Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos

Este protocolo para la encapsulación de ovocitos porcinos permite mantener la organización esférica de los COC. Esto evita su aplanamiento y la consiguiente interrupción de las uniones de separación entre el ócito y las células foliculares circundantes. Las principales ventajas de los dos protocolos descritos son que son fáciles de usar y permiten un control efectivo tanto de la supervivencia de los ovocitos como de las células quimio.

Ambos sistemas de cultivo son herramientas valiosas para la investigación básica en biología reproductiva, y pueden tener relevancia clínica para mejorar el tratamiento de la infertilidad. También se pueden aplicar para el desarrollo de nuevos métodos biotecnológicos y para la mejora del ganado. Después de enjuagar los ovarios, transferirlos a un vaso de precipitados lleno de medio HM y almacenarlos en una incubadora a 38 grados Centígrados durante todas las manipulaciones posteriores.

Aspirar el líquido folicular de grandes folículos porcinos y centrifugarlo a 100 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, filtre el sobrenadante con una jeringa estéril unida a un filtro de poro de membrana de 0,2 micrómetros y congele a presión a 80 grados centígrados negativos. Para aislar los COC de los folículos de tamaño mediano, transfiera de dos a tres ovarios a un plato estéril de Petri de 10 centímetros lleno de HM. Corte suavemente la superficie de los folículos ováricos salientes con una hoja quirúrgica estéril número 15, lo que hará que el líquido folicular y los COC fluyan hacia la placa Petri.

Aspirar el contenido folicular con una aguja de calibre 28 unida a una jeringa desechable, y transferirlo a otro plato de Petri. Para preparar los platos de IVF Petri, agregue un mililitro de HM a los pozos centrales, y coloque de tres a cuatro gotas de HM en los anillos exteriores. A continuación, utilice una micropipeta de policarbonato para mover los COC no dañados a las gotas de HM en los anillos exteriores, y enjuáguelos brevemente de tres a cuatro veces.

Cuando haya terminado, transfiera individualmente al pozo central. Almacene las placas de FIV en la incubadora. Preparar soluciones de trombina y fibrinógeno como se describe en el manuscrito de texto.

El día del procedimiento, descongele lentamente la solución de fibrinógeno sobre hielo y lléela a temperatura ambiente justo antes de su uso. Mezclar 0.5%solución de alginato y la solución de fibrinógeno en una proporción de uno a uno para un volumen final de dos mililitros y vórtice suavemente la mezcla. Reparar cámaras de incubación mediante la aplicación de tiras delgadas de película de parafina a los portaobjetos de vidrio.

Pipetear 7,5 microlitros de la mezcla FA en el portaobjetos recubiertos con película de parafina con separadores de separación, colocando de ocho a 10 gotas dispuestas en dos filas. Utilice una micropipeta para transferir de tres a cinco COC al centro de la caída de FA, junto con un volumen mínimo de medio de maduración. Agregue 7,5 microlitros de solución de trombina encima de cada gota de FA para cubrirla.

No hay necesidad de mezclarlos porque el gel se forma casi instantáneamente. Cubra la cámara de incubación con un portaobjetos de vidrio previamente preparado, luego gire la cámara boca abajo y colóquela en un plato Petri de 100 milímetros forrado con papel de filtro húmedo. Ponga el plato Petri en la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 38 grados centígrados durante cinco a siete minutos.

Después de la incubación, transfiera cada cápsula de FA a un pozo de una placa de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de medio de maduración. Cada dos días, reemplace la mitad del medio por un medio de maduración preequilibrado fresco. Image COC está utilizando un microscopio de luz invertido con un aumento de 10x.

Después de cultivar los COC durante cuatro días, retire el medio de maduración de los pozos y agregue 100 microlitros de 10 unidades internacionales por lifranato de allicanato de mililitro en DMEM. Deje la placa de cultivo en la incubadora durante 25 a 30 minutos. Retire los COC de las cápsulas disueltas.

Lávelos en DMEM varias veces, luego transfiéralos al anillo interior de un plato de FIV que contenga PBS. Haz una cama de cinco gramos de polvo FEP en un plato de Petri de 30 milímetros. Distribuya una sola gota de medio de maduración que contenga de tres a cinco COC en el polvo FEP.

Gire la placa suavemente en un movimiento circular para asegurar que las partículas cubran completamente la superficie de la gota líquida y formen mármoles líquidos, o LMs. Prepare varios platos de Petri de FIV de 60 milímetros, y agregue de tres a cuatro mililitros de agua estéril a los anillos exteriores para crear una cámara de humedad. Recoja el LM formado con una pipeta de 1000 microlitrotros y colóquelo en el pozo central.

Incubar las canicas durante cuatro días a 38 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento. Para cambiar el medio, aplique 30 microlitros de medio de maduración sobre cada LM, lo que hará que se propague. Cuando el contenido de mármol se disuelva, transfiera los COC liberados del biorres reactor a una gota de medio de maduración fresco en la placa Petri.

Después de tres a cuatro lavados en medio de maduración, transfiera los COC, junto con 30 microlitros de medio fresco, al lecho de polvo FEP. Gire suavemente la placa en un movimiento circular para asegurarse de que las partículas de polvo cubran completamente la superficie de la gota de líquido y forme un nuevo LM.Then, transfiera el LM a la placa IVF Petri. Ambos sistemas de maduración in vitro produjeron COCs con células de granulosis que se adhirieron estrechamente entre sí y capas intactas de células cúmulos.

El análisis de viabilidad del COC confirmó que se lograron condiciones óptimas de crecimiento en ambos sistemas de encapsulación. En ambos grupos, sólo se observaron sitios de ovocitos de alta viabilidad. Los ovocitos fueron imageados con microscopía electrónica de transmisión.

Las mitocondrias se distribuyeron uniformemente y tenían una forma de concha. Sólo unos pocos de ellos fueron alargados y su agrupación fue observada esporádicamente. El retículo endoplasmático se asoció con mitocondrias o libre en el citoplasma de ovocitos.

Las gotas líquidas aparecieron como estructuras pequeñas, oscuras y redondas, y el aparato Golgi emergió con cisternas dilatadas. Es importante ser preciso y cuidadoso al transferir cápsulas de FA de la cámara de incubación a placas de cultivo y al recoger y transferir el formato LM a la placa IVF Petri.