Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

Este protocolo está diseñado para digerir ojos de ratón enteros en una suspensión de una sola célula para la citometría de flujo multiparamétrica de fagocitos mononucleares que incluyen macrófagos, monocitos, microglía y células dendríticas. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de utilizar el análisis cuantitativo con intensidad de fluoróforo para diferenciar tipos de células estrechamente relacionados mediante la expresión de marcadores de superficie celular. Nuestro protocolo está optimizado para el análisis de la heterogeneidad de macrófagos, incluyendo tanto poblaciones residentes como infiltrantes en el modelo de neovascularización coroidea inducida por láser.

Sin embargo, estos conceptos y técnicas se pueden aplicar igualmente a otros modelos como la retinopatía diabética, la uveítis autoinmune experimental, así como las manifestaciones del lupus. Al intentar este protocolo, comprender la configuración de su citómetro es un punto de partida crítico, ya que no todos los citómetros están configurados exactamente de la misma manera. Por lo tanto, es posible que sea necesario valorar los volúmenes de anticuerpos conjugados con fluorescencia y/o ajustar los fluoróforos para optimizar el protocolo en función de la configuración del citómetro.

Comience preparando el tampón de digestión de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Usando un microscopio de disección y un aumento total de 10X, extraiga la conjuntiva y el nervio óptico restantes de los ojos. Mueva los ojos limpios a un plato de disección seco o a un pequeño bote de pesaje, luego haga dos heridas perforantes con un ángulo de 90 grados entre ellas a través del eje visual.

Use una jeringa con una aguja de calibre 30 para inyectar de 0,15 a 0,2 mililitros de tampón de digestión en la cavidad vítrea de cada ojo. Picar los ojos con tijeras de resorte y pinzas finas, luego disocie el tejido del cristalino con una interrupción mecánica contundente para evitar la obstrucción de las puntas de las pipetas en los pasos posteriores. Enjuague las pinzas y las tijeras con 0,75 mililitros de tampón de digestión y reemplace el plato para cada muestra.

Utilice una pipeta P1000 para transferir el contenido de la placa a un tubo de disociación en hielo, teniendo cuidado de no perder ningún material. Enjuague el plato con 1,5 mililitros adicionales de tampón de digestión y agréguelo al tubo de disociación, lo que eleva el volumen total a entre 3,25 y 3,5 mililitros. Disociar el tejido en un disociador electrónico como se describe en el manuscrito del texto, asegurándose de que todo el tejido esté en el fondo del tubo de disociación invertido y en contacto con el tampón de digestión.

Luego incube el tubo de disociación a 37 grados centígrados y 200 RPM durante 30 minutos. Repita la disociación del tejido dos veces más, incubando la muestra a 37 grados Celsius y 200 RPM durante 30 minutos entre las disociaciones. Para detener la reacción, agregue 10 mililitros de tampón de flujo frío y coloque los tubos de muestra sobre hielo.

Para crear una suspensión de una sola célula, cuele la reacción de digestión ocular detenida a través de un filtro de 40 micrómetros colocado en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros. Use el émbolo de una jeringa de 2.5 mililitros para empujar cualquier pieza restante de tejido ocular sin digerir a través del filtro. Lave el tubo de disociación con 10 mililitros de tampón de flujo y enjuague el filtro.

A continuación, utilice el mismo émbolo para volver a pasar los trozos de tejido ocular no digeridos a través del filtro. Repita este proceso con cinco mililitros de tampón de flujo. A continuación, lave el tubo de disociación y el filtro con 10 mililitros finales de tampón de flujo.

Centrifugar el tubo cónico a 400 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y decantar el sobrenadante sin alterar la pelletización de la célula. Rompe el pellet golpeando el tubo contra otro tubo. A continuación, añada un mililitro de solución lisante y agite el tubo a temperatura ambiente durante 30 segundos para lisar los glóbulos rojos.

Detenga la reacción con 20 mililitros de tampón de flujo y centrífuga del tubo cónico a 400 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula. Golpee el tubo contra otro tubo.

A continuación, añade cinco mililitros de HBSS frío. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. Agregue 0,5 mililitros de tinción de muertos vivos a cada muestra con una pipeta P1000, asegurándose de disociar completamente el pellet.

Transfiera las muestras a tubos de microtitulación de 1,2 mililitros e incube durante 15 minutos en la oscuridad. Mientras tanto, cuente una alícuota de 10 microlitros de la muestra con azul de tripán y un hemocitómetro. Después de la incubación, lave cada muestra agregando 400 microlitros de tampón de flujo frío.

Centrifugar los tubos en una gradilla de tubos de microtitulación a 400 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula. Resuspenda las células completamente en 500 microlitros de tampón de flujo en frío. A continuación, repita la centrifugación y retire el sobrenadante.

Bloquea hasta cinco millones de células vivas en 50 microlitros de bloque FC. Disocie completamente el pellet de la célula e incube a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, añada 50 microlitros de solución de tinción de anticuerpos a cada muestra.

Mézclalo completamente e incuba durante otros 30 minutos a cuatro grados centígrados. Aquí se muestran las propiedades del área de dispersión directa frente al área de dispersión lateral para todos los eventos analizados desde dos ojos de un solo mouse. Los recuentos de perlas se limpiaron y confirmaron mediante el trazado de PE sobre APC-Cy7, creando un grupo apretado de eventos positivos para PE y negativos para APC-Cy7.

A continuación, se identificaron singletes en células vivas de todos los eventos. Los singletes se correlacionaron positivamente en la altura de dispersión directa frente al área de dispersión directa, mientras que las celdas doblete y triplete tenían mayor área de dispersión directa que altura de dispersión directa. Las células vivas son positivas en el área de dispersión directa y las muertas vivas son negativas.

Aquí se muestra la estrategia inicial de compuerta para la delineación de fagocitos mononucleares a partir de células singlete vivas. Los singletes vivos se visualizaron utilizando un gráfico CD45 versus CD11b. La ausencia de células CD45 positivas en el CD45 FMO confirmó la selección de la puerta.

A continuación, se excluyeron los neutrófilos, los eosinófilos, los linfocitos B y los linfocitos K, y los linfocitos T mediante el trazado de singletes vivos CD45 positivos con puerta de linaje frente a CD11b. También se identificaron subconjuntos de macrófagos.

Se delinearon microglías en las células CD45-dim con tinción baja de MHC2 CD64 positivo. Los macrófagos MHC2 negativos se identificaron como CD64 positivos, MHC2 negativos. Se demostró que los macrófagos CD11c negativos y CD11c positivos eran CD64 y CD11c negativos.

y CD64 positivo CD11c positivo en las células MHC2 positivas. Se encontró que el tratamiento con láser aumentó la cantidad de macrófagos MHC2 negativos, CD11c negativos y CD11c positivos. Los recuentos de células dendríticas también se regularon al alza mediante tratamiento con láser, mientras que los recuentos de microglía y monocitos no se vieron afectados.

La perfusión sistémica no tuvo ningún efecto sobre el número de macrófagos. Siguiendo este procedimiento, la clasificación celular activada por florescencia, en lugar del análisis por sí solo, permite caracterizar la heterogeneidad de los macrófagos y su impacto en la función a través de estudios transcriptómicos o proteómicos.