Electroencefalograma de video continuo durante la hipoxia-isquemia en ratones neonatales

La encefalopatía hipóxico isquémica es la causa más común de convulsiones neonatales. Este modelo de ratón de convulsiones hipóxicas isquémicas y la videoelectroencefalografía o EEG continuos pueden ayudar a mejorar nuestra comprensión y caracterización de las convulsiones neonatales. Esta técnica facilita la adquisición de grabaciones de electroencefalografía de video de alta calidad en un modelo de lesión neonatal y puede ayudar en futuros estudios sobre los mecanismos de las convulsiones neonatales, los resultados y las pruebas terapéuticas.

El encargado de demostrar el procedimiento será Pravin Wagley. Un especialista de laboratorio de mi laboratorio. Para cirugía de implantación de electrodos.

Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del dolor en un ratón postnatal anestesiado en el noveno día, coloque al ratón en una etapa estereotáxica con un cono de nariz y use el reverso de la barra de la oreja para mantener la cabeza firme. Esterilice el área de la incisión en el cráneo con tres exfoliantes alternos de betaína y etanol al 70% y use un paño fenestrado para cubrir al ratón mientras mantiene visible la región de la incisión. Abra el cuero cabelludo anteroposterior desde ligeramente por encima de los ojos y retraiga aproximadamente medio centímetro de piel.

Vuelva a colocar la cabeza en la etapa estereotáxica de modo que la piel se tire hacia afuera para exponer el cráneo, y use un hisopo de algodón para aplicar peróxido de hidrógeno. Use una hoja de bisturí para raspar cuidadosamente el cráneo para limpiarlo. Y aplicar una gota de adhesivo de aproximadamente 50 microlitros sobre el hueso.

Use el aplicador para esparcir el adhesivo sobre el cráneo y coloque el adhesivo bajo luz ultravioleta durante 40 segundos. Cuando el adhesivo se haya endurecido, mida las coordenadas utilizando el bregma expuesto como referencia. Y use una aguja de calibre 32 para crear orificios de electrodos bilateralmente en la región CA1 del hipocampo, bilateralmente en la corteza parietal y en el cerebelo.

Limpie la sangre de la superficie del cráneo y use el brazo estereotáxico para bajar los electrodos conectados al conector hembra en el cerebro. Implante cada electrodo en el cerebro y fije los electrodos en su lugar con acrílico dental. Pegue el auricular al cráneo con acrílico dental adicional.

Inyecte por vía subcutánea cinco miligramos por kilogramo de ketoprofeno en cada cachorro. Cuando todos los electrodos se hayan asegurado en al menos la mitad de la camada, devuelva las crías a la madre. 24 horas después de la implantación del electrodo, coloque a cada animal en una cámara de plexiglás hecha a medida a 37 grados Celsius para el registro de EEG y use un cable amplificador operacional flexible hecho a medida para conectar a los cachorros a un sistema de monitoreo de EEG de video.

Utilice un amplificador diferencial multicanal para digitalizar los datos de EEG a 1000 hercios con una ganancia de un kilo y revise la señal de EEG en el software de análisis adecuado. A continuación, registre un electroencefalograma basal previo a la lesión durante 30 minutos, antes de desconectar a los animales para el procedimiento de litigio de la arteria carótida. Después de registrar los datos basales del EEG, esterilice la piel entre la mandíbula y la clavícula en el lado izquierdo del cuello con betaína y etanol como se ha demostrado.

Y hacer una incisión de aproximadamente un centímetro en el lado izquierdo del cuello. Coloque al cachorro bajo un microscopio de disección y retraiga con cuidado el tejido subcutáneo y la piel para exponer la arteria carótida. Coloque un trozo de cinco centímetros de sutura de seda estéril debajo de la arteria.

Identifique el nervio vago y separe y retraiga delicadamente el nervio de la arteria. Maniobre la sutura de modo que quede solo debajo de la arteria. Después de identificar el nervio vago, separe y retraiga delicadamente el nervio de la arteria y use micropinzas para enhebrar una pieza de cinco centímetros de sutura de seda estéril debajo de la arteria.

Ata una sutura de doble nudo alrededor de la arteria para ocluir el flujo y cortar el exceso de sutura. Reemplace el tejido subcutáneo y la piel sobre la arteria expuesta y use Vetbond para sellar la incisión. A continuación, vuelva a colocar al animal en una cámara a temperatura ambiente colocada sobre un colchón cálido y realice controles de temperatura infrarrojos puntuales de la temperatura central del cachorro para evitar abrir la cámara.

Después de permitir que los cachorros se recuperen durante una hora con monitoreo continuo de fracción de oxígeno inspirado, enjuague la cámara con 60 litros por minuto de 100% de nitrógeno y 0,415 litros por minuto de 100% de oxígeno. Una vez que la saturación de oxígeno en la cámara alcanza el 12%, disminuya el flujo de nitrógeno a 10 litros por minuto mientras mantiene el flujo de oxígeno sin cambios. Haciendo pequeños ajustes según sea necesario, mantenga la fracción de oxígeno inspirado al 8% durante 45 minutos.

Después de 45 minutos de exposición a la hipoxia, devuelva la fracción de oxígeno inspirado al 21% y permita que las crías se recuperen en la cámara con monitoreo de EEG durante dos horas. Al final del período de registro, desconecte los ratones del sistema de EEG y devuelva los cachorros a la madre. Las grabaciones de EEG de video permiten correlacionar los hallazgos electrográficos con el comportamiento en el video.

La mayoría de los eventos observados en este modelo involucran comportamientos focales unilaterales o mixtos. Durante el período hipóxico, un subconjunto de ratones suele exhibir una actividad convulsiva no compulsiva, durante la cual las crías están inmóviles con una actividad convulsiva sostenida en el EEG. En este análisis, la actividad basal fue similar a la previamente descrita en las crías de ratón P 10.

Después del litigio y antes del comienzo de la hipoxia, un subconjunto de ratones exhibió convulsiones. Después de la inducción de la hipoxia, se redujo la amplitud de fondo en el EEG. Y se exhibieron ráfagas intermitentes de descargas de ondas de pico, seguidas de supresión.

Los ratones exhibieron convulsiones electrográficas que emergen de un fondo suprimido como descargas rítmicas de ondas de pico que progresaron para volverse más complejas y frecuentes con ondas de pico polis. Durante la hipoxia, el análisis del espectrograma de potencia es notable por las asimetrías entre los hemisferios isquémico y contralateral. El hemisferio isquémico exhibe un patrón de supresión de ráfagas y el hemisferio contralateral exhibe un fondo suprimido.

Durante la reoxigenación y la recuperación, un subconjunto de ratones continúa teniendo convulsiones durante el resto del período de registro. El fondo del EEG se suprime en comparación con el valor basal después de la hipoxia, con una recuperación gradual observada durante el período de registro posterior a la hipoxia. Cuando se trabaja con cachorros neonatos, la precisión es clave.

Además, se debe tener especial cuidado en colocar a los cachorros con la madre en grupos después de los procedimientos quirúrgicos. La videoelectroencefalografía se puede utilizar en cachorros neonatales junto con la histopatología, las imágenes y el comportamiento para examinar el impacto de las convulsiones neonatales en la cirugía de lesiones y los resultados conductuales.