Name: Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende el modelo de hemorragia subaracnoidea mediante doble inyección directa de sangre en la cisterna magna en ratones. Este protocolo estandarizado permite controlar la distribución hemorrágica con baja mortalidad para investigar nuevas dianas terapéuticas.

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Agradecemos a la plataforma PRIMACEN (Universidad de Normandie Rouen, Francia) por su equipo de imagen y al Sr. Arnaud Arabo, a la Sra. Julie Maucotel y a la Sra. Martine Dubois, por su alojamiento y cuidado de los animales. Agradecemos a la señora Celeste Nicola por prestar su voz a la grabación del protocolo. Este trabajo fue apoyado por el programa de maduración seinari Normandía, La Fundación AVC bajo la égida de la FRM, la Universidad Normandie Rouen y el Inserm. La Región de Normandía y la Unión Europea (proyecto 3R). Europa participa en Normandía con el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).

Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo la supervisión de H. Castel de conformidad con el Comité ético francés y las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y el Consejo para la Protección de los Animales Utilizados con Fines Científicos. Este proyecto fue aprobado por el CENOMEXA local y los comités éticos nacionales de investigación y pruebas de animales. Los ratones macho c57Bl/6J Rj (Janvier), de 8 a 12 semanas, se alojaron en condiciones ambientales estándar controladas: 22 oC a 1 oC, 12 horas/12 horas de ciclo de luz/oscuridad, y agua y alimentos disponibles ad libitum.
1. Configuración de la cirugía SAH y preparación para la inyección
<ol><li>Antes del comienzo de la cirugía, tire de un número adecuado de capilares de vidrio mediante el uso de un tirador de micropipeta. La pipeta de inyección debe presentar un diámetro interior de 0,86 mm y un diámetro exterior de 1,5 mm.</li>
	<li>Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) para la afección falsa.<ol>
<li>Preparar una solución con 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM de glucosa, 26,2 mM NaHCO3 en H2O, pH 7,4.</li>
		<li>Gas aCSF con 95% O2 y 5% CO2 durante 15 min, y luego añadir 2,5 mM CaCl2.</li>
		<li>Esterilice el aCSF oxigenado con un aparato de filtro de 0,22 m. La solución de aCSF puede ser estable durante 3-4 semanas a 4 oC. Si ha aparecido contaminación (solución turbia) o una formación de depósitos, deseche y haga aCSF fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolección de sangre de un donante homólogo de ratón<ol>
<li>Aísle la arteria carótida a lo largo de la tráquea y recoja la cantidad máxima de sangre mediante punción de la arteria carótida.</li>
		<li>En la práctica, coloque el ratón en una cámara de anestesia y cargue la cámara con 5% de isoflurano hasta que el animal pierda el conocimiento.</li>
		<li>Compruebe la falta de reflejos sujetando una de las dos extremidades posteriores para permitir el ajuste del procedimiento quirúrgico experimental.</li>
		<li>Recubrir una jeringa de 1 ml con una solución de heparina utilizando una aguja de 26 G (heparina sódica). Esto evitará la coagulación de la sangre durante los siguientes pasos.</li>
		<li>Instalar el animal posicionado en decúbito dorsal con las piernas separadas, y la nariz en una mascarilla de anestesia (mantenimiento de la anestesia con 2 a 2.5% isoflurano).</li>
		<li>Aísle la arteria carótida a lo largo de la tráquea diseccionando el músculo omohioides longitudinalmente. Una vez aislada la arteria, inserte la aguja hacia el corazón con la ayuda del gancho y los fórceps microdissecantes y recoja el máximo de sangre a través de una punción de la arteria carótida (se necesita 60 l por ratón SAH).</li>
		<li>Sacrificar el ratón donante anestesiado inmediatamente después de la recolección de sangre mediante el uso de la luxación cervical.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Animal (8-10 semanas de edad C57BL/6J ratones macho) preparación
<ol><li>Pese cada ratón con precisión utilizando una balanza electrónica. En el estudio actual, ratones tendrían peso corporal dentro del rango de 20 Para 25 gramos justo antes de la cirugía.</li>
	<li>Como se explicó anteriormente (ver pasos 1.3.2 y 1.3.3), inducir anestesia de ratones a ser operados.</li>
	<li>Afeitar el cuello y el espacio entre las orejas con un clipper eléctrico adecuado.</li>
	<li>Instalar el animal posicionado en decúbito ventral con las piernas separadas y la nariz en una mascarilla de anestesia (mantenimiento de anestesia con 2 y 2.5% isoflurano) en un marco estereotáctico.</li>
	<li>Compruebe que el ratón está durmiendo y que su cabeza está correctamente bloqueada.</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea 100 ml de buprenorfina (0,1 mg/kg) con una aguja de 26 G en la parte inferior de la espalda, para evitar el dolor después del despertar.</li>
	<li>Evitar la sequedad de los ojos mediante el uso de gel líquido protector y mantener una temperatura intrarectal de 37 oC mediante el uso de una manta eléctrica autorregulada.</li>
	<li>Tratar la zona afeitada del cuello posterior con una solución antiséptica (povidona-yodo o clorhexidina mediante el uso de una carretera de algodón estéril).</li>
	<li>Pre-esterilizar todos los instrumentos que tocan la piel preparada / tejido subcutáneo (calentamiento a 200 oC durante 2 horas) y manejar asépticamente.</li>
</ol>3. Inducción de SAH
<ol><li>El primer día (D-1)<ol>
<li>Cortar una incisión de 1 cm con tijeras delgadas en el cuello posterior, seguido de la separación de los músculos a lo largo de la línea media para acceder a la cisterna magna.</li>
		<li>Corte la punta de la pipeta de vidrio vacía con tijeras delgadas. A continuación, adáptese a una jeringa conectada a un conector de silicona flexible.</li>
		<li>Transfiera 60 l de sangre o aCSF (para SAH o condición falsa, respectivamente) en un tubo de 0,5 ml utilizando una micropipeta de precisión.</li>
		<li>Succionar en la pipeta de vidrio los 60 l de sangre para la condición SAH o 60 l de aCSF para la condición falsa.</li>
		<li>Por inyección, instale la pipeta en el marco estereotáctico utilizando un anillo o una tachuela azul y lentamente lleve la punta de la pipeta a la membrana en la interfaz con la cisterna magna.</li>
		<li>Inserte lentamente la punta de la pipeta a través de la membrana atlanto-occipital en la cisterna magna, utilizando un micro-manipulador del marco estereotáctico.</li>
		<li>Conecte la pipeta previamente llena de sangre o aCSF a la jeringa lista para la inducción de presión.</li>
		<li>Inyectar presionando el émbolo a una velocidad baja de alrededor de 10 l/min, para evitar la presión intracraneal aguda.</li>
		<li>Durante la inyección, controle de cerca la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.</li>
		<li>Al final de la inyección, retire cuidadosamente la pipeta a través del micromantenador y asegúrese visualmente de que no haya fugas durante la extracción.</li>
		<li>Alcanza la hemostasia usando una hemostat absorbible y ejecuta dos suturas con hilo suturante trenzado no absorbible.</li>
		<li>Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decubito y cúbralo con una manta de supervivencia en una caja abierta durante la recuperación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segundo día de inducción (D0)<ol>
<li>Después de 24 horas, induzca la anestesia (ver pasos 1.3.2 y 1.3.3). Inyectar de nuevo 100 ml de buprenorfina por vía subcutánea (0,1 mg/kg) y prevenir la sequedad de los ojos mediante el uso de gel líquido protector (ver pasos 2.7 y 2.8).</li>
		<li>Instale el animal en el marco estereotáctico como el día anterior.</li>
		<li>Retire cuidadosamente las suturas con microscisores.</li>
		<li>Preparar la membrana atlanto-occipital como antes y aplicar la preparación antiséptica en la zona afeitada del cuello con una varilla de algodón estéril.</li>
		<li>Inyectar 30 l de sangre o aCSF a una velocidad baja (ver pasos 3.1.2 a 3.1.8). Controlar la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.</li>
		<li>Al final de la inyección, quite cuidadosamente la pipeta y controle la ausencia de fuga de sangre durante la retirada.</li>
		<li>Lograr hemostasis y ejecutar dos suturas con hilo de sutura absorbible trenzado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Seguimiento postoperatorio y final del experimento
<ol><li>Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decúbito con una manta de supervivencia en su espalda en una caja abierta durante la recuperación.</li>
	<li>Pesar y observar cuidadosamente diariamente el comportamiento de cada ratón hasta el sacrificio (por ejemplo, D7 post-cirugía).</li>
	<li>Entre los puntos finales humanos, una pérdida de peso significativa (>15% del peso) se nota clásicamente. Una postura "encorvada hacia atrás", movimientos lentos, postración, vocalizaciones anormales de dolor y/o comportamiento agresivo significativo también son signos importantes de sufrimiento animal. Si aparece alguno de estos signos o una combinación de signos, el control del animal se refuerza a las pocas horas de su aparición. Si el bienestar del animal empeora o no mejora en 48 horas, se considerará que se alcanza un nivel de sufrimiento intolerable, y se lleva a cabo la eutanasia.</li>
	<li>En el momento de la elección, sacrificar ratones anestesiados por decapitación, y cosechar cerebros para análisis posteriores.</li>
	<li>Realizar eutanasia (decapitación) después de la anestesia isoflurano (5%).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A pesar de la intensidad de la investigación en el campo de la SAH y el desarrollo de estrategias terapéuticas como opciones de tratamiento endovascular y farmacológico que aumentan en los últimos veinte años, la mortalidad sigue siendo alta en la primera semana de ingreso hospitalario y alcanza alrededor del 50% durante los siguientes 6 meses24,,25.. Este modelo preclínico actual mediante doble inyección diaria de sangre arterial homóloga en la...

La hemorragia subaracnoidea (SAH) representa hasta el 5% de todos los casos de accidente cerebrovascular y constituye una patología relativamente común con una incidencia de 7,2 a 9 pacientes por cada 100.000 por año, con una tasa de mortalidad del 20%-60% dependiendo del estudio1,,2,,3. En la fase aguda, la mortalidad es atribuible a la gravedad del sangrado, sangrado, vasoespasmo cerebral (CVS) y/o complicaciones médicas4. En los sobrevivientes, la lesión cerebral temprana (EBI) se asocia con la extensión parénquima de la hemorragia y el aumento abrupto de la presión intracraneal, que puede resultar en isquemia cerebral primaria5 y la muerte inmediata en aproximadamente 10%-15% de los casos6. Después de la etapa inicial "aguda" de la SAH, el pronóstico depende de la aparición de isquemia cerebral "secundaria" o retardada (DCI), detectada en casi el 40% de los pacientes por tomografía computarizada cerebral, y en hasta el 80% de los pacientes después de la resonancia magnética (RM)7,,8. Además del CVS que ocurre entre 4 y 21 días después de la ruptura del aneurisma en la mayoría de los pacientes con SAH, DCI9 puede ser el resultado de lesiones cerebrales difusas multifactoriales secundarias a la formación de microtrombosis, reducción de la perfusión cerebral, neuroinflamación y depresión de propagación cortical (CSD)10,11,12,13. Esto afecta al 30% de los sobrevivientes de SAH e impacta las funciones cognitivas incluyendo memoria visual, memoria verbal, tiempo de reacción, y funciones ejecutivas, visuospatiales y del lenguaje14 deteriorando la vida diaria15. Las terapias estándar actuales para prevenir el CVS y/o los malos resultados cognitivos en pacientes con SAH se basan en el bloqueo de la señalización y vasoconstricción de Ca2+ mediante el uso de inhibidores del canal Ca2+ como nimodipina. Sin embargo, ensayos clínicos más recientes dirigidos a vasoconstricción revelaron disociación entre el resultado neurológico del paciente y la prevención del CVS16,lo que sugiere mecanismos fisiopatológicos más complejos implicados en las consecuencias a largo plazo de la SAH. Por lo tanto, existe una necesidad médica de una mayor comprensión del número de eventos patológicos que acompañan a la SAH y el desarrollo de modelos animales válidos y estandarizados para probar las intervenciones terapéuticas originales.
La ruptura de un aneurisma intracraneal mayormente responsable de la SAH en humanos es probablemente difícil de imitar en modelos animales preclínicos. Actualmente, la ruptura del aneurisma y la situación de la SAH se pueden probar tentativamente mediante la perforación de la arteria cerebral media (modelo de punción endovascular) responsable de CVS y disfunciones sensitivomotoras en ratones17,,18. Debido a la falta de un posible control sobre la aparición del sangrado y la difusión de la sangre en este modelo, se han desarrollado otros métodos en roedores para generar modelos SAH sin ruptura endovascular. Más precisamente, consisten en la administración directa de sangre arterial en el espacio subaracnoideo a través de una inyección única o doble en las cisternas magna19 o una sola inyección en la cisterna prequismática20. La principal ventaja de estos modelos de ratón sin ruptura endovascular es la posibilidad de dominar reproduciblemente el procedimiento quirúrgico y la calidad y cantidad de la muestra de sangre inyectada. Otra ventaja de este modelo sobre el modelo mediante perforación endovascular en particular es la preservación del bienestar general del animal. De hecho, esta cirugía es menos invasiva y técnicamente menos difícil que la necesaria para generar una ruptura de la pared carótida. En este último modelo, el animal tiene que ser intubado y ventilado mecánicamente, mientras que un monofilamento se inserta en la arteria carótida externa, y avanza en la arteria carótida interna. Esto probablemente conduce a isquemia transitoria debido a la obstrucción del vaso por la trayectoria del alambre. En consecuencia, la comorbilidad (estado moribundo, dolor importante y muerte) asociada con la cirugía es menos importante en el modelo de doble inyección en comparación con el modelo de perforación endovascular. Además de ser un SAH más consistente, el método de inyección directa doble cumple con el bienestar animal en la investigación y las pruebas (tiempo reducido bajo anestesia, dolor por alteración del tejido en la cirugía y angustia) y conduce a un número total mínimo de animales utilizados para el estudio del protocolo y la formación del personal.
Además, esto permite la implementación del mismo protocolo a ratones transgénicos, lo que conduce a una comprensión patológica optimizada de la SAH y la posibilidad de pruebas comparativas de posibles compuestos terapéuticos. Aquí, presentamos un modelo de ratón estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) por una doble inyección diaria consecutiva de sangre arterial autóloga en la cisterna magna en ratones C57Bl/6J machos de 6-8 semanas de edad. La principal ventaja de este modelo es el control del volumen de sangrado en comparación con el modelo de perforación endovascular, y el refuerzo del evento de sangrado sin un aumento drástico de la presión intracraneal21. Recientemente, la doble inyección directa de sangre en la cisterna magna ha sido bien descrita en los problemas experimentales y fisiopatológicos en ratones. De hecho, recientemente demostramos CVS de grandes arterias cerebrales (basilar (BA), medias (MCA) y arterias cerebrales anteriores (ACA), deposición cerebrovascular de fibrina y apoptosis celular desde el día 3 (D3) hasta 10 (D10), defectos de circulación del líquido cefalorraquídeo paravascular acompañados de alteraciones de las funciones sensitivomotoras y cognitivas en ratones, 10 días después de SAH en este modelo22. Por lo tanto, hace que este modelo dominado, validado y caracterizado para eventos a corto y duradero plazo después de SAH. Debe ser ideal para la identificación prospectiva de nuevas dianas y para estudios sobre estrategias terapéuticas potentes y eficientes contra complicaciones asociadas a la SAH.

<table><tbody><tr><td>hemostático reabsorbible</td><td>Ethicon</td><td>Surgicel</td><td></td></tr><tr><td>hilo de sutura absorbible</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 5.0</td><td></td></tr><tr><td>manta eléctrica autorregulable</td><td>Harvard Apparatus</td><td>50-7087-F</td><td></td></tr><tr><td>bluetack para fijación capilar</td><td>UHU</td><td>Balanza electrónica Patafix</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Denver Instrument</td><td>MXX-2001</td><td></td></tr><tr><td>capilares</td><td>de vidrio Harvard Apparatus</td><td>GC150F-15</td> diámetro <td>interior 0,86 mm diámetro exterior 1,5 mm</td></tr><tr><td>vaporizador de isoflurano</td><td>Phymep</td><td>V100</td><td></td></tr><tr><td>extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>aguja 26 G</td><td>BD microbalance</td><td>300300</td><td></td></tr><tr><td>hilo de sutura no absorbible</td><td>Peters quirúrgico</td><td>Filapeau 4.0</td><td></td></tr><tr><td>marco estereotáxico</td><td>David Kopf instruments</td><td>Modelo 902</td><td></td></tr><tr><td>equipo quirúrgico</td><td>Kent pinza científica</td><td>, microtijeras, jeringa de</td><td></td>tijera fina</tr><tr><td>20 mL TERUMO</td><td>Thermofisher</td><td>11866071</td><td></td></tr></tbody></table>

doble inyección directa de sangre en la cisterna magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Entre los accidentes cerebrovasculares, la hemorragia subaracnoidea (HS) consecutiva a la ruptura de un aneurisma arterial cerebral representa 5-9%, pero es responsable de alrededor del 30% de la mortalidad total relacionada con el accidente cerebrovascular con una morbilidad importante en términos de desenlace neurológico. Un vasoespasmo cerebral retrasado (CVS) puede ocurrir con mayor frecuencia en asociación con una isquemia cerebral retrasada. Se están utilizando diferentes modelos animales de SAH, incluyendo perforación endovascular e inyección directa de sangre en la cisterna magna o incluso en la cisterna prequismática, cada una de las que presenta ventajas y desventajas distintas. En este artículo, se presenta un modelo de ratón estandarizado de SAH mediante la inyección directa doble de volúmenes determinados de sangre entera autóloga en la cisterna magna. Brevemente, los ratones fueron pesados y luego anestesiados por inhalación de isoflurano. A continuación, el animal se colocó en una posición reclinable sobre una manta calentada manteniendo una temperatura rectal de 37 oC y se colocó en un marco estereotáctico con una curva cervical de unos 30o. Una vez en su lugar, la punta de una micropipeta de vidrio alargada llena con la sangre arterial homóloga extraída de la arteria carótida de otro ratón de la misma edad y sexo (C57Bl/6J) se posicionó en un ángulo recto en contacto con la membrana atlanto-occipital por medio de un micromaniprulador. Luego se inyectaron 60 l de sangre en la cisterna magna seguida de una inclinación descendente de 30o del animal durante 2 minutos. La segunda perfusión de sangre de 30oL en la cisterna magna se realizó 24 h después de la primera. El seguimiento individual de cada animal se lleva a cabo diariamente (evaluación cuidadosa del peso y el bienestar). Este procedimiento permite una distribución predecible y altamente reproducible de la sangre, probablemente acompañada de una elevación de la presión intracraneal que puede ser imitada por una inyección equivalente de un líquido cefalorraquídeo artificial (CSF), y representa un modelo agudo a leve de SAH que induce la baja mortalidad.

Cronología experimental, procedimiento, seguimiento y mortalidad La Figura 1A y la Figura 1B resumen el protocolo modelo SAH mediante inyección de sangre de doble intracisterna. Brevemente, el primer día de inducción de SAH (D-1), se inyectaron 60 l de sangre retirada de un ratón homólogo o 60 l de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) en la cisterna magna en SAH o en condiciones falsas, respectivamente. Al día siguiente (D0), se inyectar...

Describimos en este protocolo un modelo estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) mediante una doble inyección de sangre entera autóloga en la cisterna magna. El alto grado de estandarización del procedimiento de doble inyección representa un modelo de media a aguda de SAH con relativa seguridad con respecto a la mortalidad.

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

El objetivo general de este presente video es explicar el protocolo de una doble inyección directa de sangre en la cisterna magna como un modelo de hemorragia subaracnoidea. La fisiología de la hemorragia subaracnoidea a menudo se debe a una ruptura de un aneurisma. Y primero hacemos la extravasación de sangre en el compartimiento entre el cerebro y el tejido que cubre el cerebro.Este compartimiento es el espacio subaracnoideo. La hemorragia subaracnoidea representa hasta el 7% de todos los casos de huelga. La mortalidad varía entre el 30 y el 50% en los estudios basados en la población y los sobrevivientes de hemorragias subaracnoideas suelen experimentar secuelas cognitivas como déficits de memoria, astenia o trastornos del estado de ánimo.La principal causa en la alta prevalencia de un mal resultado es la isquemia cerebral. Los estudios hicieron un vínculo entre la aparición de isquemia en la vasoconstricción de las grandes arterias cerebrales, llamada vasoespasmo microscópico que se puede detectar en la mayoría de los pacientes entre el cuarto y el decimoquinto día después del primer evento de distensión abdominal. Debido a la ineficiencia de las opciones terapéuticas actuales, hay una necesidad médica obvia para una mejor comprensión de los eventos patológicos.Se debe probar la hemorragia subaracnoidea que acompaña y las nuevas dianas terapéuticas, pero esto requiere modelos animales variados y estandarizados. Es probable que sea difícil la ruptura del aneurisma intercraneal mayormente responsable de la hemorragia subaracnoidea en humanos. En animales, las principales dificultades residen en la incidencia de control de hemorragia y distribución sanguínea, pero estudios recientes se centran en el desarrollo de modelos más redicive de modelos de hemorragia subaracnoidea.Aquí representan un modelo de ratón estandarizado de dos inyecciones consecutivas de sangre arterial autóloga de nuestros dos días en la cisterna magna. Las principales ventajas de este modelo son dominar de forma reproducible un procedimiento quirúrgico no invasivo, adaptar la calidad y cantidad de la sangre inyectada, y reforzar el evento hemorrágico sin aumentar drásticamente la presión intracraneal. Antes del comienzo de la cirugía, usted tiene que poner otro gran número de capilares de vidrio mediante el uso de un tirador de micropipeta.La pipeta de inyección debe presentar un diámetro interior de 0,86 milímetros y un diámetro exterior de 0,5 milímetros. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial para una afección falsa, como se indica en el protocolo escrito. Debe darse cuenta de este líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado con un aparato de filtro de 0,22 micras.El primer paso de nuestro modelo de hemorragia subaracnoidea consiste en el aislamiento de la arteria carótida a lo largo de la tráquea y la recolección del máximo de sangre de la punción de la arteria carótida. Después de la anestesia por isoflurano, compruebe la falta de reflejos sujetando una o dos extremidades posteriores para permitir el ajuste del procedimiento experimental. Codifque una jeringa de un milímetro con Eprin utilizando una aguja de calibre 26.Esto evitará la coagulación de la sangre durante los siguientes pasos. Pese cada ratón con precisión utilizando una balanza electrónica. En el estudio actual, ratones tendrían peso corporal dentro del rango de 20 Para 25 gramos justo antes de la cirugía.Como se explicó anteriormente, la anestesia inducida del ratón operado y luego afeitar el cuello y el espacio entre cada oreja por medio de un cortador eléctrico adecuado. Compruebe que el ratón está durmiendo y la cabeza del ratón está bien bloqueada. Inyectar por vía subcutánea 100 microlitros de buprenorfina a 0,1 miligramos por kilo con una aguja de calibre 26 en la parte inferior de la espalda para evitar el dolor después del despertar.Evite la sequedad de los ojos con un gel líquido protector y mantenga una temperatura intraductal de 37 grados con una manta eléctrica regulada automáticamente. Antes de tratar el área afeitada con una solución antiséptica, todos los instrumentos que tocan el tejido han sido esterilizados y se manejaron asépticamente. El primer día, corte una incisión de un centímetro de largo en el cuello posterior, seguido de la separación de los músculos a lo largo de la línea media, para acceder a la cisterna magna.Corte la punta de la pipeta de vidrio vacía con tijeras delgadas. A continuación, adáptese a una jeringa conectada a un conector de silicio flexible. Luego transfiera 60 microlitros de sangre o líquido cefalorraquídeo artificial en un tubo de 0,5 mililitros utilizando una micropipeta de precisión Succionar la pipeta de vidrio, los 60 microlitros de sangre para la condición de hemorragia subaracnoidea o 60 microlitros de líquido cefalorraquídeo artificial para la afección falsa.Para inyección, inserte la pipeta en el marco estereotáctico utilizando, por ejemplo, nuestro anillo o a y acercarse lentamente a la punta de la pipeta a la membrana en la interfaz con la cisterna magna. Inserte lentamente la punta de la pipeta a través de la membrana atlanto-occipital en la cisterna magna utilizando un micromanipulador del marco estereotáctico. Conecte la pipeta a la jeringa previamente llena, lista para la inducción de presión.Inyectar por presión a una velocidad baja alrededor de 10 microlitros por minuto para evitar la hipertensión intracraneal aguda. Durante la inyección, controle estrechamente la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal. Al final de la inyección, retire cuidadosamente la pipeta con el micromanipulador y tenga cuidado visualmente de que no haya fugas durante la extracción.Alcanza la homeostasis y realiza dos suturas con hilo suturado trenzado no absorbible. Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decúbito y cubra con una manta de supervivencia en una caja abierta durante la recuperación. Después de 24 horas, induzca la anestesia de nuevo, instale el ratón en el marco estereotáctico como el día anterior y retire con cuidado las suturas con micro-tijeras.Preparar como antes aséptico de la membrana atlanto-occipital, aplicando sobre la zona afeitada y solución aséptica con una varilla de algodón. Inyectar, como el día anterior, 30 microlitros de sangre o líquido cefalorraquídeo artificial a una velocidad baja. Como ya se ha mencionado, controlar la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.Al final de la inyección, quite cuidadosamente la pipeta y controle la ausencia de fuga de sangre durante la retirada. Alcanza la homeostasis y realiza dos suturas con un hilo de sutura absorbible trenzado. Desde el primer día después de la cirugía hasta el día del sacrificio, el peso corporal debe evaluarse diariamente como un indicador sensible para el bienestar general.Mostró una reducción significativa del aumento de peso corporal en hemorragia subaracnoidea, en comparación con animales falsos, lo que sugiere un proceso de recuperación de actividad de larga duración y eventos patológicos prolongados, hemorragia post subaracnoidea. ¿Por qué la mortalidad no está en condiciones falsas? La mortalidad es cercana al 30% en el séptimo día en la condición de hemorragia subaracnoidea, con la mayoría de los animales muriendo en el uno o el cuarto día después de la cirugía.Entre los puntos finales humanos, se observa una pérdida de peso significativa superior al 15% del peso inicial. Una postura encorvada, movimientos lentos, heridas, vocalizaciones anormales o agresiones significativas son también signos de que el animal está sufriendo. Si aparece alguno de estos signos o una combinación de signos, el seguimiento del animal se refuerza en cuestión de horas que siguen su apariencia.Si la condición del animal empeora en la hora que sigue o no mejora en 48 horas, se considerará que se alcanza un nivel de sufrimiento intolerable y se lleva a cabo la matanza. En este ejemplo en el primer día de la cirugía, se puede observar desde un cerebro de muestra, coágulos de sangre a lo largo de las grandes arterias del polígono Willis en sujeto de hemorragia subaracnoidea. En el día cinco después de la cirugía y antes del sacrificio, la inyección de tinta india intervascular permite la detección de vasoespasmo macroscópico correspondiente a la vasoconstricción de grandes arterias cerebelosas, Coloración de rodajas cerebrales con hematoxilina y eosina permite la medición de vasoespasmo cerebral.Aquí, como se ilustra en esta micrografía fotográfica, se puede observar como un vasoespasmo de la arteria basilar. En este modelo de desvío de la inyección directa de sangre a la cisterna magna, hemos demostrado recientemente vasoespasmo cerebral de grandes arterias cerebrales, deposición fibrina vascular cerebral, y apoptosis celular, acompañada de alteraciones de las funciones sensoriales, motoras y cognitivas en ratones. Por lo tanto, hace que este modelo valide y se caracterice para eventos a corto y largo plazo, hemorragia post subaracnoidea.Debe ser ideal para la identificación prospectiva de nuevas dianas y para estudios sobre estrategias terapéuticas eficientes contra las complicaciones asociadas a la hemorragia subaracnoidea.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El modelo de inyección de sangre autóloga de la hemorragia intracerebral en ratones descritos en este protocolo se utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre hasta el trayecto de la aguja, no los anticoagulantes en el sistema de bombeo, y elimina todo el espacio muerto y el tubo extensible en el sistema.

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

Hemorragia subaracnoidea aneurismática (HSA) es la hemorragia que se produce en el espacio subaracnoideo cuando un aneurisma se rompe. Mientras que la morbilidad y la mortalidad por este evento ha estado en un declive debido a la mejora de los métodos de tratamiento, el riesgo de vasoespasmo después de la hemorragia subaracnoidea continúa siendo el mismo que era hace unos años. La importancia de establecer un modelo animal completo y reproducible para identificar sucesos iniciadores de...

Una baja mortalidad modelo de rata para evaluar vasoespasmo cerebral retardado tras la hemorragia subaracnoidea experimental

Modelos animales clínicamente relevante de hemorragia intracerebral (HIC) son necesarios para profundizar en el conocimiento de accidente cerebrovascular hemorrágico y examinar nuevas estrategias terapéuticas. En este estudio, se describe y evaluar dos modelos que implementan ICH inyecciones unilaterales de sangre autóloga o bien total o colagenasa bacteriana en los ganglios basales (corpus striatum) de ratones.

Modelado Hemorragia intracerebral en ratones: La inyección de sangre autóloga o colagenasa bacteriana

Este video muestra el procedimiento para establecer un modelo de rata con hemorragia subaracnoidea. A una rata anestesiada se le implantan sondas para medir la presión intracraneal y el flujo sanguíneo cerebral. Se identifica el sitio objetivo y se inserta la aguja en una posición prequiasmática. A continuación, se inyecta sangre autóloga en el espacio subaracnoideo, aumentando la presión intracraneal y disminuyendo el flujo sanguíneo cerebral, estableciendo el modelo.

Establecimiento de un modelo de rata con hemorragia subaracnoidea inducida por inyección de sangre autóloga

Fuente: Tang, X. et. al., Hemorragia Pontina Masiva por Inyección Dual de Sangre Autóloga. J. Vis. Exp. (2021)Este protocolo describe la infusión controlada de sangre autóloga en la región pontina del cerebro de una rata para modelar una hemorragia pontina masiva. El propósito es simular una hemorragia cerebral localizada mediante el aumento de la presión localizada.

Inducción de una hemorragia pontina masiva en un modelo de rata mediante inyección de sangre autóloga

Un modelo de ratón estándar de la hemorragia subaracnoidea por el Círculo de Willis intraluminal perforación se describe. Perforación de vasos y hemorragia subaracnoidea son monitoreados por el monitoreo de la presión intracraneal. Además diversos parámetros vitales se registran y se controlan para mantener las condiciones fisiológicas.

Un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

El modelo experimental de hemorragia subaracnoidea (HSA) con derivación de sangre intracraneal controlada por presión en el conejo combina los procedimientos estándar: canulación de la arteria subclavia y punción transcutánea de cisterna magna, lo que permite imitar de cerca las condiciones fisiopatológicas humanas después de la HSA. Presentamos instrucciones paso a paso y discutimos los puntos quirúrgicos clave para la creación exitosa de SAH experimental.

El Conejo Modelo Blood-shunt para el Estudio de la aguda y secuelas tardías de Hemorragia subaracnoidea: Aspectos Técnicos

Presentamos un protocolo para establecer un modelo masivo de la hemorragia del pontine en una rata vía la inyección dual de la sangre autóloga.

Hemorragia pontina masiva por inyección dual de sangre autóloga

La hemorragia subaracnoidea sigue conllevando una alta carga de mortalidad y morbilidad en el hombre. Para facilitar la investigación adicional sobre la condición y su fisiopatología, se presenta un modelo pre-quiasmático de inyección única.

Inyección única prequiasmática de sangre autóloga para inducir hemorragia subaracnoidea experimental en un modelo de rata

Aquí presentamos un modelo estandarizado de ratón SAH, inducido por perforación de filamento endovascular, combinado con imágenes de resonancia magnética (MRI) 24 h después de la operación para asegurar el sitio de sangrado correcto y excluir otras patologías intracraneales relevantes.

Modelo de perforación endovascular para hemorragia subaracnoidea combinada con resonancia magnética (IRM)

Aprende el modelo de hemorragia subaracnoidea mediante doble inyección directa de sangre en la cisterna magna en ratones. Este protocolo estandarizado permite controlar la distribución hemorrágica con baja mortalidad para investigar nuevas dianas terapéuticas.

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

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