Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Este estudio permite flexibilidad en la creación de tumores óseos primarios o metástasis óseas mediante la colocación de injertos tumorales sólidos en el hueso. Esta técnica es una diferencia con la inyección de suspensiones de células tumorales en el hueso. Este método supera la limitación de las inyecciones de suspensión de células tumorales, los émbolos pulmonares.

Otra ventaja es la creación de un modelo más uniforme en comparación con la metástasis ósea espontánea o después de la inyección intravascular de células. A partir de la implantación de injertos tumorales sólidos, existen posibilidades más allá de los modelos humanos o de ratón, sino el uso de xenoinjertos derivados de pacientes que pueden conducir a terapias adaptadas a pacientes específicos. El enfoque principal es su uso en la investigación del cáncer, como el microambiente tumoral, la metástasis, el descubrimiento de fármacos, la genética del cáncer y la medicina de precisión.

La demostración visual es clave para mostrar los pasos clave de la creación del tumor subcutáneo, la disección y la creación del injerto tumoral, y la implantación quirúrgica en la tibia. Para la inducción de tumores subcutáneos, se recolecta la línea celular de interés utilizando una solución de disociación celular adecuada y se vuelven a suspender las células a una concentración de PBS estéril de una a dos veces 10 a la quinta célula a 100 a 150 microlitros. Coloque las celdas en hielo.

Limpie la piel expuesta con etanol al 70% y cargue las células en una jeringa de tuberculina equipada con una aguja de calibre 27. A continuación, inyecte la célula por vía subcutánea en una región de la piel desinfectada que no se vea afectada por el movimiento de los omóplatos. Use un calibrador para monitorear el tamaño del tumor subcutáneo que recubre el tórax dorsal o el abdomen, y mida el peso corporal del animal semanalmente para asegurarse de que el tumor no se ulcere o que el ratón no cumpla con los criterios de extirpación temprana establecidos por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

Cuando el tumor alcance los 15 milímetros en cualquier dimensión, use etanol al 70% para esterilizar la piel y use un bisturí de 15 para incidir la piel que recubre el tumor. Use tijeras quirúrgicas estériles para diseccionar el tumor de los tejidos blandos adheridos circundantes con nitidez y coloque el tumor en un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga un medio de crecimiento completo. Use el bisturí para picar el tumor en fragmentos del tamaño adecuado y coloque los fragmentos en un nuevo recipiente de medio de crecimiento completo estéril a temperatura ambiente.

Para la criopreservación, agrupe múltiples fragmentos en un solo criovial en un medio de crecimiento completo suplementado con un 20% de suero fetal bovino y un 10% de dimetilsulfóxido y utilice un sistema comercial de criopreservación a menos 80 grados Celsius para congelar gradualmente el tejido antes del almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. Para preservar los fragmentos tumorales para su posterior análisis, pero no para su futura implantación, congele las muestras mediante inmersión en nitrógeno líquido y almacene los fragmentos tumorales congelados a largo plazo a menos 80 grados centígrados. Para la implantación de fragmentos tumorales subcutáneos, primero se debe llevar la suspensión de fragmentos tumorales a temperatura ambiente.

A continuación, confirmar la falta de respuesta al reflejo pedal en un ratón receptor anestesiado y administrar analgesia por vía subcutánea. Para minimizar el posible traumatismo en la piel, use crema depilatoria para eliminar el vello en la articulación de la rodilla derecha y la tibia proximal de la extremidad posterior conectada. Frote la piel expuesta con etanol al 70%, seguido de exfoliantes alternados de clorhexidina y solución salina.

Mientras flexiona y extiende la articulación, visualice la tibia proximal como la región justo distal a la articulación de la rodilla y use una hoja de bisturí de 15 para crear una incisión de tres a cuatro milímetros a nivel de la tibia proximal en la cara medial de la extremidad a través de la piel y el tejido subcutáneo para exponer la corteza medial de la tibia proximal. Para crear un pequeño orificio en la corteza medial de la tibia proximal, use la punta de una aguja de calibre 25 para aplicar una presión suave mientras gira la punta aproximadamente dos milímetros distal a la articulación de la rodilla y equidistante entre las cortezas tibial craneal y caudal. Cuando se haya creado el orificio, use pinzas estériles o una aguja de calibre 27 a 30 para insertar un mínimo de fragmentos de tumor de 0.5 milímetros cúbicos en la cavidad medular de la tibia proximal y use una aguja de calibre 27 a 30 para manipular los fragmentos tumorales en el canal medular.

Después de colocar todos los fragmentos, oponer los bordes de la piel con el material adecuado y devolver al animal a su jaula con seguimiento hasta que esté ambulatorio. Luego, evalúe el crecimiento del tumor tibial de manera no invasiva mediante radiografía digital semanal, bioluminiscencia o imágenes de fluorescencia, y use calibradores para medir la extremidad en el sitio de implantación. El injerto exitoso se puede documentar con imágenes avanzadas.

En este análisis representativo, el defecto cortical creado para la implantación del injerto tumoral era visible en la tibia proximal una semana después de la implantación. En la segunda semana, se pudo observar osteólisis visible y remodelación ósea adyacente al defecto cortical. De la semana dos a la cinco, se produjo una destrucción ósea progresiva adicional y la formación de hueso nuevo asociado con el injerto y el crecimiento tumoral.

Se debe tener cuidado al crear un pequeño orificio en la tibia proximal. Confíe en girar la punta con una presión suave o mínima, permitiendo que la punta de la aguja haga el trabajo. Después de este procedimiento, se puede realizar la colocación de injertos tumorales en otros sitios óseos, la colocación de organoides o células tumorales en la matriz extracelular en el defecto óseo o análisis moleculares e histológicos, además de imágenes por imágenes.