Name: Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende a diferenciar podocitos maduros a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante un protocolo químicamente definido sin manipulación genética. Este método de alta eficiencia permite modelar enfermedades renales y desarrollar nuevas terapias.

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Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ingeniería Pratt de la Universidad de Duke, la División de Nefrología de la Escuela de Medicina de Duke, el Premio de Investigación de una Cátedra del Departamento de Medicina de la Universidad de Duke y un Premio Ad Hoc de Transición de Carrera PDEP del Fondo Burroughs Wellcome a S.M. M.B fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Laboratorio Bursac por proporcionarnos generosamente la línea de células madre DU11, y al Laboratorio Varghese de la Universidad de Duke por compartir temporalmente sus instalaciones de cultivo de tejidos con nuestro grupo. Esta publicación está dedicada a la Prof. Laura L. Kiessling, Profesora de Química de Novartis en el Instituto de Tecnología de Massachusetts, en celebración de su 60cumpleaños.

1. Preparación de reactivos
<ol><li>Suplemento diluido de medios de cultivo celular hiPS (CCM) descongelado en medio basal de cultivo celular hiPS para obtener una solución 1x de hiPS CCM. NOTA: El suplemento congelado 5x hiPS CCM requiere un proceso de descongelación lento, idealmente en 4 ° C durante la noche. Las alícuotas del 1x hiPS CCM se pueden almacenar hasta 6 meses a -20 °C.</li>
	<li>Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 1 para cultivo celular hiPS: Descongelar la matriz BM 1 durante la noche sobre hielo a 4 °C. Una vez descongeladas, prepare las alícuotas con los factores de dilución apropiados según lo sugerido por el fabricante. NOTA: Por lo general, las alícuotas se preparan para su posterior dilución en 25 ml de DMEM / F12 frío en un tubo cónico de 50 ml seguido de una mezcla completa para disolver completamente la matriz BM 1 y evitar la formación de cristales residuales.</li>
	<li>Transfiera 1 ml de la solución de matriz BM 1 a cada pozo de una placa de 6 pozos e incube a 37 °C durante 1-2 h o a 4 °C durante un mínimo de 24 h, envuelto en película de parafina. Las placas recubiertas de matriz BM 1 se pueden almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 2 semanas.</li>
	<li>Preparación de la matriz 2 de la membrana basal (BM) - placas recubiertas: Diluya las cantidades apropiadas de la matriz BM 2 en agua destilada estéril de 9 ml para preparar una concentración final de 5 μg / ml. Añadir 700 μL de la solución de matriz BM 2 a cada pozo de una placa de 12 pozos e incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h o durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Preparar soluciones de 100 μg/ml de BSA cada una de BMP7, Activina A y VEGF de la siguiente manera: reconstituir BMP7 en agua destilada estéril que contenga 0,1% (wt/vol) de BSA y reconstituir Activina A y VEGF por separado en PBS estériles que contengan 0,1% (wt/vol) de BSA. Para evitar ciclos frecuentes de congelación-descongelación, prepare alícuotas de 100 μL de cada solución de stock y guárdelo a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
	<li>Preparar una solución de 10 mM de Y27632 disolviendo 10 mg de Y27632 en 3.079 mL de agua destilada estéril. Alícuota 100 μL del stock y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
	<li>Disolver 2 mg de CHIR99021 en 143,4 μL de DMSO estéril para preparar una solución de 30 mM. Preparar alícuotas de 5 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 1 mes (o según la recomendación del fabricante).</li>
	<li>Disolver 10 mg de ácidotodo-trans retinoico en 3,33 ml de DMSO estéril. Preparar alícuotas de 500 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
</ol>2. Preparación de medios culturales
<ol><li>Preparar el medio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL de Activina A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 y 1x suplemento libre de suero B27 en un volumen apropiado de DMEM/12 con suplemento de glutamina. NOTA: El medio de diferenciación del mesodermo debe estar recién preparado antes de los pasos de diferenciación y a un volumen apropiado para la escala del experimento (típicamente, 50 ml de medio es adecuado para dos placas de 12 pozos).</li>
	<li>Preparar el medio intermedio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 y 1x suplemento libre de suero B27 en DMEM/F12 con un suplemento de glutamina. NOTA: Si es necesario, el medio se puede complementar con 1% (vol/vol) de penicilina-estreptomicina. Ajuste el volumen del medio usando DMEM / F12 con suplemento de glutamina. Este medio se puede preparar en grandes lotes; sin embargo, se recomienda almacenar en alícuotas más pequeñas (por ejemplo, 45 ml en tubos cónicos de 50 ml) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Este medio se puede almacenar a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses y se puede descongelar a 4 °C durante la noche antes de su uso.</li>
	<li>Preparar el medio de inducción de poocitos reconstituyendo a una concentración final 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL de activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento libre de suero B27 y 0,1 μM de ácido todo-trans retinoico en DMEM/F12 con suplemento de glutamina. Proteja el medio de la luz (por ejemplo, envolviendo el recipiente con papel de aluminio). NOTA: Este medio se puede preparar en grandes lotes y almacenar en la oscuridad a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses. Las alícuotas congeladas deben descongelarse durante la noche a 4 °C antes de su uso.</li>
	<li>Preparar 25 ml de solución neutralizante de tripsina añadiendo fbs inactivado por calor al 10% (vol/vol) en DMEM/F12 y filtrar en condiciones estériles.</li>
	<li>Para el mantenimiento posterior a la diferenciación de los podocitos derivados de células madre, prepare complete Medium con medios de mantenimiento de podocitos agregando el suplemento al medio basal según las pautas del fabricante y guárdelo a 4 ° C durante un total de dos semanas.</li>
</ol>3. Cultivo celular hiPS sin alimentador utilizando medio de cultivo celular hiPS
<ol><li>Aspire la solución residual de la matriz BM 1 de las placas pre-recubiertas y lave los pozos 3 veces con 1 a 2 ml de DMEM/F12 calentado.</li>
	<li>Aspire el CCM hiPS gastado de las células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 calentado. Agregue 1 ml de solución de desprendimiento de células calientes e incube durante 1 min a 37 ° C para ayudar a disociar las células. Realice una inspección visual de las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos y asegúrese de que los bordes de las colonias celulares parezcan redondeados, luego aspire rápidamente la solución de desprendimiento celular de las células (asegurando que las colonias celulares todavía estén unidas a la placa, aunque sea libremente). Enjuague suavemente las células una vez con DMEM/F12 para eliminar la solución de desprendimiento celular.</li>
	<li>Agregue 3 ml de hiPS CCM a las células hiPS (en cada podo de una placa de 6 pomos) que se trataron con la solución de desprendimiento celular. Raspe las colonias usando un elevador de células y pipete suavemente la suspensión de celdas hacia arriba y hacia abajo para desalojar las celdas adheridas. Lave bien el plato para asegurarse de que todas las células se cosechan. NOTA: Se recomienda el uso de una pipeta de 5 ml para evitar el exceso de cizalla en las células.</li>
	<li>Transfiera 0,5 ml de la suspensión celular a cada pozo de una nueva placa de 6 pomos recubierta de matriz BM de 1 que contiene 2 ml de HIPS CCM por pozo. Mueva la placa de la figura ocho para distribuir colonias celulares dentro de los pozos e incube a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. Refrescar el medio diariamente hasta que las células estén listas para ser pasadas o utilizadas para el experimento de diferenciación (aproximadamente 70 % de confluencia). NOTA: El tamaño ideal de la colonia para el paso rutinario de iPSCs es de entre 200-500 μm en condiciones libres de alimentador utilizando hiPS CCM (sin inhibidor de ROCK). Si las células se individualizan durante el tratamiento con enzimas de disociación o tampones, el HIPS CCM se puede complementar con un inhibidor de ROCK (por ejemplo, 10 μM Y27632) para mejorar la viabilidad celular.</li>
</ol>4. Diferenciación de células hiPS en células mesodérmicas (días 0-2)
<ol><li>Mientras que los cultivos celulares hiPS se encuentran en la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente dentro de los 4 días posteriores al cultivo después del paso, y alrededor del 70% de confluencia), inspeccione visualmente la presencia de células diferenciadas espontáneamente dentro y alrededor de los bordes de las colonias. Si es necesario, raspe asépticamente las áreas de diferenciación.</li>
	<li>Aspire hiPS CCM de células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 caliente. Incubar las células con 1 ml de tampón de disociación celular libre de enzimas durante 10 min a 37 °C y comprobar la disociación bajo un microscopio. Debido a las diferencias inherentes entre las diferentes líneas celulares hiPS, el tiempo de incubación real para el tampón de disociación celular debe determinarse para una línea celular determinada.</li>
	<li>Raspe suavemente el pozo con un elevador de células para desalojar las células adheridas y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para individualizar las células hiPS.<ol>
<li>Lleve la suspensión celular al volumen de 15 ml con DMEM/F12 caliente y centrífuga durante 5 min a 290 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire suavemente el sobrenadante y resuspónda las células con DMEM / F12 caliente para otra ronda de centrifugación para eliminar los componentes residuales de la matriz BM 1 y el tampón de disociación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en 1 ml de medio de inducción del mesodermo como se describe anteriormente. Contar el número total de células utilizando un hemocitómetro o un contador de coulter para determinar el volumen apropiado del medio de diferenciación del mesodermo necesario para lograr una concentración de 1 x 105 células/ml.</li>
	<li>Aspire la solución de ECM de las placas recubiertas de 2 matrices BM y enjuague las placas dos veces con DMEM / F12 caliente. Mezcle la suspensión de la celda hiPS suavemente pipeteando varias veces. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a cada pozo de las placas de 12 pozos recubiertas de 2 matriz BM y luego agite suavemente las placas para distribuir las células de manera más uniforme.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2. Refresque el medio de inducción del mesodermo al día siguiente. NOTA: Después de 2 días, las células mesodérmicas derivadas de células hiPS estarían listas para la inducción intermedia del mesodermo.</li>
</ol>5. Diferenciación de células mesodérmicas derivadas de células hiPS en mesodermo intermedio (días 2-16)
<ol><li>En el día 2 del protocolo de diferenciación, aspirar el medio de inducción del mesodermo y reponer con 1 mL por medio de inducción del mesodermo intermedio del pozo.</li>
	<li>Refrescar el medio todos los días para mantener un umbral preciso de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para las células metabólicamente activas. Si hay un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de los nutrientes de los medios (indicado por el amarilleo de los medios), el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 ml por podo de las placas de 12 pomos.</li>
	<li>Células de cultivo durante 14 días adicionales para obtener células mesodérmicas intermedias. Para el día 16, estas células se pueden criopreservarse para su uso posterior.</li>
</ol>6. Diferenciación de células mesodérmicas intermedias derivadas de células hiPS en podocitos (días 16 a 21)
<ol><li>Enjuague las células mesodérmicas intermedias con DMEM/F12 caliente seguido de incubación de las células con 0,5 ml por podo de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 3 min a 37 °C. Realice una inspección visual para asegurarse de que las células están comenzando a disociarse.</li>
	<li>Raspar las células usando un elevador celular y pipetear la suspensión celular varias veces usando una punta de pipeta de 1,000 μL para obtener células individualizadas (o pequeños grupos de). NOTA: En esta etapa, asegúrese de que las células estén completamente disociadas, ya que las células agregadas pueden no adquirir un fenotipo diferenciado terminalmente dentro de la línea de tiempo del protocolo.</li>
	<li>Agregue aproximadamente 2 ml por pozo de solución neutralizante de tripsina para detener la actividad de la tripsina.</li>
	<li>Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml y lleve el volumen hasta 50 ml utilizando DMEM / F12, y luego centrífuga la suspensión de la celda durante 5 minutos a 201 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en el medio de inducción de poocitos. Para obtener resultados óptimos, asegure una densidad de siembra final de aproximadamente 100,000 células / pozo de una placa de 12 pozos. Agregue la suspensión celular a las placas recubiertas de 2 matrices BM y agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las células de manera más uniforme.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 y refrescar el medio diariamente durante un total de 5 días para obtener podocitos para el día 21. NOTA: Los podocitos derivados de células hiPS resultantes se pueden mantener en cultivo durante 2-4 semanas adicionales mediante el uso de medio completo con medios de mantenimiento de podocitos. Una vez en los medios de mantenimiento de podocitos, las células se pueden alimentar cada dos días y se pueden utilizar para estudios posteriores o análisis posteriores.</li>
</ol>

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<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
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</ol>

S.M. es autor de una patente pendiente para métodos para la generación de podocitos renales a partir de células madre pluripotentes (solicitud de patente estadounidense 14/950859). Los autores restantes declaran que no tienen intereses contrapuestos.

En este informe, describimos un protocolo para la generación de podocitos glomerulares renales a partir de células hiPS. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben características morfológicas y moleculares asociadas con el fenotipo13de podocitos renales maduros. En publicaciones anteriores, demostramos que los podocitos derivados de células hiPS pueden imitar la estructura y la función de filtración selectiva del glomérulo renal cuando se cocultivan con células endoteliales microvasculares g...

Los avances en el cultivo de células madre pluripotentes humanas están a punto de revolucionar la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos al proporcionar a los investigadores una fuente renovable y escalable de material biológico que puede diseñarse para obtener casi cualquier tipo de célula dentro del cuerpo humano1. Esta estrategia es especialmente útil para derivar tipos de células especializadas y funcionales que de otro modo serían difíciles de obtener. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS)2,3,4,5 son particularmente atractivas debido a su origen celular somático y al potencial que representan para la medicina personalizada. Sin embargo, el desarrollo de métodos para derivar otros linajes celulares a partir de células hiPS sigue siendo un desafío debido al uso frecuente de condiciones de cultivo mal definidas que conducen a una baja eficiencia y a la generación inespecífico de poblaciones de células heterogéneas6,7.
Aquí se presenta un método para la derivación de podocitos renales maduros a partir de células hiPS con especificidad y alta eficiencia en condiciones químicamente definidas. Al considerar los roles de múltiples factores dentro del microambiente celular, se desarrolló una estrategia de diferenciación de células madre que implicó la optimización de factores solubles presentados en el medio de cultivo celular, así como factores insolubles, como componentes de matriz extracelular o sustratos adhesivos. Dada la importancia de la señalización de la integrina en el desarrollo y la función de los podocitos, se examinó inicialmente la expresión de los receptores de integrina en la superficie celular. Las integrinas β1 se expresaron altamente no solo en las células hiPS, sino también en sus derivados, incluidas las células mesodermo y mesodermointermedias 8,9,10. Experimentos posteriores confirmaron que los ligandos que se unen a las integrinas β1 (incluyendo laminina 511 o el fragmento de laminina 511-E8) apoyan la adhesión y diferenciación de las células hiPS en podocitos cuando se usan junto con los medios inductivos solubles que se describen a continuación.
La inducción del compromiso de linaje celular se inició confirmando primero que las células hiPS cultivadas en las superficies recubiertas de laminina durante dos días en presencia de un medio que contiene Activina A, CHIR99021 e Y27632 El inhibidor de roca puede diferenciarse en células que expresan los marcadores tempranos del mesodermo HAND1, goosecoid y brachyury8,11. El tratamiento de las células mesodérmicas durante 14 días con un medio suplementado con proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y CHIR99021 permitió la derivación de células mesodérmicas intermedias que expresaban los marcadores de células progenitoras de nefrona Tumor de Wilm 1 (WT1), proteína relacionada extrañamente omitida 1 (OSR1)8,11y proteína pareada del gen 2 de la caja (PAX2)12. Para derivar los podocitos glomerulares renales maduros, las células mesodérmicas intermedias se trataron durante 4-5 días con un nuevo medio que consiste en BMP-7, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ácido retinoicoall-trans y CHIR99021. Se utilizó la citometría de flujo y la inmunotinción para confirmar que >90% de las células resultantes exhibían las características moleculares, morfológicas y funcionales del podocito renal maduro8,11,13. Estas características incluyen el desarrollo de procesos primarios y secundarios del pie; la expresión de genes específicos del linaje de podocitos, incluidos SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 y la expresión de proteínas como podocina, nefrina y WT114,15,16. Además, se encontró que los podocitos derivados de células hiPS se pueden mantener en cultivo durante un máximo de cuatro semanas in vitromedianteel uso de un medio disponible comercialmente 8,11 que proporciona una flexibilidad adicional en el momento de los experimentos posteriores. Para obtener más información sobre los paneles de citometría de flujo utilizados para determinar la pureza de los hiPS-podocitos, consulte nuestra publicación anterior11.

<table><tbody><tr><td><Células > fuertes</fuertes></td>DU11 células iPS humanas La línea celular iPS DU11 (clon #11 de la Universidad de Duke) se generó en las instalaciones centrales de iPSC de la Universidad de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Duke y nos fue proporcionada por el Laboratorio Bursac de la Universidad de Duke.<td></td><td></td><td> Esta línea ha sido analizada para micoplasma y nuestro laboratorio realizó el cariotipo por última vez en julio de 2019, y resultó ser cariotípicamente normal.</td></tr><tr><td><Factores >Crecimiento fuerte y suplementos de medios</>Ácido</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>retinoico trans fuerte (500 mg)</td><td>72262</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento sin suero</td><td>17504044</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>Puede mostrar una variación de lote a lote</td></tr><tr><td>Kit mediano completo con CultureBoost-R</td><td>4Z0-500-R</td><td>Sistemas de celdas</td><td>Medios de mantenimiento de podocitos</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con suplemento GlutaMAX</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>DMEM/F12 con suplemento de glutamina</td></tr><tr><td>FBS inactivado por calor 10082147</td><td></td><td>Thermo/Life Technologies Activina</td><td></td></tr><tr><td>humana A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life Tecnologías</td><td></td></tr><tr><td>BMP7 humano</td><td>PHC9544</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano</td><td>PHC9394</td><td>medio Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>05850</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>medios de cultivo celular hiPS (CCM)</td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; estreptomicina líquida (100&veces;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 Inhibidor de ROCK</td><td>1254</td><td>Tocris</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; y Alexa Fluor 594&ndash; anticuerpos secundarios conjugados</td><td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury(T)</td><td>ab20680</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R& D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8) fragmento</td><td>N-892012</td><td>Iwai Norteamérica</td><td>Matriz de membrana basal (BM) 2</td></tr><tr><td>Matrigel Matriz calificada para hESC, vial de 5 ml</td><td>354277</td><td>BD Biociencias</td><td>Matriz de membrana basal (BM) 1. Puede mostrar una variación de lote a lote</td></tr><tr><td><fuerte>Enzimas y otros reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutasa</td><td>A1110501</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Solución de desprendimiento de celdas</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>D2438</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DMSO es tóxico. Debe manipularse en una campana de seguridad química</td></tr><tr><td>Tampón de disociación celular sin enzimas, Hank' Sal equilibrada 13150016</td><td></td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Solución de etanol, 70% (vol/vol), grado biotecnológico</td><td>97065-058</td> El etanol de <td>VWR</td><td>es inflamable y tóxico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>28906</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>El PFA debe manipularse en una campana de gases químicos con el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, bata de laboratorio y anteojos de seguridad. Evite la inhalación y el contacto con la piel.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>14190-250</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada estéril</td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de aspiración, envueltas individualmente</td><td>29442-462</td><td>Centrífuga Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R</td><td>B99516</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico, 15 mL</td><td>352097</td> Tubo de centrífuga <td>cónico Corning</td><td></td></tr><tr><td>, 50 mL</td><td>352098</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes</td><td>3395465</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Para el almacenamiento de productos congelados alícuotas</td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Microscopio fluorescente utilizado para adquirir imágenes de células iPS fijadas y teñidas y sus derivados</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>100503-092</td><td>Incubadora</td> de CO2 VWR <td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Para el cultivo y mantenimiento rutinarios</td></tr> <tr><td>de células iPS y sus derivadosZeiss Axio Observer invertido equipado con cámara AxioCam 503</td><td>491916-0001-000(microscopio) ; 426558-0000-000(cámara)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Se utiliza para adquirir imágenes de contraste de fase de células iPS vivas y sus derivados en cada etapa de la diferenciación de podocitos</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo Kimberly-Clark</td><td>40101-346</td><td>Toallitas Kimwipe VWR</td><td></td></tr>, <tr><td>grandes</td><td>21905-049</td><td>Toallitas Kimwipes VWR</td><td></td></tr>, <tr><td>pequeñas</td><td>21905-026</td><td>Puntas</td> de pipeta de barrera de precisión VWR <td></td></tr><tr><td>P10</td><td>P1096-FR</td> Puntas de pipeta <td>de barrera Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P100</td><td>P1125</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P1000 puntas de pipeta de barrera</td><td>P1126</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P20 puntas de pipeta de barrera P1121</td><td></td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P200 Puntas</td> <td>de pipeta de barreraP1122</td> Pipeta serológica <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>, 10 mL, envuelta individualmente</td><td>356551</td><td>Pipeta</td> serológica Corning<td></td></tr><tr><td>, 25 mL, envuelta individualmente</td><td>356525</td><td>Pipeta</td> serológica Corning<td></td></tr><tr><td>, 5 mL, envuelta individualmente</td><td>356543</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0,22 &mu; m, PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMD Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estériles</td><td>1138W14</td><td>Thomas Scientific</td><td>Para la alícuota de factores de crecimiento</td></tr><tr><td>Cultivo de tejidos&ndash; placas de 12 pocillos tratadas</td><td>353043</td> cultivo <td>de tejidos de Corning</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; placas de seis pocillos tratadas</td><td>353046</td><td>Corning Bata</td><td></td></tr> de <tr><td>laboratorio VWR blanca techuni</td><td>10141-342</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de celdas de bisel ancho</td><td>3008</td><td>Corning</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

La enfermedad renal afecta a más del 10% de la población mundial y cuesta miles de millones de dólares en gastos federales. Las formas más graves de enfermedad renal y eventual insuficiencia renal en etapa terminal a menudo son causadas por el daño a los podocitos glomerulares, que son las células epiteliales altamente especializadas que funcionan junto con las células endoteliales y la membrana basal glomerular para formar la barrera de filtración del riñón. Los avances en medicina renal se han visto obstaculizados por la limitada disponibilidad de tejidos primarios y la falta de métodos robustos para la derivación de células renales humanas funcionales, como los podocitos. La capacidad de derivar podocitos de fuentes renovables, como las células madre, podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de los mecanismos del desarrollo y la enfermedad renal humana, así como proporcionar nuevas herramientas para el descubrimiento terapéutico. El objetivo de este protocolo era desarrollar un método para derivar podocitos maduros postmitóticos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS) con alta eficiencia y especificidad, y en condiciones químicamente definidas. Los podocitos derivados de células hiPS producidos por este método expresan marcadores específicos del linaje (incluyendo nefrina, podocina y tumor de Wilm 1) y exhiben las características morfológicas especializadas (incluidos los procesos primarios y secundarios del pie) asociadas con podocitos maduros y funcionales. Curiosamente, estas características especializadas están notablemente ausentes en la línea celular de podocitos inmortalizados ampliamente utilizada en el campo, lo que sugiere que el protocolo descrito aquí produce podocitos renales humanos que tienen un fenotipo de desarrollo más maduro que las líneas celulares de podocitos existentes típicamente utilizadas para estudiar la biología del riñón humano.

El objetivo de este protocolo era demostrar que los podocitos humanos maduros pueden derivarse de células hiPS en condiciones químicamente definidas. Los datos presentados en este manuscrito se generaron mediante el uso de la línea celular DU11 hiPS17,que se probó por primera vez y se encontró que estaba libre de micoplasma. También se realizó un análisis cromosómico, y se encontró que las células eran cariotípicamente normales. Comenzando con las células hiPS DU11 indiferenciadas, la estrategia d...

Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Los protocolos para la diferenciación de células madre en células renales funcionales siguen siendo difíciles de alcanzar. Este método produce podocitos maduros con especificidad y eficiencia, proporcionando nuevas herramientas para estudiar los mecanismos de la enfermedad renal. Este método emplea medio de cultivo celular y proteínas de matriz extracelular con una composición químicamente definida para producir podocitos derivados de células iPS humanas con una alta pureza sin utilizar la selección de subpoblaciones o la manipulación genética.Las opciones terapéuticas para los pacientes con enfermedad renal son limitadas. Este método tiene implicaciones para el modelado y la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, lo que podría facilitar el desarrollo de nuevos biomarcadores y terapias. Para establecer un cultivo de iPSC humano libre de alimentador, aspire la solución residual de la matriz de membrana basal 1 de placas prerrevestidas y lave los pocillos tres veces con uno o dos mililitros por pocillo de medio basal calentado.Aspire el medio de cultivo celular gastado de un cultivo de iPSC humano y enjuague las células tres veces con medio caliente. Agregue un mililitro de solución de desprendimiento de celda tibia a cada pocillo para una incubación de un minuto a 37 grados Celsius. Después de confirmar los bordes redondeados de la colonia celular bajo un microscopio de cultivo de tejidos, aspire rápidamente la solución de desprendimiento celular y enjuague suavemente las células con medio de cultivo celular.Agregue tres mililitros de medio de cultivo de iPSC humano a las células madre pluripotentes inducidas por humanos y use un elevador de células para raspar las colonias. Pipetear suavemente la suspensión celular para desalojar las células poco adheridas y lavar bien la placa para asegurar la recolección de todas las células. Transfiera 500 microlitros de células a cada pocillo de una nueva matriz de membrana basal: 1 placa recubierta de seis pocillos que contenga dos mililitros de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano por pocillo, y mueva la placa en forma de ocho para distribuir uniformemente las colonias celulares dentro de los pocillos.Coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares, refrescando el medio diariamente hasta que las células alcancen aproximadamente el 70% de confluencia. Si es necesario, raspe asépticamente las áreas de diferenciación antes de aspirar el sobrenadante de los pocillos. Después de lavar los pocillos tres veces, disocie las células como se muestra y extraiga las suspensiones celulares resultantes en un tubo cónico de 15 mililitros.Después de mezclar por pipeteo, lleve el volumen final en el tubo a 15 mililitros con medio caliente y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en medio fresco para una segunda centrifugación y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio de inducción mesodermo para contar. Después del conteo, vuelva a suspender las células a una concentración de una por 10 a la quinta célula por mililitro de mésodmo y aspire la solución de matriz extracelular de la matriz de membrana basal 2 placas recubiertas.Enjuague las placas dos veces con medio tibio y mezcle la suspensión de células madre pluripotentes inducidas por el hombre con un pipeteo suave. Agregue un mililitro de células a cada pocillo de la matriz de membrana basal 2 placas de 12 pocillos recubiertas y agite suavemente las placas para distribuir las células de manera más uniforme. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares.En los días 2-15 de la diferenciación, reemplace el medio de inducción del mesodermo con un mililitro de medio de inducción del mesodermo intermedio por pocillo. Si se observa un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de nutrientes, como lo indica el color amarillento del medio, el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 mililitros por pocillo. En el día 16 de cultivo, enjuague las células del mesodermo intermedio con medio tibio e incube las células con 500 microlitros de EDTA de tripsina al 0,05% por pocillo durante tres minutos a 37 grados centígrados.Cuando las células comiencen a disociarse, raspe las células con un elevador de células y mezcle suavemente las células mediante pipeteo. Detenga la reacción con aproximadamente dos mililitros de solución neutralizante de tripsina por pocillo y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros. Lleve el volumen hasta 50 mililitros con medio y recoja las células por centrifugación.Vuelva a suspender el pellet en el medio de inducción de podocitos a una concentración de 10 a la quinta célula por mililitro de medio y agregue las células a la matriz de membrana basal 2 placas recubiertas. A continuación, agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las células de manera más uniforme y colóquelas en la incubadora durante un máximo de cinco días. Utilizando la estrategia de cultivo demostrada, las células madre se pueden diferenciar primero en células mesodermas que expresan Brachyury, seguidas de la diferenciación en células mesodermas intermedias PAX2 positivas y, finalmente, podocitos glomerulares renales maduros.Los podocitos derivados de células madre dan positivo para WT1, así como para la nefrina, marcador de identificación de linaje. Curiosamente, la localización subcelular de la nefrina se encuentra predominantemente dentro de los procesos del pie del podocito y el citoplasma celular, lo que es consistente con un fenotipo de podocito maduro. Las células sembradas a densidades que superan significativamente la densidad recomendada de una por 10 a la quinta célula por pocillo de una placa de 12 pocillos dan como resultado grandes grupos de células que carecen del fenotipo morfológico esperado de podocitos maduros dentro de la línea de tiempo estándar del protocolo.Sin embargo, la siembra a las densidades recomendadas en este protocolo da como resultado cultivos de células con la morfología deseada. Recomendamos utilizar la proteína de la membrana basal adecuada para el desprendimiento celular y mantener la densidad de siembra celular correcta para la inducción del mesodermo y los podocitos. Este método de diferenciación de podocitos puede integrarse con órganos en chips, sistemas microfluídicos o tecnologías de bioimpresión 3D para desarrollar modelos funcionales del riñón humano para el cribado de fármacos y las pruebas de nefrotoxicidad.La falta de modelos de cultivo celular apropiados ha impedido avanzar en la comprensión de los mecanismos de la enfermedad renal. Este protocolo proporciona a los investigadores una fuente inagotable de podocitos derivados de pacientes para el modelado de enfermedades.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

En este video, describimos el protocolo para derivar podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas a través de la diferenciación celular bajo condiciones químicas definidas. Los podocitos generados se pueden utilizar para pruebas de nefrotoxicidad y modelado de enfermedades.

Derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas: un procedimiento para la diferenciación dirigida de podocitos renales maduros a partir de células madre

Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.

Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas

Aquí se presenta un protocolo para diseñar un sistema personalizado de órgano en un chip que recapitula la estructura y función de la barrera de filtración glomerular renal mediante la integración de células endoteliales epiteliales y vasculares genéticamente emparejadas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos. Este sistema de bioingeniería puede avanzar en la medicina de precisión renal y aplicaciones relacionadas.

Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este manuscrito describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos a través de la reprogramación episomal en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y la posterior diferenciación en podocitos.

Generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel

Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.

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Hemos optimizado una técnica de microencapsulación como una plataforma efectiva en 3D para la propagación y la diferenciación de células madre embrionarias para endodermo y las neuronas dopaminérgicas (DA). También proporciona una oportunidad para inmune-aislamiento de células del huésped durante el trasplante. Esta plataforma se puede adaptar para otros tipos de células.

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Este protocolo describe el desarrollo, la expansión, y en la formación de imágenes in vivo de células NK derivadas de hESCs y iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.

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Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D23]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

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Aprende a diferenciar podocitos maduros a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante un protocolo químicamente definido sin manipulación genética. Este método de alta eficiencia permite modelar enfermedades renales y desarrollar nuevas terapias.

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas (Video) | JoVE Journal

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

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