Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

Este protocolo ayudará a los investigadores a determinar con mayor precisión el estado oligomérico nativo de las proteínas de membrana mediante la utilización del sistema de nanopartículas de membrana celular nativa junto con la microscopía electrónica. La ventaja de esta técnica es que proporciona datos estructurales precisos de las proteínas de membrana en un entorno similar a la membrana de una célula nativa, y se puede utilizar para la futura determinación de estructuras de alta resolución. Kyle Kroeck, becario postdoctoral de mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

Para preparar nanopartículas de membrana celular nativa, resuspenda un gramo de la membrana pellet de interés en 10 mililitros de NCMN Buffer A. Utilice un homogeneizador Dounce de vidrio para homogeneizar la muestra de membrana celular resuspendida a 20 grados Celsius y transfiera la muestra suspendida a un tubo de polipropileno de 50 mililitros. Añada una solución madre de polímero activo de membrana y un tampón NCMN A adicional a la muestra hasta una concentración final de 2,5% de polímero activo de membrana y agite la solución durante dos horas a 20 grados centígrados. Al final de la incubación, ultracentrífuga la muestra.

Durante la centrifugación, equilibre una columna NTA de níquel de cinco mililitros con 25 mililitros de tampón NCMN A.At final de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a la columna y use una bomba de jeringa configurada a un caudal de 0,5 mililitros por minuto para cargar el sobrenadante en la columna a 20 grados Celsius. Lave las líneas de la máquina de cromatografía líquida rápida de proteínas con suficiente tampón B NCMN para enjuagar completamente el sistema y conecte la columna a la máquina de cromatografía. Lave la columna con 30 mililitros de tampón B NCMN a un caudal de un mililitro por minuto y recoja el caudal.

Lave la columna con 30 mililitros de tampón NCMN C a un caudal de un mililitro por minuto y recoja el caudal. Eluir la proteína con 20 mililitros de NCMN Buffer D a un caudal de 0,5 mililitros por minuto y utilizar un colector de fracciones para recoger fracciones de un mililitro de la muestra, luego almacenar las muestras de proteínas a cuatro grados Celsius utilizando SDS-PAGE para comprobar las muestras que corresponden a los picos observados en el gráfico de elución de cromatografía líquida de proteínas rápidas. Para preparar rejillas de tinción negativas, envuelva un portaobjetos de vidrio con papel de filtro con el lado de carbón hacia arriba y coloque las rejillas que se van a utilizar para la preparación de la muestra en el portaobjetos.

Coloque el portaobjetos de vidrio con las rejillas del microscopio electrónico en la cámara de un descargador de incandescencia entre los dos electrodos y vuelva a colocar la tapa de vidrio asegurándose de que la tapa esté centrada y bien sellada. Haga funcionar la máquina de descarga de brillo y asegúrese de que la luz púrpura generada por el plasma sea visible. Cuando la máquina termine de funcionar, espere hasta que la cámara haya alcanzado la presión atmosférica antes de quitar la tapa de vidrio y colocar la corredera en el banco.

Ajuste la concentración de las muestras de proteína purificada a aproximadamente 0,1 miligramos por mililitro y cargue 3,5 microlitros de la muestra de proteína en la rejilla de carbono de 10 nanómetros de grosor. Después de un minuto, use un trozo de papel de filtro para eliminar el líquido de la superficie de la rejilla de microscopía electrónica y lave la superficie de la rejilla tres veces con una gota de agua de tres microlitros por lavado. Después del último lavado con agua, lave la superficie de la rejilla dos veces más con tres gotas de microlitros de acetato de uranio al 2% recién filtrado por lavado.

Después del último lavado de acetato de uranio, tiñe la rejilla con una gota de tres microlitros de acetato de uranio al 2% recién filtrado durante un minuto. Al final de la incubación, use un nuevo trozo de papel de filtro para eliminar la gota y seque al aire la rejilla durante al menos un minuto antes de almacenar la rejilla en una caja de rejilla para su uso posterior. Aquí, se pueden observar imágenes de tinción negativas obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión, como se ha demostrado.

La imagen de tinción negativa para la muestra de proteína B del canal de resistencia a la acraflavina de tipo salvaje purificada con detergente revela una solución homogénea de partículas monodispersas con la proteína que muestra una estructura cuaternaria trimérica bien definida. Estas estructuras triméricas se corresponden con el cromatograma de exclusión de tamaño observado después de la purificación. En comparación, en la imagen de tinción negativa para el mutante P223G también purificado con detergente, se puede observar una solución heterogénea de nanopartículas polidispersas con una propensión a la agregación, pero sin trímeros nativos observables.

Estos resultados también están respaldados por la cromatografía de exclusión por tamaño. Se observaron resultados similares para las proteínas de tipo salvaje y mutantes después de la purificación con el polímero activo de membrana NCMNP11. El uso del polímero NCMNP52 facilita la generación de nanopartículas de membrana celular nativa en tamaños mucho más grandes, lo que permite obtener imágenes de múltiples trímeros de proteína B del canal de resistencia a la acraflavina en una sola partícula de membrana celular nativa.

En la muestra mutante, sin embargo, no se observan partículas de trímero, incluso cuando se observan los grandes parches de bicapa de la membrana celular nativa. El análisis SDS-PAGE de las muestras de proteínas purificadas confirma la presencia de resistencia B a la acraflavina en todas las muestras con una pureza superior al 95% con el peso molecular previsto de la proteína. Al modificar este protocolo para otras proteínas, es importante determinar experimentalmente la cantidad adecuada de fracción de membrana y la longitud, el tiempo y la temperatura para el proceso de solubilización.

Si las imágenes de su muestra revelan una solución homogénea de partículas monodispersas con unidades estructurales bien definidas, la muestra se puede utilizar para la determinación de estructuras de alta resolución con criomicroscopía electrónica.