Name: Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a digerir ojos enteros de ratón para citometría de flujo multiparamétrica de fagocitos mononucleares. Este método permite identificar macrófagos, microglía y células dendríticas en modelos de retinopatía diabética y uveítis autoinmune.

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JAL fue apoyado por la subvención de los NIH K08EY030923; Cmc fue apoyado por una subvención K01 (5K01AR060169) del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos del NIH y una Nueva Beca de Investigación (637405) de la Alianza de Investigación lupus.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 estaban alojados en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales estaban alojados en ciclo claro/oscuro de 12/12 h con libre acceso a alimentos y agua.
1. Recolección de tejido ocular
<ol><li>Sacrificar ratones C57BL/6J de 10-12 semanas de edad de cualquiera de los dos sexos usando la administración regulada de dióxido de carbono hasta que el ratón no responda y ya no inhale. Realizar dislocación cervical u otro método secundario aprobado para garantizar la eutanasia. NOTA: Se puede realizar perfusión transcardial para eliminar los leucocitos circulantes que no están en los tejidos oculares. En este experimento, la perfusión sistémica no reduce el número de microglia, monocitos, macrófagos o células dendríticas detectadas en ojos enteros sin tratar o tratados con láser. Por lo tanto, la mayoría de estos tipos de células se encuentran en los tejidos oftálmicos y este paso es opcional.</li>
	<li>Para enuclear los ojos, empuje hacia abajo cerca de la cavidad ocular mientras coloca un par de fórceps curvas suavemente debajo del ojo mientras se destaca de la cavidad. Pellizcar fórceps cerrados debajo del ojo sin apretar el ojo real. Desalojar la vista de la conjuntiva circundante (véase la publicación previa)23.</li>
	<li>Tire del ojo lateralmente hasta que el nervio óptico sea la única conexión restante para separar el ojo. El nervio óptico a menudo se corta con tensión, pero una pequeña tijera a veces es necesaria para cortar el nervio óptico. Coloque el ojo en la solución salina tamponada (HBSS) fría de 1x Hank con calcio y magnesio en tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.</li>
</ol>2. Digestión del tejido ocular
<ol><li>Preparar el tampón de digestión que contiene 0,1 mg/mL enzima de digestión y 0,2 mg/ml DNase en HBSS frío. Reconstituir 5 mg de enzima digestión en 2 ml de agua estéril inicialmente. Preparar una dilución inicial de 10 mg/ml de DNase en HBSS. Por cada 10 ml del tampón de digestión (suficiente para 3 animales) mezclar 9,4 ml de HBSS frío con 0,4 ml de enzima de digestión reconstituida y 0,2 ml de DNase I diluido. NOTA: Estas concentraciones se determinaron empíricamente sobre múltiples experimentos para proporcionar niveles óptimos de tinción de anticuerpos de células individuales, al tiempo que se reducía la muerte celular. La colágena D se probó como una alternativa a la enzima digestión con menor viabilidad celular y disminución de las células CD45+. Consulte Discusión para obtener más detalles sobre el proceso iterativo para optimizar la digestión.</li>
	<li>Bajo un microscopio diseccionador a una ampliación total de 10x, retire la conjuntiva y el nervio óptico restantes usando fórceps finos y tijeras de resorte en HBSS frío.</li>
	<li>Mueva los ojos limpios a un plato de disección seco o a un pequeño bote de pesaje. Inyectar 0,15-0,20 ml/ojo de amortiguador de digestión a través de jeringa equipada con aguja de 30 G en la cavidad vítrea después de que dos heridas perforadoras se hacen en el ojo a través del eje visual y a 90° de distancia de esta primera herida para la salida del búfer de digestión.</li>
	<li>Ojos enteros mince usando tijeras de resorte y fórceps finos con todas las piezas más pequeñas de 0,5 mm x 0,5 mm. Disociar el tejido de la lente con una interrupción mecánica contundente a través de fórceps para evitar la obstrucción de puntas de pipeta en pasos posteriores. Para cada muestra, enjuague los fórceps y tijeras cada uno con 0,75 ml de amortiguador de digestión en un plato pequeño. Use un plato nuevo para cada muestra.</li>
	<li>Transfiera el contenido del plato a un tubo de disociación en hielo utilizando pipeta P1000 teniendo cuidado de no perder ningún material en la transferencia de pipeta. Enjuague el plato con 1,5 ml adicionales de amortiguador de digestión, lo que eleva el volumen total en tubo de disociación a 3,25-3,50 ml.</li>
	<li>Coloque el tubo de disociación invertido en disociador electrónico y ejecute el ciclo "m_brain_03_01", que consiste en una rotación unidireccional de 1 min a 200 rpm a temperatura ambiente, que es un programa precargado. Asegúrese de que todo el tejido esté en la parte inferior del tubo de disociación en contacto con el búfer de digestión y el rotor para este y todos los pasos restantes.</li>
	<li>Coloque el tubo de disociación en la incubadora de agitación durante 30 minutos a 200 rpm a 37 °C.</li>
	<li>Repita los pasos 2.6 y 2.7 una vez más. Después de la segunda incubación de 30 minutos realizar una digestión mecánica final utilizando disociador electrónico como en el paso 2.6.</li>
	<li>Detenga la reacción añadiendo 10 ml de amortiguador de flujo frío y coloque tubos sobre hielo.</li>
</ol>3. Preparación de la suspensión celular
<ol><li>Para crear la suspensión de una sola célula, vierta la reacción de digestión ocular detenida a través de un filtro de 40 μm colocado en la parte superior de un tubo centrífugo cónico de 50 ml. Usando el émbolo de una jeringa de 2,5 ml, empuje cualquier pedazo restante de tejido ocular indigno a través del filtro.</li>
	<li>Lave el tubo de disociación con 10 ml de tampón flow y enjuague el filtro antes de usar el mismo émbolo para pasar de nuevo piezas de tejido ocular no digerida a través del filtro.</li>
	<li>Repita el paso 3.2 usando 5 mL de búfer de flujo.</li>
	<li>Lave el tubo de disociación y filtre con un amortiguador final de 10 ml de flujo. NOTA: El volumen total de digestión y búfer de flujo es de aproximadamente 38-40 ml para cada muestra.</li>
	<li>Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Prepare la solución de lysing 1x añadiendo solución de lisante de 10x al agua estéril. Rompe el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Para liar los glóbulos rojos, añadir 1 ml de solución de lisante 1x para 30 s con remolino a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Detenga la reacción con 20 ml de búfer de flujo.</li>
	<li>Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Disociar el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Añadir 5 ml de frío 1x HBSS por tubo.</li>
	<li>Tubos centrífugas a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar supernadante.</li>
</ol>4. Tinción de la suspensión celular para fagocitos mononucleares
<ol><li>Prepare 0,5 ml de mancha viva/muerta por muestra diluyendo el tinte vivo/muerto 1:5.000 en HBSS frío.</li>
	<li>Agregue la mancha Live/Dead a cada muestra usando una pipeta P1000 asegurándose de disociar el pellet por completo. Transfiera muestras a tubos de micro titulaciones de 1,2 ml.</li>
	<li>Tome una pequeña alícuota (10 μL) para contar las células utilizando un hemociclomeciómetro o contador de células automático (ver 4.4). Incuba muestras con mancha viva/muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Cuente celdas usando Trypan blue para determinar el número de celdas vivas por muestra. NOTA: Típicamente, 2 ojos de un ratón C57BL/6J de 10-12 semanas de edad contienen menos de 2 x 106 células vivas.</li>
	<li>Lave muestras añadiendo 400 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Células resuspend completamente en 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Bloquee hasta 5 x 106 células vivas en 50 μL de bloque Fc (dilución de 1:50 en búfer de flujo frío de rata purificada anti-ratón CD16/CD32). Si más de 5 x 106 células vivas, aumente los volúmenes adecuadamente.</li>
	<li>Añadir bloque Fc al pellet asegurándose de disociar completamente la muestra. Incubar durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 50 μL de solución de tinción de anticuerpos (ver Tabla 1 para su elección y cantidad de cada anticuerpo que se incluye en la solución) por 5 x 106 células vivas directamente a las células en bloque Fc y mezclar completamente. Incubar durante 30 min a 4 °C. NOTA: Las cantidades de anticuerpos dependen de la configuración del citómetro de flujo y deben valorarse de forma independiente para cada laboratorio e instrumento. Consulte la Tabla 2 para la configuración de instrumentos de filtros y espejos. Para valorar anticuerpos, comience con la recomendación del fabricante y calcule el índice de tinción. Realice una prueba de concentraciones de anticuerpos variables (tanto por encima como por debajo de la recomendación del fabricante) y elija la concentración más baja de anticuerpos donde se mantiene el índice de tinción. Además, asegúrese de que la tinción positiva que es menos brillante que el control de un solo color. Utilice células sin manchar para asegurarse de que las células manchadas negativamente están a escala y tienen un pico en o menos de 1 x 102. Utilice una fluorescencia menos un control para definir las células manchadas positivamente.</li>
	<li>Lave muestras añadiendo 700 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Opcionalmente, después de la tinción de anticuerpos, las muestras se pueden fijar con 500 μL de paraformaldehído del 2% en el búfer de flujo. Corrija muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice un lavado como se describe en 4.10. Almacene muestras fijas a 4 °C. Las cuentas de recuento deben agregarse el día de la recopilación de datos de citometría de flujo. Las muestras fijas deben ejecutarse en el cytómetro de flujo en 1-2 días. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un peligro corrosivo y para la salud.</li>
	<li>Lave muestras de nuevo usando 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar la mitad del sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Resuspend pellets y transferir a un pozo 96, placa de ensayo de fondo en U. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Para decantar el sobrenadante, gire la placa y en una sacudida fuerte desaloje el líquido en una cuenca del fregadero, sin perturbar el pellet.</li>
	<li>En un nuevo tubo micro titulador de 1,2 ml, coloque 50 μL de cuentas de recuento bien vórtices.</li>
	<li>Pellets resuspend en 96 placa de pozo en 200 μL de amortiguador de flujo frío. Agregue la mezcla celular en la parte superior de las cuentas del paso anterior. Ejecute el citómetro de flujo en un volumen total de 250 μL / tubo de micro titulador.</li>
</ol>5. Recopilación de datos de citometría de flujo
<ol><li>Encienda y prepare el citómetro de flujo. Las instrucciones enumeradas aquí son para un cytómetro láser de cuatro modificados (Tabla 2).</li>
	<li>Ejecute una muestra de prueba, que incluye una pequeña alícuota de cada muestra, para asegurarse de que todas las células están a escala para cada detector. Ajuste los voltajes para que todas las celdas estén a escala.</li>
	<li>Ejecute controles de un solo color (SCC) para cada fluoróforo utilizado en el cóctel de tinción(Tabla 3). Coloque el tubo de micro titulación en un tubo de poliestireno de 5 ml más grande para colocarlo en la etapa del citómetro de flujo. NOTA: Los fluoróforos radiculares como BV421 (Azul Pacífico), FITC, PE, Alexa647 (APC) y Alexa700 no requieren el mismo anticuerpo que el cóctel (es decir, CD19 PE para CD64 PE). Sin embargo, los fluoróforos tándem como PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 requieren el mismo anticuerpo para SCC que el cóctel debido a la posible disociación de los fluoróforos conjugados.<ol>
<li>Cree el SCC para BV421 añadiendo 2 gotas de cuentas de compensación a un tubo de titer de 1,2 ml junto con 1 μL de hámster anti-ratón CD11c BV421. Las cuentas de compensación se utilizan porque CD11c BV421 es un subtipo lambda IgG en lugar de kappa como se describe en 5.3.3. Incubar durante 15 minutos a 4 °C. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.</li>
		<li>Crea el SCC para el tinte Live/Dead añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) a partir de las cuentas reactivas de amina, seguidas de 1 μL de tinte Vivo/Muerto. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de las cuentas reactivas amina. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.</li>
		<li>Cree los SCC restantes añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) del conjunto de cuentas anti-rata y anti-hámster Ig kappa, seguida de la cantidad de anticuerpos enumerada(Tabla 3)en un tubo de titer de 1,2 ml. Incubar durante 15 min a 4 °C. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de la anti-rata y anti-hámster Ig kappa conjunto de cuentas. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.</li>
		<li>Vórtice todas las mezclas de cuentas completamente. Almacene los SCCs a 4 °C durante un tiempo de hasta 3 días. NOTA: El SCC para ratones reporteros fluorescentes son células sin manchar.</li>
		<li>Al ejecutar SCCs, establezca voltajes de tal manera que la muestra SCC tenga un pico mayor que cualquier fluorescencia para una muestra de células en el mismo canal detector. Además, se deben fijar tensiones para que cualquier SCC tenga al menos una diferencia de registro de 0,5 entre el pico del histograma en el canal de interés frente a cualquier otro canal (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute muestras en eventos de mantenimiento "Bajos"/segundo por debajo de 4000. Si el caudal no se puede reducir adecuadamente, diluya las muestras con un búfer de flujo frío adicional. Registre el volumen agregado, ya que esto será necesario para el cálculo del recuento (ver resultados representativos).</li>
	<li>Recopile al menos 3 x 106 eventos por muestra. Esto puede ser mayor que el número de células debido a que los gránulos pigmentos y los desechos cuentan como eventos en el cytómetro.</li>
	<li>Registre una Fluorescencia Menos Uno (FMO) para cada fluoróforo que no sea Vivo/Muerto para una estrategia de gating adecuada en la sección 6.4. Una FMO es una muestra que ha sido manchada con todos los fluoróforos excepto uno.</li>
	<li>Limpie y apague el citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de la instalación.</li>
</ol>6. Anotación de datos de citometría de flujo
<ol><li>Abra una nueva hoja de trabajo mediante el software de análisis. Importe archivos FCS desde el citómetro para todas las muestras y controles de un solo color.</li>
	<li>Utilice SCCs para crear una matriz de compensación.</li>
	<li>Aplique la matriz de compensación a sus muestras manchadas y FMOs.</li>
	<li>Utilice los FMOs para determinar la tinción positiva para dibujar puertas.</li>
</ol>

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<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).</li>
<li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li>
<li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis cuantitativo de múltiples tipos de células en un tejido complejo. En este informe, describimos la detección citométrica de flujo de poblaciones mononucleares de fagocitos, incluidos monocitos, células dendríticas y subconjuntos de macrófagos, después de lesiones láser en el ojo del ratón. Liyanage et al recientemente informó de una estrategia de gating similar para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, DCs, macrófagos, macrofagos infiltrados y monocitos...

El sistema inmunitario innato incluye múltiples tipos celulares que estimulan la activación y la inflamación del complemento. Las células inmunes innatas incluyen células asesinas naturales (NK), mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares, compuestos por monocitos, macrófagos y células dendríticas, se han implicado en la fisiopatología de múltiples afecciones oftálmicas como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE)1. En este protocolo, nos centraremos en la identificación de fagocitos mononucleares utilizando análisis citométricos de flujo multiparamétrico en un modelo de ratón de AMD neovascular2. Este protocolo es adaptable para modelos de ratón de retinopatía diabética y/o uveítis, pero se recomienda una disección ocular más extensa debido a la naturaleza sistémica de estas enfermedades.
Los fagocitos mononucleares expresan marcadores de superficie celular superpuestos. Los macrófagos y microglia residentes en tejidos de larga duración se originan a partir del progenitor eritromicoide derivado del saco de yema3,mientras que el reciclaje de macrófagos y células dendríticas se diferencian del progenitor de células dendríticas de células dendríticas derivadas de la médula ósea4. Los marcadores de superficie de celda del ratón comunes a monocitos, macrófagos y celdas dendríticas incluyen CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17y el marcador intracelular Iba18. Con el fin de superar este desafío, el análisis transcriptómico de macrófagos, monocitos y células dendríticas de múltiples tejidos define CD64 como un marcador de superficie celular específico del macrófago6. Se han descrito macrófagos en el iris, la coroides, el cuerpo ciliario y el nervio óptico en ojos sanos3. Alternativamente, la identificación de células dendríticas es más difícil; el método más específico de identificación de células dendríticas requiere mapeo del destino utilizando el ratón reportero Zbtb46-GFP9. Independientemente de esta línea de reportero, expresión de CD11c y MHCII en conjunto con la ausencia de CD64 puede identificar posibles células dendríticas6,10. Las células dendríticas se han identificado en córnea, conjuntiva, iris y coroides en los ojos normales11. Las microglias son macrófagos especializados ubicados en la retina, protegidos por la barrera hematoencefálica y derivados de las células progenitoras del saco de yema12. Como resultado, la microglia retiniana se puede diferenciar de los macrófagos derivados de monocitos por sus niveles tenues de la expresión CD4513 y los altos niveles de Tmem119, que está disponible como anticuerpo de citometría de flujo14. Sin embargo, tras la activación de la microglia, el CD45 puede estar regulado15 y Tmem119 puede estar regulado a la baja3,lo que demuestra la complejidad de la biología de la microglia y esto es probablemente relevante tanto en AMD como en su modelo de ratón. Por último, los monocitos se pueden dividir en al menos dos subtipos, incluidos los clásicos y no clásicos. Los monocitos clásicos muestran ccr2+ly6CaltoCX3CR1baja expresión, y los monocitos no clásicos demuestran CCR2-Ly6CbajoCX3CR1 marcadoresaltos 5.
Debido a la necesidad del análisis cuantitativo de la expresión de marcadores, es decir, niveles altos frente a bajos/tenues, la citometría de flujo multiparamétrico es el método ideal para la discriminación entre monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en el ojo y otros tejidos. Otras ventajas incluyen la identificación de subpoblaciones, la capacidad de utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para ordenar las poblaciones celulares para el análisis transcriptómico o proteómico, y el mapeo del destino. La principal desventaja de la citometría de flujo multiparametrista es la falta de arquitectura tisular. Esto puede ser superado por la disección oftálmica en los diversos subcompartmentos oculares: córnea, conjuntiva, iris, lente, retina y complejo choroide-sclera. Además, se pueden realizar imágenes confirmatorias de inmunofluorescencia, pero está limitada por el número de marcadores y la falta de cuantificación robusta.
Estudios de asociación del genoma han vinculado múltiples genes complementarios con AMD16. La activación del complemento conduce a la producción de anafiltoxina, el reclutamiento de leucocitos y la inflamación resultante. En ratones deficientes en receptores complementarios, la lesión láser reduce el reclutamiento de fagocitos mononucleares y la neovascularización coroidal inducida por láser (CNV) área17. Del mismo modo, el ratón knockout del receptor de quimiocina con motivo C-C 2 (CCR2), que es deficiente en el reclutamiento de monocitos al tejido, demuestra tanto la disminución del reclutamiento de fagocitos mononucleares como el área18del CNV inducida por láser. Estos enlaces de datos complementan y mononucleares fagocitos con CNV experimental y posiblemente AMD neovascular. En apoyo de esta asociación, los receptores complementarios están disregulados en monocitos sanguíneos periféricos en pacientes con DMM neovascular19,20. Estos datos demuestran una fuerte asociación entre la AMD y los fagocitos mononucleares.
En este manuscrito, utilizaremos el modelo experimental de CNV inducido por láser para caracterizar las poblaciones mononucleares de fagocitos en el ojo del ratón utilizando citometría de flujo multiparametral. El CNV inducido por láser es el modelo estándar de ratón de la AMD neovascular, que demostró la eficacia de la terapia amd neovascular de primera línea actual21. Este protocolo describirá la enucleación de los ojos del ratón, la disección ocular, la digestión en una sola suspensión celular, la tinción de anticuerpos, la determinación de voltajes láser utilizando controles de un solo color y la estrategia de gating utilizando controles de fluorescencia menos uno (FMO). Para obtener una descripción detallada del modelo CNV inducido por láser, consulte la publicaciónanterior 22. Con este protocolo, definiremos microglia, monocitos, células dendríticas y poblaciones de macrófago. Además, utilizaremos MHCII y CD11c para definir aún más subconjuntos de macrófago dentro del modelo CNV inducido por láser.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>pipetas de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>cónicas de 15 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 2,5 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 20%</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 30 G</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml jeringa Luer Lock</td><td>Fisher Scientific 14955457</td><td></td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm plato de pesaje de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml cónicas Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ensayo de 96 pocillos, fondo en U sin tapa</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Perlas reactivas a la amina</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Juego de cuentas Ig kappa anti-ratas y anti-hámster</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6J</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de contador de células</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de compensación</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de conteo</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de digestión</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T Tubos</td><td></td></tr><tr><td>de disociación</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Disociador electrónico</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc bloque, rata anti-ratón CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de flujo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro</td><td>de flujo BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de flujo</td><td>Halcón</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-ratón CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 562782 <td></td></tr><tr><td>Cubitera</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Tinte vivo/muerto</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lisado, solución 10x</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titulación de tubo y gradilla</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Antiratón CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Antiratón NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta P1000</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta P2</td><td>Eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P20 Puntas de pipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta hombre</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón B220 PECF594 BD</td><td>Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45 FITC ThermoFisher</td><td></td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>561085</tr><tr><td>Rata anti-ratón Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células estériles, malla de nailon de 40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Agua estéril, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de cubo oscilante</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripano, solución al 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

El sistema inmunitario innato desempeña un papel importante en la fisiopatología ocular, incluida la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Las células inmunes innatas, específicamente fagocitos mononucleares, expresan marcadores de superficie celular superpuestos, lo que hace que identificar estas poblaciones sea un desafío. La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis simultáneo y cuantitativo de múltiples marcadores de superficie celular con el fin de diferenciar monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en los ojos del ratón. Este protocolo describe la enucleación de ojos enteros del ratón, disección ocular, digestión en una sola suspensión celular y tinción de la suspensión de una sola célula para marcadores de células mieloides. Además, explicamos los métodos adecuados para determinar voltajes utilizando controles de un solo color y para delinear puertas positivas usando fluorescencia menos uno controles. La principal limitación de la citometría de flujo multiparametrista es la ausencia de arquitectura tisular. Esta limitación puede superarse mediante citometría de flujo multiparar de compartimentos oculares individuales o tinción de inmunofluorescencia gratuita. Sin embargo, la inmunofluorescencia está limitada por su falta de análisis cuantitativo y la reducción del número de fluoróforos en la mayoría de los microscopios. Describimos el uso de citometría de flujo multiparamétrico para proporcionar un análisis altamente cuantitativo de fagocitos mononucleares en neovascularización coroidal inducida por láser. Además, la citometría de flujo multiparametrismo se puede utilizar para la identificación de subconjuntos de macrófago, mapeo del destino y clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos.

La Figura 1 mostró histogramas de frecuencia no compensados para los SCCs y las celdas para el láser rojo: Alexa647, Alexa700 y APC-Cy7. En la Figura 1A,la línea magenta representaba el pico del SCC para Alexa647, mientras que la línea de cian mostraba la diferencia de registro 0.5 prevista. Observe que el pico en Alexa700 y APC-Cy7 fue a la izquierda (menos brillante) de la línea de cian. También tenga en cuenta que todas las celdas estaban a la izquierda de la...

Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Este protocolo está diseñado para digerir ojos de ratón enteros en una suspensión de una sola célula para la citometría de flujo multiparamétrica de fagocitos mononucleares que incluyen macrófagos, monocitos, microglía y células dendríticas. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de utilizar el análisis cuantitativo con intensidad de fluoróforo para diferenciar tipos de células estrechamente relacionados mediante la expresión de marcadores de superficie celular. Nuestro protocolo está optimizado para el análisis de la heterogeneidad de macrófagos, incluyendo tanto poblaciones residentes como infiltrantes en el modelo de neovascularización coroidea inducida por láser.Sin embargo, estos conceptos y técnicas se pueden aplicar igualmente a otros modelos como la retinopatía diabética, la uveítis autoinmune experimental, así como las manifestaciones del lupus. Al intentar este protocolo, comprender la configuración de su citómetro es un punto de partida crítico, ya que no todos los citómetros están configurados exactamente de la misma manera. Por lo tanto, es posible que sea necesario valorar los volúmenes de anticuerpos conjugados con fluorescencia y/o ajustar los fluorófo

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra la citometría de flujo para medir la absorción microglial de biopartículas fluorescentes después de la administración intravítrea en un ojo de ratón. La citometría de flujo detecta células vivas que expresan CD11b y distingue las células de microglía fagocítica que exhiben fluorescencia verde de otras células mieloides, incluidos los monocitos que expresan Ly6C y los neutrófilos que expresan Ly6G.

Medición de la absorción microglial de partículas fluorescentes administradas intravítreamente mediante citometría de flujo

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Las imágenes de células vivas de las células sanguíneas etiquetadas en la circulación ocular pueden proporcionar información sobre la inflamación y la isquemia en la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Se describe un protocolo para etiquetar células sanguíneas e imágenes de las células marcadas en la circulación retiniana.

Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Aprende a digerir ojos enteros de ratón para citometría de flujo multiparamétrica de fagocitos mononucleares. Este método permite identificar macrófagos, microglía y células dendríticas en modelos de retinopatía diabética y uveítis autoinmune.

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

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