Name: Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Aprende a fabricar el dispositivo XO Pad de papel para preconcentrar y aislar microvesículas y exosomas sin químicos ni equipos complejos. Este método mejora las tasas de recuperación en investigación de vesículas extracelulares.

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Este estudio fue apoyado por la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee fue apoyado por una beca de investigación de la Universidad de Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim recibió el apoyo del "Programa de Desarrollo de Competencias para Especialistas en Industria" del Ministerio de Comercio, Industria y Energía de Corea (MOTIE), operado por el Instituto Coreano para el Avance de la Tecnología (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para la convergencia industrial de dispositivos inteligentes portátiles).

1. Fabricación de dispositivos
<ol><li>Defina la región que se va a imprimir en papel utilizando el software de impresora (Tabla de materiales). NOTA: El diseño tiene 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de 5 mm a 2 mm(Figura 1A).</li>
	<li>Imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa (Tabla de materiales) utilizando una impresora de cera comercial ( Tabla demateriales) (Figura 1B).</li>
	<li>Colocar el papel grabado en cera en un horno de laboratorio durante 80 s a 120 oC. NOTA: Este paso permite que la cera llegue al interior del papel logrando un reflujo térmico de la cera impresa. Con este protocolo de incubación, la resolución del patrón es de 2 mm. Por lo tanto, tenga cuidado de no imprimir patrones de menos de 2 mm. De lo contrario los patrones serán bloqueados por la cera.</li>
	<li>Corte el papel impreso en cera con un cortador para fabricar dispositivos individuales (Figura 1C).</li>
	<li>Disminuir 5 s y 2 l de membrana permselectiva (p. ej., Nafion; Tabla de materiales) en las áreas de muestra en las capas más a la izquierda y a la derecha, respectivamente (Figura 1D).</li>
	<li>Coloque las capas recubiertas con la membrana permselectiva en una placa caliente a 70 oC durante 30 minutos para evaporar el disolvente de membrana permselectivo.</li>
	<li>Selle la superficie más externa de la capa recubierta frente a la solución tampón con cinta sensible a la presión, dejando un pequeño agujero.</li>
	<li>Doble el dispositivo individual impreso (es decir, Exo-PAD) de un lado a otro a lo largo de las líneas blancas. NOTA: Al plegar el dispositivo, todas las áreas de muestra se conectan convergentemente(Figura 1E). Este diseño convergente centra las líneas de campo eléctrico cuando se aplica la tensión para ICP, logrando una preconcentración más intensiva de las microvesículas y exosomas.</li>
</ol>2. Enriquecimiento y enfoque espacial de microvesículas y exosomas por polarización de la concentración iónica
<ol><li>Cargue 15 l de la muestra de microvesícula y exosoma (3 x 1011 partículas/ml en solución salina tamponada de 0,1x fosfato [PBS] con 0,05% de interpolación 20) en las áreas de muestra convergentes por pipeteo y espere unos segundos para asegurar la humectación completa de todas las áreas de muestra (Figura 1F).</li>
	<li>Coloque dos cámaras de acrílico en ambos extremos del Exo-PAD y sujete el Exo-PAD de forma segura con pequeños clips de aglutinante para evitar que se desdoblen(Figura 1G).</li>
	<li>Llene las cámaras con 110 l de 0,1x PBS e inserte dos electrodos Ag/AgCl(Figura 1H).</li>
	<li>Aplicar 30 V a los electrodos durante 20 minutos utilizando un sistema de medición de fuente de corriente(Tabla de materiales). NOTA: El voltaje aplicado genera el fenómeno ICP y por lo tanto preconcentra las microvesículas y exosomas en las capas 8 y 9 del Exo-PAD.</li>
</ol>3. Aislamiento de las microvesículas y exosomas enriquecidos
<ol><li>Separe el Exo-PAD plegado de las cámaras de acrílico y desdoble el dispositivo para aislar las microvesículas y exosomas enriquecidos de las otras capas (Figura 1I).</li>
	<li>Perforar las áreas de muestra en las capas 8 y 9, donde se enriquecen las microvesículas y los exosomas, para el análisis aguas abajo (Figura 1J).</li>
</ol>4. Análisis de microscopía electrónica de barrido
<ol><li>Fijar las microvesículas y exosomas enriquecidos sumergiendo las áreas perforadas en 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M tampón de cacodilato sódico durante 1 h y en 1% de tetroxido de osmio en 0,1 M de cacodilato sódico durante 1 h. ADVERTENCIA: El tetróxido de Osmio es un producto químico altamente venenoso y peligroso. Debido a que el tetróxido de osmio puede penetrar en los plásticos, debe almacenarse en vidrio. Cualquier manipulación de tetróxido de osmio debe realizarse en una campana química con guantes de doble nitrilo.</li>
	<li>Deshidratar las microvesículas fijas y los exosomas con grados ascendentes de etanol a prueba de 200 (es decir, 50%, 70%, 90% y 100%) durante 30 minutos cada uno.</li>
	<li>Seque químicamente la muestra sumergiéndola en hexametildisilazane en un desecador durante 30 min. ADVERTENCIA: Hexamethyldisilazane es un producto químico inflamable y sensible a la humedad. Debe almacenarse en un área seca y bien ventilada lejos de fuentes de ignición.</li>
	<li>Recubrir las microvesículas completamente secas y los exosomas con oro/paladio (20 nm) a través de imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de pulverización y captura.</li>
</ol>5. Análisis de seguimiento de nanopartículas
<ol><li>Golpee las áreas de muestra en las capas 6, 8 y 10 usando un punzón de biopsia después de 20 minutos de operación del dispositivo.</li>
	<li>Sumerja cada área perforada en solución tampón (0,1x PBS con 0,01% de interpolación 20).</li>
	<li>Vórtice durante 10 min y centrífuga durante 30 s a 6.000 rpm para resuspender las microvesículas y exosomas enriquecidos.</li>
	<li>Retire las áreas perforadas de la solución y mida la concentración de microvesículas y exosomas mediante un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque el Exo-PAD se utilizó con éxito para el enriquecimiento y aislamiento de microvesículas y exosomas, se deben considerar cuidadosamente varios puntos críticos: 1) el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la preparación del dispositivo, 2) el tiempo de procesamiento, 3) la aplicación de voltaje con diferentes números de capa y diámetros de área de muestra, y 4) la aplicabilidad a las muestras clínicas.
El tiempo de incubación y la temperatura indicados en el protocolo so...

Las microvesículas y los exosomas son vesículas de membrana pequeñas que miden 0,2 a 1 m y 30 a 200 nm, respectivamente. Son secretados en el entorno extracelular por varios tipos de células diferentes1,2,3,4,5. Contienen información de células parentales en forma de subconjuntos de ADN, ARNm, MIRNA, proteínas y lípidos, y circulan por todo el cuerpo a través de diversos fluidos corporales como suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico y saliva6,7,8,9. Por lo tanto, las técnicas para el aislamiento eficiente de microvesículas y exosomas de fluidos biológicos pueden proporcionar amplias oportunidades en los campos del diagnóstico, pronóstico y monitoreo en tiempo real de la enfermedad, así como en el desarrollo de nuevas terapias.
Sin embargo, el método de aislamiento convencional para microvesículas y exosomas basados en la ultracentrifugación consume mucho tiempo y causa una pérdida y contaminación significativas de la muestra. Esto se debe a que implica varios pasos de pipeteo y carga engorrosos y el descarte de varios reactivos con ultracentrifugación repetida5,6,10,11,12. Por otra parte, la alta tensión de cizallamiento inducida por la ultracentrifugación (100.000 x g)puede causar la lysis física de microvesículas y exosomas, produciendo tasas de recuperación deficientes (5-23%)6,,13,,14. Por lo tanto, se debe desarrollar una técnica de aislamiento altamente eficiente y discreta para microvesículas y exosomas para reducir el daño y la pérdida, logrando así mayores tasas de recuperación.
Un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) fue desarrollado para un aislamiento más simple, suave y altamente eficiente de microvesículas y exosomas6. El diseño del Exo-PAD es un papel multiplicizado con áreas de muestra conectadas en serie que disminuyen gradualmente de diámetro. La técnica de polarización de la concentración de iones (ICP), que es un fenómeno nanoelectrocinético que preconcentra biomoléculas cargadas, se integró con este diseño único. El uso del Exo-PAD dio como resultado un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas y su aislamiento simplemente desplegando el dispositivo. Este artículo describe el Exo-PAD en detalle, desde la fabricación y operación general del dispositivo hasta el análisis de su uso, para ilustrar el método y mostrar resultados representativos6.

<table><tbody><tr><td>Electrodos de Ag/AgCl</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td> Albúmina de <td>0,15"</td></tr><tr><td>de diámetro de suero bovino (BSA), Alexa Fluor 594 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA conjugado con Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Tampón de carbonato-bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Tampón de carbonato</td></tr><tr><td>Software CorelDraw (Coral Co., Canadá)</td><td>Corel Corporation</td><td></td><td>Software de impresora para definir la impresión en cera región</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Impresora de cera</td></tr><tr><td>Papel de cromatografía grado 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861 Papel de</td><td>celulosa, dimensión: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Patrones de exosomas marcados con fluorescencia</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Exosoma marcado con FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Medidor de fuente de corriente/voltaje Keithley 2410</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Actual&ndash; sistema de medición de fuente de voltaje</td></tr><tr><td>Nafion solución de resina perfluorada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Membrana permselectiva, 20 % en peso en la mezcla de alcoholes alifáticos inferiores y agua; contiene 34% de agua</td></tr><tr><td>Tecnología NanoSight LM10</td><td>NanoSight Máquina</td><td></td> de <td>análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Las microvesículas y exosomas son pequeñas vesículas membranosas liberadas al ambiente extracelular y circulan por todo el cuerpo. Debido a que contienen varias biomoléculas derivadas de células parentales como ADN, ARNm, miRNA, proteínas y lípidos, su enriquecimiento y aislamiento son pasos críticos para su explotación como biomarcadores potenciales para aplicaciones clínicas. Sin embargo, los métodos de aislamiento convencionales (por ejemplo, ultracentrifugación) causan pérdidas significativas y daños a microvesículas y exosomas. Estos métodos también requieren múltiples pasos repetitivos de ultracentrifugación, carga y desgaste de reactivos. Este artículo describe un método detallado para fabricar un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) diseñado para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas de una manera sencilla. El diseño único del Exo-PAD, que consiste en capas multidobladas similares al acordeón con áreas de muestra convergentes, se integra con la técnica de polarización de concentración de iones, lo que permite un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas. Además, las microvesículas y exosomas enriquecidos se aíslan simplemente desplegando el Exo-PAD.

El tiempo de operación debe optimizarse para lograr el máximo rendimiento de recuperación de las microvesículas y exosomas enriquecidos. El tiempo insuficiente no permite una migración suficiente de las microvesículas y exosomas, lo que disminuye el enriquecimiento, mientras que el tiempo excesivo deteriora el enfoque espacial y por lo tanto dispersa las microvesículas y exosomas. Así, a través del paso de optimización del tiempo, se puede identificar el factor máximo de preconcentración de microvesículas y exosomas y la...

Presentado es un protocolo para fabricar un dispositivo basado en papel para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas.

Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

En este protocolo, describimos un método simple para fabricar un dispositivo basado en papel llamado XO Pad, que está diseñado para el enriquecimiento efectivo en aislamiento de vesículas extracelulares. El XO Pad es un dispositivo simple que puede precontratar y aislar la vesícula extracelular sin el uso de productos químicos o máquinas de trabajo, mientras que muestra tasas de recuperación más altas que los métodos convencionales. Comience definiendo la región que se imprimirán con el software de la impresora.El diseño debe tener 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de cinco a dos milímetros. A continuación, imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa. Coloque el papel impreso en cera en un horno de laboratorio durante 80 segundos a 120 grados Centígrados, luego corte el papel impreso en cera con un cortador para fabricar dispositivos XO Pad individuales.Suelte un cinco y dos microlitros de membrana selectiva de perm en las áreas de la muestra en la mayoría izquierda y la derecha de la mayoría de las capas, respectivamente. Coloque las capas codificadas con la membrana selectiva perm en una placa caliente a 70 grados Celsius durante 30 minutos para evaporar el disolvente. A continuación, selle la superficie más externa de la capa recubierta frente a la solución tampón con cinta sensible a la presión, dejando un pequeño agujero.Doble el dispositivo XO Pad de un lado a otro a lo largo de las líneas blancas para conectar convergentemente todas las áreas de muestra. Pipetear 15 microlitros de la microvesícula y la muestra de exosoma en las áreas convergentes de la muestra y esperar unos segundos para asegurar la humectación completa. Coloque dos cámaras de acrílico en ambos extremos de la XO Pad y fíjela firmemente con pequeños clips de aglutinante para evitar que se desdoblen.Llene las cámaras con 110 microlitros de 0.1X PBS e inserte dos electrodos de plata. A continuación, utilice un sistema de medición de fuente de voltaje de corriente para aplicar 30 voltios a los electrodos durante 20 minutos. Para aislar las microvesículas y exosomas enriquecidos, separe el XO Pad plegado de las cámaras de acrílico y desdoble el dispositivo para aislar las partículas enriquecidas de las otras capas.Perforar las áreas de muestra en las capas ocho y nueve donde las microvesículas y exosomas se enriquecen para el análisis posterior. Se realizó un ensayo de migración de lapso de tiempo de microvesículas y exosomas con etiqueta fluorescente con el fin de optimizar el tiempo de operación para la máxima recuperación de las partículas enriquecidas. Las intensidades de fluorescencia en todas las áreas de muestra se cuantificaron con el software ImageJ.Antes del proceso de enriquecimiento, las microvesículas y los exosomas se dispersaron en todas las áreas de la muestra con una disminución gradual de la intensidad. Después de 10 minutos de procesamiento, las partículas migraron electro-fíneticamente y un enchufe de pre-concentración instantánea apareció en la capa siete. Cuando el tiempo llegó a los 20 minutos, las microvesículas y los exosomas se centraban fuertemente en las capas ocho y nueve y enriquecían cinco veces en función de las intensidades de fluorescencia.La integridad de las microvesículas y exosomas enriquecidos en la capa ocho se investigó con SEM. Sem. Se observaron significativamente más partículas no dañadas después del proceso de enriquecimiento. También se analizó la distribución del tamaño de las microvesículas y exosomas enriquecidos.Posteriormente, se analizó la concentración real de las microvesículas y exosomas enriquecidos en las áreas de muestra en las capas seis, ocho y 10. En la capa ocho, las microvesículas y los exosomas fueron preconcentrados por un factor de 5,58, pero no se observó ninguna preconcentración notable en las otras capas. Para garantizar la reproducibilidad de este procedimiento, siguió con precisión el protocolo para el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la verificación del dispositivo y el tiempo de funcionamiento del dispositivo, ya que esas son las condiciones optimizadas.El XO Pad también se puede utilizar para separar y aislar la vesícula extracelular de muestras ricas en proteínas, como suero o plasma, mediante el uso de tampón de carbonato. Este protocolo puede proporcionar una herramienta de preparación eficiente y sencilla, con sus capacidades de pre-concentración y aislamiento necesarias para la investigación clínica, como el diagnóstico, la administración de medicamentos, la inmunoterapia y otras terapias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

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Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.

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Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a fabricar el dispositivo XO Pad de papel para preconcentrar y aislar microvesículas y exosomas sin químicos ni equipos complejos. Este método mejora las tasas de recuperación en investigación de vesículas extracelulares.

Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas

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