Name: Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a visualizar ensamblaje de varillas de actina intranuclear en embriones de Drosophila bajo estrés térmico mediante microinyección de actina globular conjugada con rodamina. Este protocolo permite estudiar dinámica de actina en vivo.

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Los autores reconocen con gratitud el trabajo de Liuliu Zheng y Zenghui Xue, que ayudaron a ser pioneros en esta técnica en el laboratorio Sokac, así como de Hasan Seede, quien ayudó con el análisis. El trabajo para este estudio está financiado por una subvención de NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).</li>
<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

La importancia de este método es que utiliza el protocolo bien establecido de microinyección en embriones de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para permitir nuevas investigaciones sobre el ASR y el conjunto de barras actin acompañantes. Una ventaja importante de inyectar G-actinR...

Este protocolo describe cómo inyectar G-actinRojo para visualizar el montaje de barras de actina intranuclear en embriones estresados por calor que están siendo sometidos a una respuesta inducible a la tensión actin (ASR)1. Desarrollamos este protocolo para ayudar a los estudios del ASR, que en embriones conduce a morfosis interrumpida y viabilidad reducida, y en adultos los tipos de células humanas se asocian con patologías como insuficiencia renal2,miopías musculares3,y la enfermedad de Alzheimer y Huntington4,5,6,7,8. Este ASR es inducido por numerosas tensiones celulares, incluyendo choque de calor9,10,11,estrés oxidativo4,6,síntesis ATP reducida12,y huntingtina anormal u oligomerización amiloide β4,5,6,7,9,13,14,15,16. Un sello distintivo del ASR es el montaje de varillas de actina aberrantes en el citoplasma o núcleo de las células afectadas, que es impulsado por la hiperactivación inducida por el estrés de una proteína que interactúa con actina, Cofilina1,5,6,10. Lamentablemente, siguen existiendo lagunas clave en el conocimiento con respecto al ASR. Por ejemplo, se desconoce la función de las varillas actin. No entendemos por qué se forman varillas en el citoplasma de algunos tipos de células, pero el núcleo de otros. Tampoco está claro si el ASR es protector o maladaptivo para las células o embriones sometidos a estrés. Por último, todavía no conocemos los mecanismos detallados subyacentes a la hiperactivación de cofilina o el conjunto de varillas actin. Por lo tanto, este protocolo proporciona un ensayo rápido y versátil para sondear el ASR visualizando la formación de varillas actin y dinámicas en el sistema experimental altamente tractable del embrión de mosca de la fruta viva.
El protocolo para microinyecto G-actinRed en embriones drosophila vivos fue desarrollado inicialmente para estudiar la dinámica de las estructuras normales de actina citoplasmática17 durante eventos de construcción de tejidos. En esos estudios, encontramos que la inyecciónroja de G-actin no afectaba negativamente a los procesos de desarrollo tempranos en el embrión, incluida la citoquinasis o la gastrulación17,18. A continuación, modificamos el protocolo, adaptando el manejo del embrión y la inyección de G-actinrojo para permitir la toma de imágenes de barras de actina en embriones estresados por calor sometidos al ASR1. Otros métodos además de la inyección de G-actinrojo se pueden utilizar para visualizar actina en embriones. Estos métodos se basan en la expresión de proteínas fluorescentes (FPs) etiquetadas para actuar o a dominios de proteínas de unión a la actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP y Moesin-GFP (revisada en19). Sin embargo, el uso de estas sondas FP requiere precaución porque pueden estabilizar o interrumpir algunas estructuras de actina, no etiquetar por igual todas las estructuras de actina20, y en el caso de actin-GFP, son altamente sobreexpresados – problemático para el análisis del conjunto de varillas que no sólo depende del estrés, sino también actuar en la concentración dependiente1. Por lo tanto, G-actinRed es la sonda preferida para estudios de varilla en embriones de mosca, y el gran tamaño del embrión permite su fácil inyección.
El flujo de trabajo de este protocolo es similar a otras técnicas de microinjeción bien establecidas que se han utilizado para inyectar proteínas, ácidos nucleicos, fármacos e indicadores fluorescentes en embriones de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. Sin embargo, después de la microinyección de G-actinRed aquí, los embriones están expuestos a estrés por calor leve para inducir el ASR y el conjunto de varilla de actina intranuclear. Para laboratorios con acceso a moscas y un equipo de inyección, este método debe ser fácilmente implementable y adaptable para líneas de estudio específicas con respecto a la ASR, incluyendo su inducción por diferentes tensiones o modulación en distintos antecedentes genéticos.

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td></td><td>A23835G Componente del tampón G Jugo de</td></tr><tr><td>manzana, Mott's, 64 fl oz</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>Componente de los platos de jugo de manzana</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Componente de los platos de jugo de manzana</td></tr><tr><td>Lejía, PureBright Germicida, hipoclorito de sodio al 6,0%</td><td>KIK International 059647210020</td><td></td><td>Para embriones decorionantes</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Componente del tampón G</td></tr><tr><td>Filtro de células, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Para la recogida de embriones decorionados</td></tr><tr><td>Microscopio confocal, LSM 880 de 34 canales con Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Para la obtención de imágenes de bastones de actina intranuclear</td></tr><tr><td>Drierite</td><td>desecante</td><td>24001</td><td>Para la desecación de embriones</td></tr><tr><td>Microscopio de disección, Stemi 508 Estereoscopio con zoom 8:1</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>Para la disposición de embriones en una cuña de agar</td></tr><tr><td>Aguja de disección, 5 pulgadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Para la disposición de embriones en una cuña de agar</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Componente del tampón G</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara, Scotch Permanent, 0,5 pulgadas x 250 pulgadas</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Para hacer pegamento para embriones</td></tr><tr><td>Jaula de recolección de embriones</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Para alojar moscas adultas y recolectar embriones Pinzas de</td></tr><tr><td>punta fina, Pinza Dumont, Estilo 5</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>72701D</td><td>Para disponer embriones en cuña de agar</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio, Vidrio de borosilicato, delgado 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Para microagujas Aceite de</td></tr><tr><td>halocarbono 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Para la hidratación de los embriones</td></tr><tr><td>Incubadora de etapa calefactada</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Para la obtención de imágenes confocales</td></tr><tr><td>Limpiadores de tejidos de laboratorio, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Limpiadores de tejidos de laboratorio</td></tr><tr><td>Microscopio óptico, Invertoskop 40C Contraste de fase invertida microscopio reacondicionado</td><td>Zeiss</td><td>Descatalogado</td><td>Microscopio de inyección</td></tr><tr><td>Metil-4-hidroxibenzoato</td><td>Millipore-Sigma</td><td></td><td>H36471KG Componente de los platos de zumo de manzana</td></tr><tr><td>Microinyector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinyector</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para la carga de microagujas</td></tr><tr><td>Micromanipulador y etapa de inyección con diales x, y, z para el ajuste de la aguja</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Personalizado</td><td>Para realizar microinyecciones</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas, modelo P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Para tirar de tubos capilares para hacer microagujas</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Para el montaje de embriones Portaobjetos de</td></tr><tr><td>microscopio, Lilac Colorfrost, Prelimpios, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Para el montaje de embriones para inyección</td></tr><tr><td>n-Heptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Componente del pegamento para embriones</td></tr><tr><td>Objetivo, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Descatalogado</td><td>10x objetivo para microscopio</td></tr> <tr><td>de inyecciónObjetivo, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. Objetivo de</td> agua <td>FCS Zeiss 4217679971711</td><td></td><td>40x para objetivo confocal</td></tr><tr><td>, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 para inmersión en aceite, agua, aceite de silicona o glicerina (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm a D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x objetivo de inmersión mixto para confocal</td></tr><tr><td>Objetivo, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss 4207829900799</td><td></td><td>63x objetivo de aceite para confocal</td></tr><tr><td>Pincel, Robert Simmons Expression E85 Puntiagudo Redondo tamaño 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Para la transferencia de embriones Toallas de</td></tr><tr><td>papel, Kleenex Toallas de papel plegables en C, blancas</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>Para secar colador de células</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, 5 3/4 en</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Para cubrir embriones con aceite</td></tr><tr><td>Placa de Petri, vidrio, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Para cámara de incubación húmeda</td></tr><tr><td>Placa de Petri, plástico, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Para placas de zumo de manzana</td></tr><tr><td>Pipeta, Eppendorf Referencia 0.5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Para cargar la microaguja</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix 63300006</td><td></td><td>Para añadir pegamento de embriones al cubreobjetos</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar VWR</td><td></td><td>55411050</td><td>Para cortar cuña de agar, cinta, puntas de pipeta</td></tr><tr><td>Actina globular conjugada con rodamina, plaquetas humanas (no muscular; 4x10 &mu; g)</td> <td>Citoesqueleto, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actina^</td></tr><tr><td>Red Frasco de centelleo, 20 mL Borosilicato de vidrio con revestimiento de polietileno y tapas de urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>Para hacer pegamento para embriones</td></tr><tr><td>Frasco con tapa de rosca, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>Para desecar embriones</td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>602104PG</td><td>Para calibrar el volumen de inyección de G-actina</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Componente de los platos de zumo de manzana</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Componente de la levadura tampón G</td></tr><tr><td>, Levadura de Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Componente de pasta de levadura</td></tr></tbody></table>

imágenes intranuclear actin rods en vivo calor estresado drosophila embriones

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

El propósito de este protocolo es visualizar varillas de actina intranuclear que se ensamblan en embriones drosophila melanogaster vivos después del estrés térmico. Las barras actin son un sello distintivo de una respuesta al estrés actin (ASR) conservada e inducible que acompaña a las patologías humanas, incluida la enfermedad neurodegenerativa. Anteriormente, demostramos que el ASR contribuye a fallos de morfosis y a una menor viabilidad del desarrollo de embriones. Este protocolo permite el estudio continuo de los mecanismos subyacentes al montaje de varillas actin y el ASR en un sistema modelo que es altamente apto para la creación de imágenes, genética y bioquímica. Los embriones se recogen y montan en una cubierta para prepararlos para la inyección. La actina globulaular conjugada con rhodamina (G-actinrojo)se diluye y se carga en un microneedle. Se realiza una sola inyección en el centro de cada embrión. Después de la inyección, los embriones se incuban a temperatura elevada y las barras de actina intranuclear se visualizan mediante microscopía confocal. La recuperación de fluorescencia después de los experimentos de fotobleaching (FRAP) se puede realizar en las barras actin; y otras estructuras ricas en actina en el citoplasma también se pueden imaginar. Encontramos que G-actinRed polimeriza como G-actin endógeno y no interfiere, por sí solo, con el desarrollo normal de embriones. Una limitación de este protocolo es que se debe tener cuidado durante la inyección para evitar lesiones graves en el embrión. Sin embargo, con la práctica, inyectar G-actinrojo en embriones de Drosophila es una manera rápida y confiable de visualizar varillas de actina y se puede utilizar fácilmente con moscas de cualquier genotipo o con la introducción de otras tensiones celulares, incluyendo hipoxia y estrés oxidativo.

Un flujo de trabajo esquemático de manejo de embriones se representa en la Figura 1y se presenta un calendario para un experimento típico en la Tabla 1. Una estimación para un buen resultado experimental es que por cada 10 embriones inyectados, al menos la mitad de los embriones vistos estarán en la etapa de desarrollo correcta, sin daños, y exhibirán un ASR robusto con estrés térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado por el montaje de varillas de actina intranuclear como ...

El objetivo de este protocolo es inyectar actina globular conjugada con rhodamina en embriones de Drosophila y el conjunto de barras de actina intranuclear de imagen después del estrés térmico.

Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Nuestro protocolo es importante porque utiliza la técnica bien establecida de microinyección en embriones de Drosophila para permitir nuevas investigaciones sobre la respuesta al estrés de actina y el ensamblaje de varillas de actina que la acompaña. La principal ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la respuesta al estrés de la actina en una variedad de contextos, como una pantalla mutante o bajo diferentes condiciones de estrés. Una persona que nunca antes ha realizado esta técnica puede tener dificultades con el manejo de los embriones y la realización de la microinyección.Recomendamos practicar estos pasos hasta que el usuario se sienta cómodo. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de la manipulación, el posicionamiento y el montaje de los embriones tanto para la microinyección como para las imágenes pueden no estar claros solo con las instrucciones escritas. Prepare las tazas de recolección de embriones y los platos de agar de jugo de manzana de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Para promover la puesta de huevos más generosa, coloque tazas de recolección con moscas dos días antes del experimento. Agregue al menos 100 moscas

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Un protocolo para la obtención de imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados o estructuras autofluorescentes en...

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca 2+ durante la activación del huevo en Drosophila.

El calcio de imágenes en<em&gt; Drosophila</em&gt; En la activación del huevo

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

Aprende a visualizar ensamblaje de varillas de actina intranuclear en embriones de Drosophila bajo estrés térmico mediante microinyección de actina globular conjugada con rodamina. Este protocolo permite estudiar dinámica de actina en vivo.

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