguales a 1 μm).</li>
		<li>Definir rango de ubicación de histograma - rango de área celular. NOTA: El proceso de clasificación de los datos según el área de la célula es similar a los principios de gating en el análisis de datos de citometría de flujo. Las compuertas se colocan alrededor de poblaciones de células con características comunes, generalmente dispersas hacia adelante y dispersas lateralmente, para aislar y cuantificar estas poblaciones de interés. La microscopía permite gatear, investigar y cuantificar varios grupos celulares.</li>
		<li>Definir kernel de convolución (3,3): este parámetro detecta los límites de las celdas mediante umbrales globales(count_cells.m). NOTA: Esta configuración solo es necesaria al cambiar el laboratorio o el microscopio. El software requiere que el canal de campo brillante de entrada se etiquete con el índice c1, canal de fluorescencia etiquetado como c2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute main_code.m, que ejecutará todos los demás scripts automáticamente (count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>Programa segmenta automáticamente imágenes de campo brillantes (ver Figura suplementaria 2-4).</li>
		<li>Combine la imagen de segmentación con la imagen fluorescente (GFP) para extraer el nivel de intensidad por célula.</li>
		<li>Calcule el gráfico de la cantidad de células por tiempo y ajuste según el crecimiento exponencial.</li>
		<li>Calcule la desviación media y estándar (ETS) para cada rango de área celular.</li>
		<li>Calcule la relación señal-ruido (SNR) para cada rango de área celular.</li>
		<li>Trace y ajuste la distribución de la cantidad de células por intensidad.</li>
		<li>Calcule el coeficiente de Varianza (CV) y compárese con los datos del analizador de flujo. NOTA: El software dará como salida las imágenes de segmentación final para ajustar conv_kernel en una nueva carpeta "yourfolder/Segmented". El software dará como salida los gráficos en una nueva carpeta "yourfolder/Graphs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para comparar entre experimentos, utilice compare_experiments.m.<ol>
<li>Defina directorios para los gráficos guardados y la dirección del directorio \CompareResult.</li>
		<li>Ejecute el archivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, desarrollamos un protocolo que permite el rastreo por ordenador de células vivas de Escherichia coli, siguiendo niveles de división y fluorescentes durante un período de horas. Este protocolo nos permite cuantificar la dinámica estocástica de los circuitos genéticos en Escherichia coli midiendo el CV y el SNR en tiempo real. En este protocolo, comparamos los comportamientos estocásticos de dos circuitos diferentes como se muestra en la Figura 10. Se ha demostrado que lo...

La biología sintética es un campo multidisciplinar que ha surgido en la última década y tiene como objetivo traducir los principios de diseño de ingeniería en diseño biológico racional1,2,3,en un esfuerzo por lograr la integración y procesamiento multi-señal en células vivas para entender la ciencia básica4,5,aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y biotecnológicas6,7,8,9,10. Nuestra capacidad para cuantificar la respuesta de entrada y salida de los circuitos genéticos sintéticos se ha visto revolucionada por los recientes avances en la tecnología unicelular, incluido el analizador de flujo y las imágenes de células vivas mediante microscopía automatizada de lapso de tiempo11. A menudo se utiliza un analizador de flujo para medir la respuesta de estos circuitos en el estado estacionaria1,12,y la microscopía invertida se utiliza para medir la respuesta dinámica de los circuitos genéticos sintéticos a nivel de una sola célula3. Por ejemplo, uno de los primeros trabajos en biología sintética implicó la construcción de redes de osciladores genéticos en células vivas utilizando bucles de retroalimentación negativos con un retrasode 3. Más tarde, los circuitos osciladores genéticos se aplicaron para entender el control metabólico en el entorno dinámico de las células vivas4. La microscopía automatizada de lapso de tiempo es un método para caracterizar estos circuitos. Suponemos que las células huésped, Escherichia coli,se sincronizan al formar micro colonias, permitiendo la medición de la señal y el cálculo del ruido sin rastrear las relaciones exactas madre-hija.
El ruido es un aspecto fundamental e inherente de los sistemas biológicos que a menudo surgen de múltiples fuentes. Consideremos, por ejemplo, las reacciones bioquímicas que implican señales que se originan en el transporte de portadores aleatorios discretos, como la difusión de proteínas13. Estas señales se propagan con fluctuaciones aleatorias14. Otras fuentes de ruido son la disponibilidad de recursos, la división celular y las variaciones en condiciones ambientales como la temperatura, la humedad y la presión. Las señales biológicas que se propagan en circuitos genéticos sintéticos a menudo tienen una relación señal-ruido (SNR) muy baja, lo que perturba el rendimiento de dichos circuitos. Por lo tanto, el diseño de circuitos genéticos sigue siendo uno de los aspectos más desafiantes de la ingeniería genética15. Por ejemplo, a diferencia de la mayoría de los enfoques que calculan sólo la expresión génica media (medida sobre toda la población celular), la varianza de la señal medida se considera con el fin de diseñar un comportamiento predecible a través de redes genéticas sintéticas12. Como tal, los niveles de variabilidad o ruido en la expresión proteica desempeñan un papel dominante en el diseño y el rendimiento de los circuitos genéticos analógicos y digitales1,16,17.
Se han desarrollado muchos enfoques para cuantificar la variabilidad de célula a célula, incluso en Escherichia coli3,7,18. Estos métodos se utilizan a menudo para estudiar la activación genética y las vías metabólicas, sin embargo, con menos enfoque en el estudio de la dinámica del ruido estocástico, como medir y desenredar fuentes de ruido específicas, especialmente para los circuitos genéticos en las células vivas donde este es un desafío fundamental19,20,21. Varios factores, tanto heredados al propio circuito (intrínsecos) como derivados de las células huésped (extrínsecos), pueden perturbar el rendimiento continuo de los circuitos genéticos. En este documento, desarrollamos un protocolo que tiene como objetivo cuantificar el ruido total en las células de Escherichia coli, incluidas las fuentes de ruido intrínsecas y extrínsecas6,22. Al cuantificar el ruido total y luego evaluar el SNR23,se puede mejorar el diseño de los circuitos genéticos. Este método se puede modificar para medir fuentes de ruido independientes por separado, mediante la monitorización de varias proteínas fluorescentes6,20. Para el protocolo descrito aquí, mantenemos las condiciones ambientales bien controladas y medimos continuamente la actividad de las células sin la influencia de factores externos. Medimos la señal de las proteínas fluorescentes en células individuales con el tiempo y las imagen simultáneamente bajo un sustrato de agarose. Las imágenes resultantes se analizan utilizando el MATLAB personalizado del laboratorio.
Idealmente, la medición continua de la actividad en tiempo real de las proteínas fluorescentes dentro de una célula producirá datos precisos a través del crecimiento y la división de las células. Sin embargo, es difícil adquirir esos datos. Esto se debe a la degradación de las proteínas fluorescentes, conocidas como foto-blanqueamiento7,cuando están expuestas a la radiación en el proceso de excitación. Además, las células de Escherichia coli también son sensibles para la excitación, lo que podría conducir a la fototoxicidad7. Ambas emisiones limitan la cantidad de marcos de fotos que se pueden adquirir y el tiempo entre adquisiciones. El sustrato y los tipos medios (por ejemplo, caldo de lisógena) que se utiliza para cultivar las células durante la toma de imágenes también tienen un papel crítico. Recomendamos encarecidamente el uso de un medio mínimo, que minimice el fondo no fluorescente y amplíe el tiempo de división celular.
Además, la muestra debe prepararse teniendo en cuenta los siguientes requisitos (1) La baja tasa de división celular permite exposiciones menos frecuentes para realizar imágenes cercanas del ciclo de división y reducir la probabilidad de fototoxicidad y fotobleaching. Establecemos el tiempo de adquisición en aproximadamente la mitad del tiempo de mitosis pronosticado (2) La baja densidad celular al comienzo del experimento permite una mejor uniformidad y seguimiento de la división. La densidad celular se ve afectada por la relación de dilución de las células de Escherichia coli, que es un parámetro significativo para el éxito de este protocolo y debe determinarse para cada laboratorio. Para establecer la relación, cada nueva cepa o medio de Escherichia coli utilizado debe estar equipado con gráficos de tasa de crecimiento(Figura Suplementaria 1). Se ha logrado una relación adecuada si las células pueden crecer sin agitación adicional después de una breve incubación de una densidad inicial de aproximadamente600nm OD = 0.1. Las células en esta fase se dividirán de acuerdo con la temperatura ambiente solamente (3) Restricción del movimiento celular: el movimiento celular depende fuertemente de la firmeza del sustrato (almohadilla de agarose). La firmeza del sustrato depende de la cantidad de agarose total y el tiempo de solidificación del gel. Los geles no se pueden dejar solidificar durante la noche a temperatura ambiente, ya que la Escherichia coli se someterá a mitosis. Otros factores que afectan la estabilidad del sustrato incluyen la cantidad de agua en la muestra y la humedad. Las cuestiones adicionales se examinan en detalle en los Resultados del Representante. Este protocolo proporciona muchos detalles y se mueve gradualmente de un paso a otro. El protocolo ofrece una larga estabilidad para experimentos de imágenes y proporciona una herramienta básica de procesamiento de imágenes.

<table><tbody><tr><td>Plato de vidrio de 35 mm</td><td>mate</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>de espesor correspondiente a la lente del microscopio.</td></tr><tr><td>Agarosa&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>5004</td><td>LB preparación</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td>inductor</td></tr><tr><td>Bacto triptona&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson y Compañía&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB preparación</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Ácidos Casamino&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson y Compañía&nbsp;</td><td>223050</td><td>solución de medios mínimos</td></tr><tr><td>eclipse Ti</td><td>microscopio invertido</td><td>nikon</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>solución de medios mínimos</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>sustrato de medios mínimos</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>44496000000000</td><td>aceite de inmersión</td></tr><tr><td>M9 solución salina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>solución de medios mínimos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB</td></tr><tr><td>preparación Agar noble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>sustrato de medios mínimos</td></tr><tr><td>cinta de parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>referida como cinta en el texto</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>sustrato de medios mínimos</td></tr><tr><td>taymine B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376&nbsp;</td><td>Solución de medios mínimos</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>212750</td><td>LB Preparación</td></tr></tbody></table>

medición continua del ruido biológico en escherichia coli mediante microscopía de lapso de tiempo

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

El protocolo desarrollado aquí ofrece una herramienta para permitir el seguimiento por computadora de la división Escherichia coli y los niveles fluorescentes durante varias horas. El proceso comienza por la detección de colonias que sobreviven en medios mínimos, suponiendo que sólo Escherichia coli que alberga el plásmido correcto será capaz de prosperar en las condiciones específicas. Dado que el proceso de construcción de grandes circuitos genéticos, que requieren el montaje de muchas partes del ADN, es un desafío, los componentes del circuito a menudo se distribuyen entre plásmidos múltiples en diferentes números de copia que requieren el uso de varios antibióticos. Las mutaciones en el plásmido pueden destruir la transcripción de los genes de resistencia a los antibióticos e interpelar con el manejo de los recursos en la célula que conduce a la necrosis. La colonia seleccionada está situada en una placa Petri con fondo de cristal y algunos planos de enfoque se seleccionan para el seguimiento de microscopía tanto en campos brillantes como en dominios fluorescentes. El protocolo mantiene el enfoque de imagen durante más de 12 horas en condiciones iniciales que no se pueden regular, creando algunas dificultades. Por ejemplo, las células muertas comienzan a acumularse en el campo de enfoque de las lentes después de unas horas de imágenes, lo que hace que las toxinas se acumulen y la señal se desenfoque y decaiga. El agotamiento de nutrientes introduce nuevos procesos metabólicos y dificulta la respuesta deseada del circuito. La temperatura del experimento reduce la efectividad de los inductores y los antibióticos, lo que puede dañar aún más la fiabilidad de la señal. El gel de medios mínimo se encoge y se seca, y como resultado el enfoque óptico cambia con el tiempo. Desarrollamos este método para superar estos desafíos en Escherichia coli,similar a trabajos anteriores que desarrollan métodos análogos para otros microorganismos. Además, este método ofrece un algoritmo para cuantificar el ruido estocástico total en celdas sin modificar y alteradas, encontrando que los resultados son consistentes con las predicciones del analizador de flujo como se muestra en un coeficiente similar de variación (CV).

El software analiza imágenes de dominio de campo brillante que son fuera de blanco y negro. La Escherichia coli se verá como formas oblongas negras sobre un fondo blanquecino y el rango dinámico de luminancia debe mostrar un pico en su centro(Figura 1). En las imágenes fluorescentes las células pueden tener un halo pequeño, pero las células individuales con formas oblongas todavía se pueden resolver. Primero se debe detectar un evento de mitosis después de 30 minutos. El enfoque del...

Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Este protocolo en hierbas medición continua de circuitos genéticos en E.coli y el cálculo de la variabilidad de la señal y la relación señal-ruido en células bacterianas individuales para evaluar el rendimiento del circuito. Las principales ventajas de esta técnica son que es fácilmente adaptable a diferentes cepas y laboratorios, requiere un entrenamiento mínimo y sin equipo especial, y es relativamente barato. El ruido es un papel importante en la determinación de la funcionalidad de los sistemas biológicos.Actualmente, existe interés en construir circuitos genéticos a gran escala. Estos sistemas pueden ser inhibidos por el ruido Asegúrese de secar bien las muestras, para mantener esas almohadillas frías a cuatro grados Celsius durante el mayor tiempo posible, y para cortar y dividir las partes paciente y suavemente. Para preparar la bacteria para el análisis inocular una sola colonia de un cultivo de E.coli transfectado.Por ejemplo, un circuito con un reportero GFP. En un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementarlo con los antibióticos relevantes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado.Al final de la incubación, gire hacia abajo un mililitro de solución de dilución en una mini micro centrífuga de dos mililitros, y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución en un nuevo tubo de dos mililitros. Luego, incubar la cultura durante una hora con temblores antes de sembrar de 40 a 60 microlitros de esta suspensión en placas de cultivo M9. Para preparar la bacteria para el análisis, inocular una sola colonia de un cultivo de E.Coli transfectado.Por ejemplo, un circuito con un reportero de GFP en un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementado con los antibióticos pertinentes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado. Al final de la incubación, gire un mililitro de solución de dilución en un mini tubo de micro centrífuga de dos mililitros y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución a un nuevo tubo de dos mililitros.Luego incubar la cultura durante una hora con temblores. Para preparar placas de microscopio, mezcle 112,5 miligramos de agar de baja fusión con 40 miligramos de agar y un mililitro de 2% de ácido casamino en un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros. A continuación, añadir 8,92 mililitros de medio mínimo sobre los labios internos de un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros y microondas la solución resultante en ráfagas cortas de dos a tres segundos.A continuación, ajuste el baño de agua a 55 grados Celsius. Cuando la solución esté clara, coloque el matraz Erlenmeyer de 25 mililitros en un baño de agua de 60 grados Celsius y deje que la solución del agar se enfríe hasta que su temperatura baje a unos 45 a 50 grados centígrados. Mientras el agar se enfría, limpie el banco de laboratorio con un 70% de etanol y sume un trozo de cinta de laboratorio en el banco limpiado.Coloque un resbalón de cubierta de vidrio en la cinta y coloque un segundo resbalón de cubierta cerca. Agregue la solución de agar refrigerado a los antibióticos y la solución adecuados. Vierta 1,5 mililitros de solución recién preparada para gelear la solución en el resbalón de la cubierta colocado sobre la cinta y coloque el segundo resbalón de la cubierta en el gel, teniendo cuidado de evitar burbujas.Devuelva el Erlenmeyer al baño de agua caliente y cubra los resbalones de la cubierta durante 20 minutos. Voltea los resbalones de la cubierta durante una hora de incubación a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, retire los resbalones de la cubierta del gel seco y corte una pequeña almohadilla de la agarose.Durante la incubación, agregue seis gotas de microlitro de la suspensión bacteriana preparada en un plato de 35 milímetros y deje que las gotas se sequen durante al menos 15 a 30 minutos. A continuación, coloque cuidadosamente la almohadilla a la vez en una gota de bacterias y deje que las muestras se ajusten durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para colocar la cama de agar sin manchar la muestra, coloque cuidadosamente la almohadilla fría en la gota con suave roscado.Para tomar imágenes de las muestras, retire el matraz del agua y deje que la solución de gel se enfríe a temperatura corporal. Vierta tres milímetros del gel sobre el perímetro de la placa de muestra. Cuando la agarose se haya solidificado, selle la placa con cinta adhesiva y utilice una aguja del calibre 25 para meter varios agujeros en la cinta.Luego coloque la placa boca abajo a cuatro grados Celsius durante al menos 30 minutos para permitir que la agarose se solidifique completamente, evitando la mitosis celular. Dentro de las 24 horas, utilice un microscopio confocal de fluorescencia para localizar la muestra en el aumento más bajo e activar el sistema de enfoque automático del microscopio. Aplique aceite al objetivo adecuado y utilice el controlador de plataforma para mover la placa para extender cuidadosamente el aceite.A continuación, vuelva a activar el enfoque automático y siga la sugerencia predeterminada de secciones transversales de paso Z para tomar imágenes del ejemplo. La E.coli debe aparecer como formas oblongas negras sobre un fondo blanco apagado. Y el rango dinámico de la luminancia debe mostrar un pico en su centro.Los eventos de mitosis se pueden detectar primero mediante microscopía de fluorescencia después de 30 minutos. Aunque las células individuales pueden ser difíciles de detectar con baja magnificación. Los cultivos celulares bacterianos preparados con una relación de dilución incorrecta pueden demostrar un número inmutable de células, y las muestras preparadas sin sellado de placas pueden presentar una contracción excesiva, lo que resulta en una pérdida de enfoque.Las células también pueden indentar el gel en su búsqueda de nutrientes, lo que resulta en el apilamiento de las células bacterianas uno encima del otro y comprometer la monocapa celular, evitando eficazmente la detección celular y la medición confiable de la señal fluorescente. Como sugieren estos datos, la etapa de celda en el ciclo de división no afecta al nivel de ruido, ya que diferentes rangos de área muestran la misma tendencia. Además, no se observa ningún cambio sustancial en la relación señal-ruido entre GFP y GFP superfoplicado, como ilustran estos datos representativos.Al realizar este procedimiento, tenga cuidado de determinar la relación de dilución correcta para la cepa bacteriana utilizada para el experimento. La comparación de la relación señal-ruido de cada circuito regulado con esta línea base permite seleccionar el mejor circuito de rendimiento y puede revelar fenómenos interesantes

continuous-measurement-biological-noise-escherichia-coli-using-time

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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