Cuantificación De La Ingesta De Macronutrientes En Una Pantalla Neuronal Termogenética Usando Larvas De Drosophila

Nuestro protocolo permite la identificación de las poblaciones neuronales de las larvas que codifican las opciones nutricionales relacionadas con el control de los niveles de ingesta de dos macronutrientes principales, las proteínas y los hidratos de carbono. La simplicidad y el rendimiento relativamente alto de nuestro método permiten la cuantificación de la ingesta de alimentos para varios genotipos expuestos a diferentes condiciones nutricionales. Para cruzar genéticamente las líneas parentales, se instalan jaulas de recolección de embriones de 60 milímetros con placas de dieta de cría L3 suplementadas con pasta de levadura activa.

Transfiera las hembras adultas TripA1 vírgenes y los machos Janelia GAL4 de cinco a ocho días a las jaulas de recolección de embriones y permita que el apareamiento ocurra durante 24 a 48 horas a 25 grados centígrados con 60% de humedad y un ciclo de 12, 12 luces y oscuridad. Después del período de apareamiento, transfiera las moscas adultas apareadas a placas de dieta de cría L3 frescas y permita que la puesta de huevos ocurra durante tres o cuatro horas a 25 grados centígrados. Asegúrese de que todos los platos estén etiquetados con el genotipo y la fecha de la puesta de huevos.

Cuando termine el período de puesta de huevos, retire las placas de las jaulas y calcule el número de huevos por placa contando el número de embriones en un cuarto de la placa. Mantenga la densidad larvaria a un máximo de 200 embriones por placa y cubra las placas con tapas de plástico. Incubar las placas de cría L3 a 18 grados centígrados, 60% de humedad, y un ciclo de 12, 12 luces y oscuridad durante nueve días.

Después de la incubación, recoja tres grupos de 10 L3 de cada uno de los genotipos a analizar, así como un grupo de 10 L3 para el control de alimento con colorante cero. Utilice las pinzas número cinco o de peso pluma realizando la recolección de las larvas con la mayor suavidad posible. Transfiera las larvas recolectadas a recipientes de plástico con peso para platos que contengan un mililitro de agua.

Configure una incubadora a 30 grados centígrados y mantenga altos los niveles de humedad agregando una bandeja llena de agua para evitar la deshidratación de las larvas durante el ensayo. Equilibre la temperatura de las placas de ensayo calentándolas a 30 grados centígrados antes de comenzar. Asegúrese de que todos los platos estén etiquetados con el genotipo y la proporción de proteínas a carbohidratos de la dieta.

Realice un choque térmico de las larvas experimentales durante dos minutos transfiriendo directamente los botes de plástico que contienen los animales a un baño de agua a 37 grados centígrados. Configure el número requerido de temporizadores durante una hora, luego drene con cuidado el agua de los botes de plástico y transfiera los grupos L3 de los botes al centro de las placas de activos. Cubra las placas y ponga en marcha el temporizador.

Deje que las larvas se alimenten durante una hora a 30 grados centígrados en la oscuridad. Detenga el ensayo de alimentación transfiriendo las placas a un baño de hielo. Prepare dos microtubos de mililitros para cada grupo L3 probado que contengan suficientes perlas de vidrio de 0,5 milímetros para llenar la parte inferior del microtubo y 300 microlitros de metanol helado.

Use un enfriador de banco para mantener fríos los microtubos. Recupere con cuidado los grupos L3 de las placas de ensayo de alimentación y transfiéralos a las tapas de las placas con un poco de agua. Enjuague las larvas para eliminar los restos de comida de sus cuerpos, teniendo cuidado de evitar lesiones.

Transfiera las larvas a los microtubos preparados y líselas con un lisador de tejidos para extraer el colorante alimentario de las tripas. Transfiera los extractos a microtubos limpios de 1,5 mililitros invirtiendo directamente los dos microtubos de mililitros en los nuevos tubos. Hazlo suavemente para que la mayoría de las cuentas de vidrio permanezcan en el fondo del tubo de dos mililitros.

Limpie los restos celulares centrifugando los extractos a una velocidad máxima y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, luego transfiera los sobrenadantes a tubos limpios de 1,5 mililitros. Para realizar la cuantificación calorimétrica del consumo de alimentos, prepare soluciones estándar de tinte azul diluyéndolo en serie uno o dos en metanol. Transfiera 100 microlitros de las muestras experimentales, los patrones y el blanco a los pocillos de una microplaca de 96 pocillos y mida la absorbancia a 600 nanómetros.

Este protocolo se utilizó para cuantificar las cantidades relativas de macronutrientes consumidos por los animales bajo activación termogenética de poblaciones neuronales específicas en el sistema nervioso de las larvas. La activación de distintas poblaciones de neuronas afectó significativamente el equilibrio de macronutrientes en las larvas de tercer estadio. El patrón de alimentación observado para la línea de control, aquí indicado en color gris, muestra una disminución esperada de la ingesta de alimentos en dietas de mayor proporción proteína-carbohidratos, lo que demuestra la efectividad del método.

Las cinco clases fenotípicas que se establecieron para los animales de experimentación fueron comer mucho y compensar la dilución de proteínas comiendo en exceso, comer mucho, pero no compensar, comer poco, pero compensar, comer poco y no compensar, y comer aberrantemente. Para cada una de estas clases fenotípicas y genotipos, se muestran los patrones de GFP en el sistema nervioso central de las larvas de tercer estadio. Al intentar este protocolo, es importante generar larvas de tercer estadio temprano sincronizadas con el desarrollo para minimizar la variación asociada al comportamiento animal.

Siguiendo este protocolo, el etiquetado radiofónico de los alimentos permitiría la confirmación y posterior disección de los resultados encontrados utilizando estos métodos.