Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central
4 de junio de 2020
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.
Este protocolo es importante porque estamos aprendiendo que las glías son regionalmente heterogéneas, morfológica, funcional y genéticamente. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden estudiar tres subconjuntos de glía separados de cuatro regiones distintas del sistema nervioso central. Rachel Tinky, una estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostraremos este procedimiento.
Usa unas tijeras finas para cortar la capa cutánea a lo largo de la línea media de la cabeza del cachorro, comenzando caudalmente y moviéndote rostral hasta llegar al hocico. Evite hacer cortes profundos en el cráneo para evitar cualquier daño en los tejidos. Inclinando la cabeza hacia abajo, tire de la capa cutánea a cada lado del cráneo y use unas tijeras de resorte para hacer una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando en el foramen magnum.
Separe las mitades del cráneo con pinzas de punta fina que exponen la corteza, el cerebelo y el tronco encefálico. Una vez expuesto, levante suavemente el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS y solución antibiótica. Asegúrese de que el cerebro permanezca intacto con el cerebro posterior unido.
Pellizque el cerebelo con pinzas de punta curva fina. Coloque en un tubo cónico designado de 15 mililitros sobre hielo. Separa el mesencéfalo de la corteza.
Retire las meninges corticales y colóquelas en un tubo cónico designado. El tejido debe examinarse cuidadosamente para asegurar la extirpación completa de las meninges. Si las células meníngeas permanecen en el cultivo, pueden ser perjudiciales para el crecimiento de las células gliales.
Para diseccionar la médula espinal, colóquela con el lado ventral hacia arriba y use unas tijeras de resorte finas para cortar las vértebras, alternando entre los lados izquierdo y derecho hasta que el tejido de la médula espinal quede expuesto. Retire suavemente la médula espinal y las meninges y colóquelas en el tubo cónico designado sobre hielo. Agregue un mililitro de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,53 milimolar a cada tubo con tejido.
Tritura la mezcla con una pipeta de 10 mililitros aproximadamente 20 veces. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico vacío de 50 mililitros. Incubar la solución a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos.
Agitar suavemente los lisados después de ocho minutos. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de MGM y 200 microlitros de DNasa I uno a cada tubo para una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Triturar cada lisado 10 veces con una pipeta de 10 mililitros.
Luego, deje reposar la suspensión celular durante tres minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en el fondo del tubo. Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros dejando atrás el tejido no disociado. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet de la célula en cinco mililitros de MGM y triture 20 veces Coloque las suspensiones celulares en matraces T25 recubiertos e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Cambie el medio después de 24 horas para eliminar los restos de la célula. Para realizar el aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos, agite las células durante 15 horas, luego retire el sobrenadante del matraz y colóquelo en una placa de Petri estéril. Incubar el sobrenadante a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos.
Agitar después de 15 minutos para eliminar la microglía restante. Retire el sobrenadante celular no adherente, cuente las células y colóquelas en una superficie recubierta de poli-D-lisina a la concentración deseada. Regrese las celdas a la incubadora durante al menos una hora.
A continuación, aspire suavemente el 95% de los medios y añada lentamente los medios OPC calientes, pipeteándolos contra la pared del pocillo para minimizar la interrupción de los OPC. Este método se utilizó para demostrar que la señalización del interferón gamma influye en la diferenciación y maduración de OPC. Sin el receptor de interferón gamma, las OPC corticales no se diferencian fácilmente en oligodendrocitos mielinizantes maduros, lo que se evidencia por la ausencia de tinción de MBP.
También se analizó la expresión de GFAP. Las células deficientes en interferón gamma expresan fuertemente GFAP, lo que sugiere que podrían estar adoptando un fenotipo astrocítico. La heterogeneidad regional en las células del SNC se evidencia por la variación de la morfología de los astrocitos en la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal.
Los astrocitos de la misma región también pueden exhibir heterogeneidad morfológica, lo que apoya la idea de que este subtipo glial es altamente dinámico. También se exploraron las respuestas regionales de las OPC a la estimulación diferencial de citocinas. La señalización de citocinas influye significativamente en el comportamiento de las células madre e inmunitarias y puede afectar la forma en que las OPC se diferencian en oligodendrocitos mielinizantes maduros.
Después del aislamiento de células gliales regionales, las células se pueden usar en una variedad de condiciones experimentales y ácidas utilizando varias técnicas que incluyen inmunohistoquímica, PCR cuantitativa en tiempo real y Western blot.
Resumen
Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales del sistema nervioso central (SNC) del ratón, incluyendo microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos. La metodología permite el estudio de los fenotipos distintos de cada tipo de célula glial en diversos sistemas de cultivo, destacando su heterogeneidad regional.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Biología de las Células Gliales
Antecedentes
- Las células gliales exhiben heterogeneidad regional en su morfología, función y genética.
- Comprender las poblaciones distintas de células gliales es fundamental para explorar sus funciones en el SNC.
- Este protocolo permite a los investigadores estudiar la interacción entre diferentes tipos de células gliales.
- El aislamiento de poblaciones distintas puede proporcionar información sobre sus contribuciones específicas al funcionamiento del SNC.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para aislar poblaciones específicas de células gliales de diferentes regiones del SNC.
- Investigar las características fenotípicas de las poblaciones gliales aisladas.
- Examinar las respuestas regionales de las células precursoras de oligodendrocitos a la estimulación con citocinas.
Métodos Utilizados
- Se empleó la metodología de cultivo celular in vitro para el aislamiento de células gliales.
- El modelo biológico incluye células gliales derivadas de fragmentos del SNC de ratón.
- No se mencionaron flujos de trabajo de multiómica.
- Los pasos clave incluyen técnicas de disección, tripsinización y suspensión celular.
- Se establecieron plazos para la incubación y la siembra celular para obtener resultados óptimos.
Resultados principales
- El protocolo aisló con éxito poblaciones celulares gliales distintas de diferentes regiones del SNC.
- El estudio señaló que la señalización de interferón gamma influye en la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos.
- Los astrocitos mostraron heterogeneidad morfológica según su región de origen en el SNC.
- Se destacaron las implicaciones potenciales para comprender cómo la señalización de citoquinas afecta el comportamiento de las células gliales.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método valioso para analizar el papel de las células gliales en la función del sistema nervioso central.
- Al permitir el aislamiento de subpoblaciones específicas de células gliales, los investigadores pueden comprender mejor sus contribuciones particulares.
- Este protocolo apoya futuras investigaciones sobre la dinámica de las células gliales y su respuesta a señales ambientales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La heterogeneidad regional de las células gliales afecta la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central. Este protocolo permite el aislamiento de microglía, células progenitoras de oligodendrocitos y astrocitos a partir de cuatro regiones del sistema nervioso central de ratón, para apoyar la selección fenotípica y el desarrollo de ensayos. Al proporcionar sistemas relevantes para la enfermedad con una composición celular definida, mejora la confiabilidad predictiva de los modelos preclínicos e informa las estrategias de identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de fenotipos de subpoblaciones gliales en regiones corticales, cerebelosas, del tronco encefálico y medulares para aclarar la biología del blanco y reducir el riesgo de hipótesis mecanicistas.
- Valor operativo: Proporciona el aislamiento reproducible de microglía, OPCs y astrocitos para estudios consistentes sobre la interacción con el blanco y la modulación de vías.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera cultivos de glía con definición regional para la selección de compuestos y la evaluación de los efectos mediados por citocinas sobre la diferenciación y maduración de OPC.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de glía mediante disociación mecánica y siembra en matriz definida para garantizar la disponibilidad del ensayo y su escalabilidad.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la evaluación de las respuestas regionales de las células gliales al interferón gamma y otras citocinas, aportando información para la alineación de biomarcadores y la relevancia fisiopatológica.
- Valor operativo: Permite sistemas de cultivo conjunto y de un solo tipo celular para modelar interacciones glía-neuronales y evaluar resultados mediados por dianas en flujos de trabajo preclínicos.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar poblaciones gliales validadas para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y la reducción de riesgos mecanicistas antes de la identificación del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre la heterogeneidad glial regional y las vías de señalización de citoquinas en la modulación de objetivos del SNC.
- Selección: Proporciona suspensiones gliales estandarizadas con una composición celular definida para ensayos de compuestos reproducibles y lecturas fenotípicas.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de la diferenciación glial, la expresión de marcadores (por ejemplo, MBP, GFAP) y las respuestas funcionales a la estimulación con citoquinas.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos gliales regionales con sistemas relevantes para enfermedades, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable de aislamiento glial aplicable a múltiples regiones del SNC y condiciones experimentales para un uso sostenido en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas gliales mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista y conocimientos funcionales específicos de la región.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de disociación, siembra y separación celular garantizan la reproducibilidad y escalabilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción al aclarar el compromiso de la diana glial y reducir el riesgo biológico en etapas avanzadas de los programas del SNC.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en datos de fenotipo glial regional y perfiles de respuesta a citoquinas.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en neuroanatomía y disección estéril de tejidos para aislar regiones del SNC y eliminar las meninges sin contaminación.
- Es necesario tener acceso a centrífugas, pipetas, incubadoras de CO2 y frascos de cultivo recubiertos para la disociación, siembra y expansión de células gliales.
- La estandarización de los protocolos de tripsinización, tratamiento con DNasa y trituración entre distintos equipos garantiza un rendimiento y viabilidad glial consistentes.
- La adaptación a sistemas modelo alternativos (por ejemplo, glía derivada de iPSC humanas) requiere la validación de marcadores regionales y de la eficiencia de disociación.
- Las limitaciones incluyen la necesidad de procesar rápidamente el tejido para mantener la integridad glial y evitar el sobrecrecimiento de células meníngeas en cultivo.
