Name: Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a aislar poblaciones de células gliales de diferentes regiones del sistema nervioso central murino. Este protocolo permite estudiar la heterogeneidad regional de microglía, oligodendrocitos y astrocitos.

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Agradecemos a Morgan Psenicka por la edición y discusión del manuscrito y al Dr. Grahame Kidd por su ayuda en el formato de la figura. Este trabajo fue apoyado por NIAID K22 AI125466 (JLW).

NOTA: Todos los estudios en animales fueron autorizados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland.
1. Preparar los medios y suministros para la disección
NOTA: Todas las recetas de búfer y medios se proporcionan en la Tabla 1. Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un cultivo de tejidos designado gabinete de bioseguridad.
<ol><li>Preparar y filtrar estérilmente los medios gliales mixtos (MGM). Esto se puede hacer el día anterior y se almacena a 4 °C.</li>
	<li>Diluir la fibronectina a una concentración de 1:100 conH2Oestéril. El volumen de fibronectina diluida dependerá del número de cachorros y la región del SNC utilizada para el experimento. Utilice un matraz T25 para 1 corteza, un matraz T25 para 2-4 cerebella, un matraz T25 para 2-4 troncos cerebrales y un matraz T25 para 2-4 médula espinal. NOTA: La combinación de tejido de la misma región utilizando los criterios enumerados anteriormente permitirá una disociación adecuada sin alterar el protocolo descrito a continuación. La combinación de más tejido del descrito en el Paso 1.2 requerirá una mayor optimización de las concentraciones de reactivos de disociación.</li>
	<li>Pipetear 3 ml de fibronectina diluida en matraces T25 a temperatura ambiente y dejar reposar durante 2 min.</li>
	<li>Aspirar la fibronectina y dejar que los matraces se sequen durante la noche con la tapa del matraz aflojada.</li>
</ol>2. Disección de corteza, cerebelo, tronco encefálico y médula espinal
NOTA: Este procedimiento se puede realizar en la mesa de trabajo y requiere un alcance de disección. Use una técnica aséptica estricta para todos los pasos del procedimiento y minimice la exposición del tejido al aire ambiente. Mantenga todos los medios fríos en hielo durante la disección para garantizar la máxima preservación del tejido. Alternativamente, este procedimiento podría realizarse en una campana que permita el uso de un alcance de disección interna.
<ol><li>Limpie todas las áreas con etanol al 70%.</li>
	<li>Pipetear 10 ml de PBS/solución antibiótica (PAS) en una placa de Petri de 10 cm. Prepara una placa de Petri para cada cachorro a diseccionar. Coloque en hielo para mantener la solución fría.</li>
	<li>En una campana de cultivo de tejidos desinfectada, pipetear 9 ml de DMEM (sin aditivos) en 4 tubos cónicos separados de 15 ml, uno para cada región del SNC, reemplazar las tapas de los tubos y poner en hielo. Coloque el cubo de hielo con tubos a una distancia de alcance del alcance de la disección.</li>
	<li>Colocar una placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2 en la etapa de endoscopio de disección desinfectada.</li>
	<li>Anestesiar y sacrificar a la cría de ratón de acuerdo con el protocolo institucional y retirar la cabeza por decapitación rápida con tijeras afiladas. NOTA: Día postnatal (P) Se utilizan 3-5 cachorros. Los cachorros mayores tienen un SNC más desarrollado y pueden no ser una fuente adecuada de células gliales en expansión. Los cachorros más jóvenes (P) 0-2 pueden producir un mayor número de glía y pueden ser utilizados; Sin embargo, el tejido de la médula espinal es muy difícil de diseccionar a esta temprana edad debido al tamaño.</li>
	<li>Limpia la piel del cachorro con etanol al 70%.</li>
	<li>Usando tijeras finas, cortar la capa cutánea a lo largo de la línea media de la cabeza del animal, comenzando caudalmente y moviendo rostral, hasta llegar al hocico. Evite cortar profundamente en el cráneo para evitar cualquier daño tisular.</li>
	<li>Inclinando la cabeza hacia abajo, tire de la capa cutánea a cada lado del cráneo y usando tijeras de resorte, haga una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando en el foramen magnum, nuevamente cortando caudal a rostral.</li>
	<li>Con pinzas de punta fina, tire de las mitades del cráneo hacia los lados derecho e izquierdo, exponiendo la corteza, el cerebelo y el tronco encefálico.</li>
	<li>Una vez expuesto, levante suavemente el cerebro fuera del cráneo y dentro de la placa de Petri de 10 cm preparada en el Paso 2.2. Asegúrese de que el cerebro permanezca intacto para preservar la estructura anatómica, con el cerebro posterior unido.</li>
	<li>Usando pinzas finas de punta curva con la punta de los fórceps hacia arriba, pellizque el cerebelo. Retire las meninges y colóquelas en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.</li>
	<li>Asegúrese de que el tronco encefálico sea directamente ventral al cerebelo y sea visible después de la extracción del cerebelo. Retírelo con pinzas de punta fina, retire las meninges y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.</li>
	<li>Separe el mesencéfalo de la corteza, retire las meninges corticales y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.</li>
	<li>Para extirpar la médula espinal, coloque el cachorro de ratón decapitado en posición supina (acostado boca arriba) con la columna vertebral cortada elevada hacia el investigador.</li>
	<li>Rocíe nuevamente con etanol al 70%.</li>
	<li>Cortar a lo largo de los lados laterales de la columna vertebral, en dirección rostral a caudal, a través de la caja torácica hasta llegar a las extremidades posteriores. Mientras corta, empuje hacia atrás los órganos internos hasta que la columna vertebral sea visible.</li>
	<li>Cortar a lo largo de cada lado lateral de la columna vertebral hasta aislarla y colocar en la placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2.</li>
	<li>Con el lado ventral hacia arriba, utilizando tijeras finas de resorte, alterna el corte de los lados derecho e izquierdo de cada vértebra hasta llegar a la región lumbar para exponer el tejido de la médula espinal.</li>
	<li>Retire suavemente la médula espinal y las meninges con pinzas de punta fina bajo el microscopio de disección. Coloque en un tubo cónico designado de 15 ml en cubitera.</li>
	<li>Repita los pasos 2.5.-2.19 para cada cachorro, combinando tejido de la misma región para ajustarse a los criterios descritos en el paso 1.2 para cada matraz T25 preparado. NOTA: Retire las meninges lo más completamente posible. Si queda una cantidad significativa de meninges, el fenotipo similar a los fibroblastos de las células meníngeas crecerá y abrumará el cultivo celular. Múltiples médulas espinales, de igual fenotipo, se pueden combinar para generar un cultivo celular específico. Tenga cuidado de asegurarse de que no se produzca un hacinamiento de las células, lo que puede conducir a la apoptosis glial y fenotipos diferenciales.</li>
</ol>3. Disociación tisular
NOTA: Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un cultivo de tejido estéril designado gabinete de bioseguridad utilizando técnica aséptica y materiales estériles.
<ol><li>Agregue 1 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA a cada tubo cónico de 15 ml de 9 ml de DMEM y tejido para comenzar la lisis tisular. NOTA: DMEM contiene una alta cantidad de cloruro de calcio, que puede actuar como un inhibidor de la tripsina. Si la disociación no se completa siguiendo los pasos descritos, se puede usar la solución salina equilibrada de Hanks sin calcio ni magnesio. Después de la tripsinización, la enzima puede neutralizarse agregando un inhibidor de tripsina, aunque el calcio debe agregarse nuevamente a la solución, ya que es un cofactor para la DNasa I, que se usa en los pasos posteriores.</li>
	<li>Triturar con una pipeta de 10 ml aproximadamente 20x.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos vacíos de 50 ml.</li>
	<li>Incubar la solución a 37 °C, 5% deCO2 durante 15 min, agitando suavemente los lisados después de 8 min.</li>
	<li>Agregue 5 ml de MGM y 200 μL (5 mg/ml) de DNasa I a cada tubo para obtener una concentración final de 50 μg/ml.</li>
	<li>Triturar cada lisado con una pipeta de 10 ml 10x.</li>
	<li>Deje que las suspensiones celulares reposen durante 3 minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en la parte inferior de los tubos.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 ml, dejando atrás el tejido no disociado. NOTA: Los pasos de lisis y trituración descritos anteriormente limitan significativamente la cantidad de tejido no disociado.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sin freno.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares restantes en 5 ml de MGM.</li>
	<li>Triturar el pellet con una pipeta de 5 ml 20x.</li>
	<li>Colocar en placa las suspensiones de 5 ml de células en matraces T25 recubiertos.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 y cambiar de medio inicialmente después de 24 h para eliminar los restos celulares. NOTA: Algunos protocolos recomiendan un cambio inicial de medios después de 72 h. Es posible que sea necesario optimizar este paso.</li>
	<li>Realizar un cambio de media del 100% con MGM cada 48-72 h hasta que las células sean 80% confluentes (aproximadamente 5-7 días). NOTA: Todos los soportes deben calentarse a 37 °C antes de que cambien los medios.</li>
</ol>4. Aislamiento de microglía
<ol><li>Una vez que los cultivos gliales mezclados hayan alcanzado el 80% de confluencia, prepare los matraces para agitar apretando las tapas y sellando con una película de parafina.</li>
	<li>Para eliminar la microglía de cultivos gliales mixtos, fijar los matraces horizontalmente en un agitador orbital dentro de una incubadora a 37 °C. Agitar matraces a 15 x g durante 1 h.</li>
	<li>Retire el medio y la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Enjuague los matraces dos veces con 3 ml de MGM caliente, agregando lavado a los tubos cónicos de 15 ml. Estas son las microglías.</li>
	<li>Agregue 5 ml de MGM caliente y fresco a los matraces de cultivo.</li>
	<li>Volver a sellar los matraces con película de parafina, fijar los matraces horizontalmente en el agitador y agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separar los OPC de los astrocitos. NOTA: Este paso se puede hacer durante la noche, pero el tiempo de agitación de 15 h es crítico ya que el exceso de tiempo puede provocar la muerte celular.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a partir del paso 4.3. a 300 x g durante 3 min y cultivo de microglía según protocolos estándar16 o uso para un ensayo biológico.</li>
</ol>5. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos
NOTA: Al chapar OPC después del aislamiento inicial, deben estar chapados en una superficie recubierta de poli-D-lisina (placa estéril o cubreba). Prepare estos materiales antes de completar esta sección.
<ol><li>Después de agitar 15 h, retirar el sobrenadante de los matraces y colocar en placa una placa de Petri estéril de 100 mm.</li>
	<li>Incubar el sobrenadante a 37 °C, 5% deCO2 durante 30 min, agitando después de 15 min para eliminar la microglía restante, ya que estos se adherirán muy rápidamente al plato. Se pueden usar placas de Petri no tratadas con cultivo de tejidos para este paso.</li>
	<li>Retire el sobrenadante celular no adherente, el recuento y la placa en una superficie recubierta de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPC están chapados/cm2.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante al menos 1 h (hasta 6 h), luego aspirar suavemente el 95% de los medios y agregar lentamente medios OPC calientes, pipeteando los medios contra la pared del pozo para minimizar la interrupción de los OPC. Cambie los medios cada 48 h hasta que las celdas estén listas para su uso. NOTA: Es fundamental que solo se cambie un pozo a la vez. Los OPC son sensibles y son especialmente intolerantes a las condiciones secas. La adición de PDGF-AA en medios OPC es para retrasar la maduración de OPC en oligodendrocitos. Este factor puede excluirse de los medios de cultivo si el foco experimental son los oligodendrocitos maduros.</li>
</ol>6. Aislamiento de astrocitos
<ol><li>Después de 15 h de agitación, retire el sobrenadante y enjuague los matraces 2x con 1x PBS tibio.</li>
	<li>Añadir 4 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA e incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante 5 min o hasta que las células se hayan levantado. Para asegurarse de que los astrocitos se hayan levantado, visualícelos usando un microscopio estándar de campo amplio. Los astrocitos aparecerán esféricos después de la tripsinización.</li>
	<li>Una vez que los astrocitos se hayan desprendido, coloque el matraz verticalmente y agregue 4 ml de MGM. Triturar para mezclar.</li>
	<li>Pipetear los astrocitos en un tubo cónico de 15 ml, centrifugar a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspender los astrocitos en medios de astrocitos y placa en la superficie recubierta de fibronectina como se describe en el paso 1.2. o uso para ensayo biológico. NOTA: Se pueden agregar 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos murinos durante el primer cambio de medios para ayudar a establecer el cultivo de astrocitos. Además, el recubrimiento de gelatina estándar puede ser una alternativa de bajo costo a la fibronectina.</li>
</ol>7. Identificación y aislamiento de microglía, OPC, astrocitos y oligodendrocitos maduros mediante inmunocitoquímica
<ol><li>Una vez que las células en placa hayan alcanzado la confluencia adecuada, retire suavemente los medios y fije las células adherentes con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos. Haga este paso en un gabinete de bioseguridad. NOTA: Al aspirar o añadir soluciones, pipetear con una presión suave para evitar el desprendimiento de células.</li>
	<li>Aspire lentamente PFA y luego lave las células 3x con 1x PBS durante 5 min.</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo adecuada utilizando suero al 10% y Triton X-100 al 0,1% en 1x PBS. NOTA: La fuente de suero refleja el animal huésped en el que se crió el anticuerpo secundario. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo de cabra, el suero de bloqueo apropiado es suero de cabra normal. Del mismo modo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo burro, el suero de bloqueo debe ser suero de burro normal.</li>
	<li>Agregue solución de bloqueo hasta que las células estén completamente cubiertas. Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar una solución diluyente de anticuerpos (9 ml de 1x PBS, 0,01 g de albúmina sérica bovina, 30 μL Triton X-100). Alternativamente, los anticuerpos pueden diluirse en la solución bloqueante descrita en el paso 6.3.</li>
	<li>Diluir anticuerpos primarios específicos para lo siguiente en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante:<ol><li>Microglia: molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1) en una dilución 1:250 (2,4 μg/ml).</li>
		<li>OPC: antígeno neuronal/glial 2 (NG2) en una dilución 1:200 (5 μg/mL).</li>
		<li>Oligodendrocitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) en una dilución 1:400 (la concentración depende del lote y puede ser necesaria la optimización).</li>
		<li>Astrocitos: proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una dilución 1:400 (0,25 μg/mL)17. NOTA: No mezcle anticuerpos primarios criados en la misma especie. NOTA: GFAP etiquetará de manera confiable los astrocitos de la sustancia blanca. Para los astrocitos de materia gris, puede ser necesario usar un marcador alternativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (es preferible agitar suavemente).</li>
	<li>Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo primario.</li>
	<li>Incubar células con anticuerpos secundarios apropiados en una dilución 1:400 en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante protegida de la luz. NOTA: Los anticuerpos secundarios se conjugan con un fluoróforo que puede intercambiarse dependiendo de los parámetros del microscopio disponibles. Una vez que se hayan aplicado anticuerpos secundarios fluorescentes, protéjalos de la luz tanto como sea posible.</li>
	<li>Incubar el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente, limitando la exposición a la luz.</li>
	<li>Lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Para etiquetar los núcleos, use una solución 1:1,000 DAPI/PBS e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Para montar, aplique los medios de montaje y deje secar en la oscuridad antes de la obtención de imágenes. NOTA: Los portaobjetos montados se pueden almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 días. Para un almacenamiento prolongado, mueva las diapositivas a 4 °C. Imagen dentro de una semana para una señal máxima. Todas las imágenes representativas han sido fotografiadas en un microscopio confocal; sin embargo, también se recomiendan microscopios fluorescentes invertidos.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores tienen conflictos de intereses que revelar.

En este protocolo, describimos el aislamiento de las tres principales subpoblaciones de células gliales del SNC del ratón: microglía, OPC y astrocitos. Un revés importante para la investigación de enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias del SNC es la falta de células y tejidos humanos primarios, particularmente aquellos que son regionales y del mismo paciente. En la mayoría de los casos, las líneas celulares del SNC humano se derivan de células cancerosas transformadas e inmortalizadas que pueden no ser representaciones precisas de su comportamiento fisiológico normal20,21,22. Por lo tanto, se necesitan métodos alternativos para estudiar los fenotipos de células del SNC de manera controlada. Además, la diversidad de las poblaciones neurológicas de células gliales hace necesario investigar cada subtipo, tanto independientemente entre sí, como en condiciones de cocultivo para recapitular sus funciones celulares autónomas y no autónomas. Las células gliales tienen una amplia variedad de funciones críticas en el SNC que van desde el soporte neuronal23, el aprendizaje/cognición 24,25 y las respuestas inmunológicas del SNC26. Como tal, es necesario comprender las funciones moleculares y celulares de cada subpoblación glial en un contexto fisiológico y patológico. Para ello, proporcionamos aquí un método fiable para la extracción y aislamiento de subtipos de glía viables. Debido a las limitaciones prácticas y éticas en la investigación de sujetos humanos, los modelos animales son actualmente los sustitutos más relevantes para la biología de las células gliales humanas. En particular, los ratones son animales modelo ideales, ya que su genoma puede ser manipulado y analizado para diseccionar aún más los mecanismos moleculares particulares que subyacen a la salud y la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación y separación exitosa de la microglía murina, OPC y astrocitos es una herramienta clave para investigar las funciones de la glía durante afecciones fisiológicas, neurodegenerativas o neuroinflamatorias.
Este protocolo se puede optimizar para explorar la heterogeneidad regional de las células del SNC. Cada vez está más claro que la glía exhibe heterogeneidad regional en forma y función. Los astrocitos son regionalmente diversos y muestran una morfología distinta dependiendo de su ubicación dentro del SNC27. Además, la densidad de los astrocitos y su índice mitótico pueden definir regiones anatómicas, apoyando la hipótesis de que la heterogeneidad regional de los astrocitos puede reflejar diferencias moleculares y funcionales basadas en su ubicación dentro del SNC28. La heterogeneidad regional microglial también está bajo investigación activa, aunque los mecanismos subyacentes y las consecuencias funcionales de la diversidad de microglia en el desarrollo o comportamiento del SNC actualmente no están claros. Sin embargo, se sabe que la microglía adulta muestra diversidad en número celular, estructuras celulares y subcelulares, y firmas moleculares29. Además, los avances recientes en citometría de masas multiplexadas han definido aún más la heterogeneidad regional de la microglía, analizando el fenotipo celular de cinco regiones diferentes del SNC de nueve donantes humanos, lo que permite el inmunofenotipado a gran escala de la microglía humana30. Actualmente, tales enfoques se encuentran en sus etapas iniciales, lo que hace que los estudios en animales sean una solución viable para el estudio de la glía regional en el desarrollo de enfermedades del SNC. Finalmente, recientemente también se ha descrito heterogeneidad regional en oligodendrocitos. La secuenciación de ARN unicelular en 5072 células individuales de 10 regiones del SNC juvenil y adulto identificó 13 subpoblaciones distintas en diferentes etapas de diferenciación31. Es importante destacar que también se encontró que a medida que los oligodendrocitos maduraron a partir de OPC, sus perfiles transcripcionales divergieron y sus fenotipos funcionales cambiaron, destacando la heterogeneidad de oligodendrocitos dentro del SNC31.
Por lo tanto, comprender la heterogeneidad regional de las diversas células residentes del SNC en el contexto de sus diversas neuronas vecinas y otras glías puede proporcionar una justificación importante para el desarrollo futuro de nuevas terapias para tratar trastornos neuroinflamatorios y neurodegenerativos. Si bien este protocolo se centra en la extracción, aislamiento e identificación de subpoblaciones gliales, proporciona un punto de partida conveniente para el examen de su función. Además, se puede adaptar y combinar con modelos de ratón transgénico para estudiar los mecanismos genéticos asociados con la biología de las células gliales. También se puede utilizar para examinar las respuestas de las células gliales entre sí en ensayos de cocultivo. Los pasos descritos representan un método rentable y de alto rendimiento para extraer y aislar diferentes poblaciones gliales del SNC que luego se pueden adaptar a una amplia variedad de parámetros experimentales. Cabe señalar; Sin embargo, que el método descrito aquí utiliza neonatos debido a los niveles más bajos de mielinización y la alta densidad de la glía proliferante. Por estas razones, es técnicamente más factible aislar la glía viable de los recién nacidos en comparación con los animales adultos. Por lo tanto, las diferencias fenotípicas en la glía neonatal en comparación con la glía adulta deben considerarse durante el diseño experimental y la interpretación de los datos.

La glía es necesaria para la función neuronal adecuada en el SNC. Están compuestos por tres subpoblaciones principales, astrocitos, oligodendrocitos y microglía, cada uno con un papel diferente, pero indispensable1. Sin la diversidad y actividad adecuada de las células gliales, la función neuronal se vería gravemente afectada, lo que llevaría al deterioro del SNC. Las glías son capaces de influir en la neurotransmisión, y cada tipo de célula lo hace de una manera única. Las células gliales en el cerebro tienen la capacidad de comunicarse entre sí, así como con las células neuronales, con el fin de facilitar la función adecuada del SNC2. Los oligodendrocitos aumentan la velocidad de transmisión eléctrica a través de la formación de una vaina de mielina, lo que facilita la agrupación de canales iónicos en los nodos de Ranvier, los sitios de generación potencial de acción neuronal3. La microglía es crítica para la poda de las sinapsis mediante el monitoreo de la transmisión sináptica y el "recableado" de las conexiones neuronales después de la lesión4. Además, la microglía es la célula inmune residente más abundante del SNC, actuando como la forma primaria de defensa del huésped contra los patógenos5. Los astrocitos pueden regular la transmisión sináptica entre neuronas modificando la concentración de potasio extracelular6. También tienen un papel en el control del flujo sanguíneo local7, la liberación y absorción de elementos neuromoduladores8, y tienen un papel clave en el mantenimiento de la barrera hematoencefálica9. Por lo tanto, cada subtipo glial es crítico para la función del SNC, ya que los defectos en cualquier tipo se han asociado durante mucho tiempo con una amplia variedad de estados patológicos, incluyendo enfermedades psiquiátricas, epilepsia y condiciones neurodegenerativas10.
El mayor obstáculo en el estudio de la patobiología del SNC es la incapacidad de investigar las células humanas en el contexto de su nicho microambiental. El tejido de biopsia humana se recolecta más post mortem y las células pueden dañarse o perderse fácilmente durante la extracción y el procesamiento. Además, es un desafío mantener las células humanas vivas y viables in vitro durante cualquier período de tiempo sin derivar líneas celulares inmortalizadas de tumores, momento en el cual ya no reflejan con precisión sus propiedades fisiológicas normales11,12. Además, existe una cantidad significativa de heterogeneidad regional entre los tipos individuales de células gliales13,14,15, y la obtención de muestras regionales del SNC de pacientes individuales es casi imposible. Como tal, es necesario desarrollar modelos alternativos para estudiar la contribución de la glía regional en trastornos específicos del SNC.
Aquí, describimos un sistema in vitro que utiliza el aislamiento específico de la región del SNC del ratón de múltiples subpoblaciones gliales, lo que permite la manipulación y cuantificación de microglía, células precursoras de oligodendrocitos (OPC), que dan lugar a oligodendrocitos maduros, y astrocitos. Cada población puede ser aislada independientemente y sometida a una amplia variedad de técnicas experimentales que incluyen tratamiento farmacológico o molecular, inmunocitoquímica, extracción y análisis de proteínas / ARN y otros sistemas de cocultivo según la necesidad experimental. Además, esta técnica de aislamiento produce un alto número de células, lo que permite la caracterización e investigación de cada población glial de una manera de alto rendimiento. También permite el estudio de la diferenciación, el crecimiento y la proliferación de células del SNC en respuesta a una amplia variedad de estímulos microambientales de manera controlada para evitar factores de confusión que suelen estar presentes en un entorno in vivo. Por último, esta técnica de aislamiento celular facilita la manipulación de las poblaciones de células gliales dentro de diferentes regiones del SNC para investigar cómo la glía regional interactúa entre sí y responde a estímulos variables, lo que permite precisión y reproducibilidad.

<table><tbody><tr><td>0,05% de tripsina y 0,53 mM</td> de <td>EDTA Gibco</td><td>25300054</td><td>Disociación de tejidos</td></tr><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180 180</td><td>Placa de cultivo celular</td></tr><tr><td>1X PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Reactivo estándar</td></tr><tr><td>32% Paraformaldehído</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias 15714-S</td><td></td><td>Fijador</td></tr><tr><td>50 mL, 25 cm2 cultivo celular matraz</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>Matraz de cultivo celular (T25)</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento 50X</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A9647-50G</td><td>Diluyente de anticuerpos</td></tr><tr><td>Microscopio Confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td>Confocal para imagen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Tinción nuclear</td></tr><tr><td>DMEM (1X), glucosa alta con piruvato de</td><td>Na Gibco</td><td>11995040</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>Disociación de tejidos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>A3840001</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F1141-1MG</td><td>Adherente a la célula</td></tr><tr><td>Tijeras de puntada fina</td><td>Sklar</td><td>64-3260 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Anticuerpo de tinción secundaria</td></tr><tr><td>IgG antirata de cabra Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21434</td><td>Anticuerpo de tinción secundaria Solución salina</td></tr><tr><td>equilibrada de Hanks (sin Ca o Mg)</td><td>ThermoFisher</td><td>14170120</td><td>Disociación tisular</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>20530081</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico murino</td><td>ThermoFisher</td><td>PMG8044</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>IFN-y gamma murino;</td><td>Peprotech</td><td>315-05-20UG</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Murine PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>315-17</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Componente de solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Tijeras operativas</td><td>Surgi-OR</td><td>95-272 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina 12 mm #1 Cubreobjetos de vidrio alemán</td><td>Corning Biocoatt 354086</td><td></td><td>Adherente a la célula</td></tr><tr><td>Prolong Gold Reactivo antidecoloración</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9071S</td><td>Medios de montaje</td></tr><tr><td>Conejo anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Conejo anti-NG2 Condroitina Proteoglicano</td><td>Millipore</td><td>ab5320</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Rata anti-GFAP</td><td>ThermoFisher</td><td>13-0300</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Proteína básica antimielina para ratas</td><td>Abcam</td><td>ab7349</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Tijeras de punta afilada</td><td>Surgi-OR</td><td>95-104</td><td>Herramientas de disección</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>S4 E Microscopio estereoscópico</td><td>con zoom Microscopio para disección</td></tr><tr><td>Pinza de tejido</td><td>Sklar</td><td>66-7644 Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-100</td><td>Permabilización celular</td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina (de clara de huevo de gallina)</td><td>Sigma</td><td>10109878001</td><td>Disociación tisular</td></tr></tbody></table>

disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Los métodos presentados aquí demuestran procedimientos de laboratorio para la disección de cuatro regiones diferentes del sistema nervioso central (SNC) de neonatos murinos para el aislamiento de subpoblaciones gliales. El propósito del procedimiento es disociar la microglía, las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) y los astrocitos del tejido cortical, cerebeloso, del tronco encefálico y de la médula espinal para facilitar el análisis in vitro adicional. Los procedimientos de aislamiento de la región del SNC permiten determinar la heterogeneidad regional entre las glías en múltiples sistemas de cultivo celular. Se realiza un aislamiento rápido de la región del SNC, seguido de la extirpación mecánica de las meninges para evitar la contaminación de la glía por células meníngeas. Este protocolo combina una disociación suave del tejido y el recubrimiento en una matriz específica diseñada para preservar la integridad y la adherencia celular. El aislamiento de la glía mixta de múltiples regiones del SNC proporciona un análisis exhaustivo de la glía potencialmente heterogénea al tiempo que maximiza el uso de animales de experimentación individuales. Además, después de la disociación del tejido regional, la glía mixta se divide en múltiples tipos de células, incluidas la microglía, las OPC y los astrocitos para su uso en un solo tipo de célula, inserciones de placas de cultivo celular o sistemas de cocultivo. En general, las técnicas demostradas proporcionan un protocolo integral de amplia aplicabilidad para la disección cuidadosa de cuatro regiones individuales del SNC de neonatos murinos e incluye métodos para el aislamiento de tres tipos individuales de células gliales para examinar la heterogeneidad regional en cualquier número de sistemas de cultivo celular in vitro o ensayos.

Los datos representativos que se muestran a continuación ilustran que la señalización de IFNγ influye en la diferenciación y maduración de OPC. Sin la presencia del receptor de IFNγ (IFNγR), las OPC corticales no se diferencian en oligodendrocitos mielinizantes maduros tan fácilmente, lo que se evidencia por la ausencia de tinción MBP (Figura 1). Dado que los oligodendrocitos y los astrocitos se derivan de un progenitor común, analizamos la expresión de GFAP, que etiqueta los astrocitos. Encontramos que las células deficientes en IFNγR expresan fuertemente GFAP, lo que sugiere que pueden estar adoptando un fenotipo astrocítico, corroborando informes anteriores19.
La evidencia adicional de heterogeneidad regional en las células del SNC se evidencia por la morfología variable de los astrocitos como se ve en los astrocitos de la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 2). Cabe destacar que los astrocitos de la misma región también pueden exhibir heterogeneidad morfológica, lo que apoya la noción de que este subtipo glial es altamente dinámico. Las diferencias en la arquitectura celular sugieren diversidad funcional y, por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones gliales es necesaria para estudiar las respuestas fenotípicas en ausencia y presencia de estímulos microambientales.
Los oligodendrocitos son críticos para la mielinización de los axones neuronales y son necesarios para la reparación y función adecuada del SNC. Los OPC dan lugar a sus contrapartes maduras, por lo que es fundamental comprender la biología detrás de su capacidad para diferenciarse. La señalización de citoquinas influye significativamente en el comportamiento de las células madre e inmunes. Por lo tanto, es importante comprender cómo las respuestas regionales de las OPC pueden variar a la estimulación diferencial de citoquinas (Figura 3), lo que puede afectar su capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes maduros.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Figura 1: Datos representativos que muestran la diferenciación de OPC en ratones WT e IFNγR-/- en presencia de IFNγ exógeno. Las OPC corticales se aislaron de ( A ) WT y (B) IFNγR-/- P4 crías de ratón siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Las células se trataron con 1 ng/ml de IFNγ durante 48 h, luego se fijaron y se tiñeron para delinear la diferenciación celular. Los OPC se etiquetaron para NG2 y GFAP para identificar aquellos que estaban adoptando un fenotipo astrocítico. Del mismo modo, los OPC también se etiquetaron para NG2 y MBP para identificar aquellos que se diferenciaban en oligodendrocitos maduros. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Figura 2: Datos representativos que demuestran heterogeneidad regional en la morfología de los astrocitos. Los astrocitos de la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal se aislaron de crías de ratón P4 utilizando el protocolo descrito anteriormente y se etiquetaron para GFAP (verde) por inmunocitoquímica después de 48 h en cultivo. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Figura 3: Datos representativos que demuestran respuestas diferenciales de OPC regionales a citocinas. Las OPC se aislaron del tronco encefálico y la médula espinal de crías de ratón P4 utilizando el protocolo descrito anteriormente. Las células se trataron con concentraciones crecientes (1-10 ng / ml) de ( A ) IFNγ o (B) interleucina (IL) -17 para investigar la influencia diferencial de las citoquinas en la capacidad de las OPC regionales para diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Después de una incubación de 48 h con citoquinas especificadas, las OPC se fijaron y marcaron para NG2 (verde) y MBP (rojo). Barra de escala = 20 μM. Los datos representan medias ± SEM. **, p &lt; 0,01; , p &lt; 0,001; , p &lt; 0,0001 por ANOVA de 2 vías. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/Solución antibiótica (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">100X antibiótico/antimicótico que contiene 10.000 unidades/ml de penicilina y 10.000 mg/ml de estreptomicina</td>
		</tr><tr><td>25 mg/ml</td>
			<td colspan="2">Anfotericina B</td>
		</tr><tr><td>99 ml</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Medios Glia Mixtos (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 ml</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (glucosa alta, con L-glutamina, con piruvato de Na)</td>
		</tr><tr><td>10 ml</td>
			<td colspan="2">FBS inactivado por calor</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">L-Glutamina (100X)</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">Antibiótico/Antimicótico</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Medios OPC (50 ml)</td>
		</tr><tr><td>49 ml</td>
			<td colspan="2">Medios neurobasales</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">Suplemento B27 (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: PDGF-AA se agrega nuevo antes de cada cambio de medios.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Medios de astrocitos (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 ml</td>
			<td colspan="2">MEM con sales de Earle que contienen glutamina</td>
		</tr><tr><td>36 ml</td>
			<td colspan="2">Glucosa (use 100 mg/ml para la concentración final de 20 mM)</td>
		</tr><tr><td>100 ml</td>
			<td colspan="2">FBS inactivado por calor</td>
		</tr><tr><td>100 ml</td>
			<td colspan="2">Suero de caballo inactivado por calor</td>
		</tr><tr><td>10 ml</td>
			<td colspan="2">Glutamina (use 200 mM de caldo si no está incluido en el medio de stock)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPCIONAL: 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante de ratón</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: Filtrar estéril todos los medios y almacenar a 4°C hasta que se utilice.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Buffer y recetas de medios.

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Este protocolo es importante porque estamos aprendiendo que las glías son regionalmente heterogéneas, morfológica, funcional y genéticamente. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden estudiar tres subconjuntos de glía separados de cuatro regiones distintas del sistema nervioso central. Rachel Tinky, una estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostraremos este procedimiento.Usa unas tijeras finas para cortar la capa cutánea a lo largo de la línea media de la cabeza del cachorro, comenzando caudalmente y moviéndote rostral hasta llegar al hocico. Evite hacer cortes profundos en el cráneo para evitar cualquier daño en los tejidos. Inclinando la cabeza hacia abajo, tire de la capa cutánea a cada lado del cráneo y use unas tijeras de resorte para hacer una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando en el foramen magnum.Separe las mitades del cráneo con pinzas de punta fina que exponen la corteza, el cerebelo y el tronco encefálico. Una vez expuesto, levante suavemente el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS y solución antibiótica. Asegúrese de que el cerebro permanezca intacto con el cerebro posterior unido.Pellizque el cerebelo con pinzas de punta curva fina. Coloque en un tubo cónico designado de 15 mililitros sobre hielo. Separa el mesencéfalo de la corteza.Retire las meninges corticales y colóquelas en un tubo cónico designado. El tejido debe examinarse cuidadosamente para asegurar la extirpación completa de las meninges. Si las células meníngeas permanecen en el cultivo, pueden ser perjudiciales para el crecimiento de las células gliales.Para diseccionar la médula espinal, colóquela con el lado ventral hacia arriba y use unas tijeras de resorte finas para cortar las vértebras, alternando entre los lados izquierdo y derecho hasta que el tejido de la médula espinal quede expuesto. Retire suavemente la médula espinal y las meninges y colóquelas en el tubo cónico designado sobre hielo. Agregue un mililitro de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,53 milimolar a cada tubo con tejido.Tritura la mezcla con una pipeta de 10 mililitros aproximadamente 20 veces. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico vacío de 50 mililitros. Incubar la solución a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos.Agitar suavemente los lisados después de ocho minutos. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de MGM y 200 microlitros de DNasa I uno a cada tubo para una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Triturar cada lisado 10 veces con una pipeta de 10 mililitros.Luego, deje reposar la suspensión celular durante tres minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en el fondo del tubo. Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros dejando atrás el tejido no disociado. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet de la célula en cinco mililitros de MGM y triture 20 veces Coloque las suspensiones celulares en matraces T25 recubiertos e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Cambie el medio después de 24 horas para eliminar los restos de la célula. Para realizar el aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos, agite las células durante 15 horas, luego retire el sobrenadante del matraz y colóquelo en una placa de Petri estéril. Incubar el sobrenadante a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos.Agitar después de 15 minutos para eliminar la microglía restante. Retire el sobrenadante celular no adherente, cuente las células y colóquelas en una superficie recubierta de poli-D-lisina a la concentración deseada. Regrese las celdas a la incubadora durante al menos una hora.A continuación, aspire suavemente el 95% de los medios y añada lentamente los medios OPC calientes, pipeteándolos contra la pared del pocillo para minimizar la interrupción de los OPC. Este método se utilizó para demostrar que la señalización del interferón gamma influye en la diferenciación y maduración de OPC. Sin el receptor de interferón gamma, las OPC corticales no se diferencian fácilmente en oligodendrocitos mielinizantes maduros, lo que se evidencia por la ausencia de tinción de MBP.También se analizó la expresión de GFAP. Las células deficientes en interferón gamma expresan fuertemente GFAP, lo que sugiere que podrían estar adoptando un fenotipo astrocítico. La heterogeneidad regional en las células del SNC se evidencia por la variación de la morfología de los astrocitos en la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal.Los astrocitos de la misma región también pueden exhibir heterogeneidad morfológica, lo que apoya la idea de que este subtipo glial es altamente dinámico. También se exploraron las respuestas regionales de las OPC a la estimulación diferencial de citocinas. La señalización de citocinas influye significativamente en el comportamiento de las células madre e inmunitarias y puede afectar la forma en que las OPC se diferencian en oligodendrocitos mielinizantes maduros.Después del aislamiento de células gliales regionales, las células se pueden usar en una variedad de condiciones experimentales y ácidas utilizando varias técnicas que incluyen inmunohistoquímica, PCR cuantitativa en tiempo real y Western blot.

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Investigación

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Neurociencia

En este video, describimos un protocolo para aislar células CD11b, incluida la microglía, de cerebros de cachorros de ratón utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Los tejidos cerebrales se homogeneizan para obtener suspensiones unicelulares, que se incuban con microesferas recubiertas de anticuerpos anti-CD11b, seguidas de una separación basada en columna magnética para purificar la población de células CD11b+.

Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

El video muestra una técnica para aislar la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto. En primer lugar, la corteza se somete a segmentación y homogeneización para eliminar las neuronas y otras células gliales, preservando la microglía. Después de eso, la suspensión celular se expone a microesferas magnéticas antimielina y a un campo magnético, separando efectivamente la microglía y las células mieloides de los restos de mielina y las células que contienen mielina.

Aislamiento de la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto

Este video muestra un protocolo para extraer células microgliales de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones utilizando la clasificación magnética de células. El protocolo consiste en diseccionar el tejido cerebral lesionado que contiene células microgliales, tratar el tejido con enzimas específicas para obtener una suspensión unicelular y utilizar perlas magnéticas específicas del receptor microglial para aislar las células microgliales.

Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

El video demostró el método de aislar y cultivar células del cerebro de un ratón neonatal. Implicó la disociación enzimática y mecánica del cerebro, seguida de cultivo en medios de crecimiento carentes de factor de crecimiento neuronal para obtener una población glial mixta.

Obtención de un cultivo de células gliales mixtas a partir de un cerebro de ratón neonatal

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

El objetivo de este protocolo es aislar los microvasculares de múltiples regiones del sistema nervioso central de vertebrados lisencéfalos y gyrencéfalos.

Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Aprende a aislar poblaciones de células gliales de diferentes regiones del sistema nervioso central murino. Este protocolo permite estudiar la heterogeneidad regional de microglía, oligodendrocitos y astrocitos.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

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