Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

Nuestro protocolo automatizado cPILOT facilita a los investigadores el análisis de muestras de una manera de alto rendimiento. Esto es significativo porque nos permite llegar a la información biológica sobre enfermedades o diferentes condiciones mucho más rápido. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a procesar varias muestras en paralelo, reduciendo así los errores procesables mientras se utilizan muestras de alto rendimiento.

Nuestro laboratorio está interesado en aplicaciones relacionadas con el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, esta técnica también se puede utilizar para estudiar cualquier enfermedad o desafío para donde hay tejidos biológicos involucrados. Comience por encender el aparato de presión positiva, el dispositivo de calefacción y refrigeración y las bombas de vacío.

Conecte todos los accesorios con el manipulador de líquidos, que mostrará una luz azul una vez que esté conectado al ordenador y listo para funcionar. Aliquot 300 microlitros del hígado homogeneizan en un tubo de 500 microlitros y colóquelo en una placa de pozo de dos mililitros de profundidad. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados hasta el inicio del protocolo.

Abra el método en el software y coloque los consejos y el material de laboratorio necesarios en sus posiciones. A continuación, coteje con el diseño final del mazo y haga clic en Siguiente para continuar con el protocolo. Cargue 230 puntas de microlitro y aspire 90 microlitros de ocho urea molares del depósito.

A continuación, prescinda para remar una de las placas negras de dos mililitros de profundidad. Descargue las puntas del TL1 y repita este paso hasta que se haya añadido urea a todos los pozos. Después de añadir el tampón de desnaturalización, utilice 90 puntas de microlitros para transferir 10 microlitros de homogeneización hepática de ratón a la placa de pozo profundo.

Descargue las puntas, luego cargue una fila de 90 puntas de microlitros y aspire tres microlitros de TDT de la placa de reactivo uno. Dispensar la TDT a las filas uno y dos de la placa de pozo profundo. Selle la placa de muestra con papel de aluminio e i incuba a 37 grados Centígrados durante 600 segundos mientras gira a 300 RPM.

Después de la incubación, cargue una fila de 90 puntas de microlitros, aspire seis microlitros de IAM de la placa de reactivo uno en la fila tres y dispensúe para remar una de la placa de muestra. Selle la placa de muestra e iine a cuatro grados centígrados durante 30 minutos mientras gira a 300 RPM en el dispositivo de refrigeración. A continuación, despreomine la placa de muestra y cargue una fila de 90 puntas de microlitrotro.

Aspirar cinco microlitros de cistina de la placa de reactivo uno en la fila dos y dispensarlo a las filas uno y dos de la placa de muestra. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, realice un batido cronometrete de 1800 RPM durante 30 minutos.

A continuación, añada 800 microlitros de 20 tampones Tris mililares con cloruro de calcio 10 mililitros a cada pozo en la placa de muestra para diluir la concentración de urea a dos molares. Agregue 20 microlitros de trippsina a la primera fila de una placa de 96 pozos y coloque la placa en un lugar específico en la cubierta. Después de añadir la tripina a la placa de muestra, sellarla e incubar durante 15 horas a 37 grados Celsius y 600 RPM en el dispositivo de calefacción y refrigeración.

Detenga la digestión aspirando 150 microlitros de 5% de ácido fórmico de la fila tres de la placa de ácido fórmico y distribuyéndola a la placa de muestra en las filas uno y dos. Proceda a desalar los péptidos. Utilice 1070 puntas de microlitros para aspirar 600 microlitros de acetonitrilo.

A continuación, prescinda en las filas uno y dos de la extracción de fase sólida, o placa SPE, para activar C-18. A continuación, cargue la muestra digerida en la placa SPE en dos pasadas. Cargue dos filas de puntas, aspire 534 microlitros de las muestras digeridas y dispensúelas en las filas una y dos de la placa SPE.

Aplique presión a la placa y repita este paso hasta que se carguen todas las muestras. Limpiar los péptidos lavando con agua y diluir los péptidos con 60 a 40 acetonitrilo en 0,1%ácido fórmico. A continuación, coloque la placa encima de una placa de recogida para eluir los péptidos utilizando el aparato de presión positiva.

Dibuje el flujo a través y configure las puntas y el material de laboratorio requeridos en el software, coteje con el diseño de la cubierta, y haga clic en Siguiente para continuar el protocolo para la dimetilación. Reconstituir los péptidos en 1%ácido acético. Para realizar el etiquetado de dimetilación, cargue 90 puntas de microlitro y aspire 16 microlitros de 60 formaldehídos de luz milimolar de la segunda fila de la placa de reactivo dos.

Dispérselo para remar una de la placa de muestra y, a continuación, descargar las puntas. Cargue una fila de 90 puntas de microlitro y aspire 16 microlitros de formaldehído pesado de 60 mililitros de la fila tres de la placa de reactivo dos. Dispárelo en la fila dos de la placa de muestra y descargue las puntas.

Cargue dos hileras de 90 puntas de microlitro y aspire 16 microlitros de 24 cianoboroticidas de sodio milimolar y 24 cianoborodo uterino de sodio mililitro de las filas uno y dos de la placa de reactivo tres, luego dispense los reactivos a las filas uno y dos de la muestra de la placa para iniciar la reacción de dimetilación. Descargue las puntas y utilice el agitador orbital para realizar un batido cronometreado durante 15 minutos a 1800 RPM. A continuación, cargue dos filas de 90 puntas de microlitros y aspire 32 microlitros de 1% de amoníaco de las filas tres y cuatro de la placa de reactivo tres.

Dispérselo en las filas uno y dos de la placa de muestra dos para detener la reacción. Combine volúmenes iguales de péptidos dimetilados ligeros y pesados en una nueva placa de pozo profundo de dos mililitros para desalar. Después de desalar los péptidos ligeros y pesados combinados, seque los péptidos y realice el etiquetado isobárico.

Reconstituir los péptidos con 100 microlitros de 100 mililares trietilomonio bicarbonato en un agitador orbital. A continuación, utilice 90 puntas de microlitros para aspirar 25 microlitros de los péptidos dimetilados combinados y dispensarlos a la primera fila de la placa de procesamiento TMT. Cargue una fila de 90 puntas de microlitros y aspire 10 microlitros de TMT.

Dispérse en la primera fila de la placa de procesamiento TMT, descargue las puntas y, a continuación, realice un batido cronometreado durante una hora a 1800 RPM. Aspirar ocho microlitros de hidroxiilamina de la fila dos de la placa TEAB y dispensarlo para remar una de las placas de procesamiento TMT. Después de un batido de 15 minutos a 1800 RPM, transfiera 30,5 microlitros de los péptidos etiquetados TMT a un tubo de 1,5 mililitros.

A continuación, proceda con la adquisición y análisis de datos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Aquí se muestran datos representativos de la INFORMACIÓN de un péptido identificado en los 22 canales iónicos de reporteros de un experimento de etiquetado isotópico de precursor combinado de 22 Plex y un experimento de etiquetado isobárico. La secuencia del péptido corresponde a betaína-homocisteína S-metiltransferasa.

Los iones de fragmento más intensos para los picos dimetilados ligeros y pesados se aislaron aún más para la fragmentación de MS3. Las intensidades de iones del reportero son directamente proporcionales a la abundancia de péptidos en la muestra. En general, este experimento combinado de etiquetado isotópico y etiquetado isobárico redujo los tiempos de procesamiento de la muestra y hizo posible visualizar la expresión de proteínas a través de múltiples canales o condiciones.

La gráfica de caja de abundancia de registro 10 frente a intensidades totales de iones de reportero en todos los 22 canales muestra menor variabilidad entre pozos o entre muestras. La evaluación de la automatización total se realizó examinando el error en la abundancia de iones de reportero en cada proteína en las 22 muestras. El procesamiento de muestras con la plataforma robótica dio como resultado coeficientes de variación muy bajos.

A lo largo de los péptidos 3098, el coeficiente medio de variación en la abundancia de iones de reportero fue de 12,36 y 15,03% para péptidos dimetilados ligeros y pesados, respectivamente. Al intentar este protocolo, es importante tener en cuenta que los niveles isotópicos e isobáricos se utilizan en un solo experimento. Por lo tanto, se debe realizar una planificación cuidadosa para designar cada muestra con las etiquetas destinadas a usarse en el experimento.

Este método se puede integrar fácilmente en otros sistemas robóticos, y se puede aplicar a una variedad de tejidos, como tesatos de tejidos o células y otros biofluidos.