Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

El uso de este método puede permitir descubrir cómo ciertos cambios en la expresión génica pueden atribuirse a patologías asociadas a enfermedades neurológicas. La ventaja de esta técnica es que evita la necesidad de crear o comprar líneas genéticas de animales que pueden tardar años en crearse y validarse. Esta técnica permite el estudio de los genes implicados en los trastornos neurológicos.

Determinar cómo genes específicos contribuyen a la patología es un paso importante en el desarrollo de nuevas terapias. La ventaja de este protocolo es aprender a manipular los embriones para que el experimentador logre el paso de transferencia de genes sin disminuir las tasas de supervivencia. La demostración visual de este método es importante porque los embriones son muy frágiles, por lo que es útil observar cómo un experimentador experimentado los manipula durante el procedimiento.

Lleve a las madres embarazadas al área de la cirugía al menos 30 minutos antes de la cirugía. Esterilice todo el sitio de la cirugía con toallitas germicidas esterilizadas y luego etanol al 70%. A continuación, esterilice las herramientas de autoclave en un esterilizador de perlas de vidrio.

Transfiera el PBS estéril a tubos cónicos de 50 mililitros y coloque los tubos en un baño de agua calentado a 38 a 40 grados Celsius. Verifique la temperatura de solución salina estéril con un termómetro. Encienda la bomba de circulación de calentamiento de agua para que se caliente a 37 grados centígrados.

Luego encienda el inyector de presión y el electroporador y asegúrese de que funcionen correctamente. Haga girar brevemente la solución de ADN de plasma en una centrífuga de mesa y colóquela en hielo. Tire de las pipetas de vidrio en un extractor de pipetas de modo que la punta de la pipeta de vidrio estirado tenga unos 50 micrómetros de diámetro.

A continuación, llene la pipeta con 20 a 40 microlitros de solución de ADN. Prepare todos los artículos necesarios para la cirugía, incluida la loción depilatoria, el yodo, el etanol al 70%, los hisopos de algodón, las gotas para los ojos, las suturas y la gasa. Prepare una hoja de cirugía y complete la información necesaria.

Pesar al ratón antes de la cirugía y registrar el peso. Después de anestesiar al ratón, administre analgésicos preoperatorios y retire el pelo del abdomen con crema depilatoria o una navaja. Esterilizar el abdomen frotándolo tres veces con povidona yodada y etanol al 70%.

Cree un campo estéril alrededor del abdomen con gasa estéril y drapeado. Haga una incisión en la línea media de la piel abdominal mientras levanta la piel con pinzas para evitar cortar el músculo. A continuación, levanta el músculo y córtalo teniendo cuidado de evitar cortar órganos vitales.

Tire con cuidado de los cuernos uterinos fuera del dique con pinzas anilladas y colóquelos suavemente sobre el campo estéril, asegurándose de que estén apoyados con almohadillas y no se alejen demasiado del dique. Mantenga el cuerno uterino humedecido durante el resto de la cirugía con el PBS estéril precalentado. Coloque un embrión con fórceps o dedos, luego inserte con cuidado la pipeta de vidrio tirada en la vertical lateral e inyecte de dos a tres microlitros en cada ventrículo insertando la pipeta en uno y luego en el otro ventrículo.

El ventrículo ha sido atacado con éxito si hay forma de media luna después de la inyección. Para transfectar células bilateralmente en la corteza frontal, coloque los dos electrodos negativos a los lados de la cabeza del embrión, justo lateral y ligeramente caudal a los ventrículos laterales, y coloque el electrodo positivo entre los ojos, justo delante del hocico en desarrollo. Asegúrese de que el embrión esté generosamente humedecido y aplique cuatro pulsos cuadrados.

Inyectar y electroporar todos los embriones, yendo uno por uno para que cada embrión sea electroporado inmediatamente después de la inyección de la solución de ADN. Una vez que todos los embriones hayan sido electroporados, inserte cuidadosamente los cuernos uterinos nuevamente en la cavidad abdominal. Cubra la cavidad abdominal con PBS estéril para ayudar a la colocación del cuerno uterino.

Llene la cavidad abdominal con PBS estéril para que no queden bolsas de aire una vez completada la sutura. Sutura el músculo con suturas reabsorbibles y la piel con suturas de seda no absorbibles. Deje que la presa se recupere completamente en una cámara calentada durante al menos una hora.

Revise las presas regularmente en las próximas 48 horas. A medida que la presa se recupera de la anestesia y recupera la conciencia, comenzará a moverse y a batir. Este método se utilizó para transfectar aproximadamente 5.000 neuronas piramidales de capa 2/3 con el plásmido pCAG-GFP.

La mayoría de estas células estaban localizadas en las regiones corticales frontales. Un ejemplo representativo muestra la distribución caudal rostral de las neuronas transfectadas en un ratón de control adulto, lo que confirma la capacidad de los IUE bilaterales para dirigirse y etiquetar genéticamente grandes poblaciones de neuronas piramidales en la corteza frontal. La primera parte de la tarea de interacción materna pone a prueba la capacidad de los ratones de control transfectados P18 para encontrar el lecho del nido.

Los ratones de control pasaron más tiempo explorando la ropa de cama de su nido que explorando la ropa de cama fresca, lo que sugiere que tienen intactas las habilidades motoras sensoriales y el comportamiento exploratorio. La segunda parte de la tarea aprovecha la tendencia de los ratones a estar motivados para interactuar con su madre. En esta tarea, los cachorros pasaban la mayor parte de su tiempo cerca de su madre mientras pasaban significativamente menos tiempo explorando la taza vacía o la ropa de cama del nido.

Los ratones de control adultos pasaron aproximadamente el 35% del tiempo explorando un objeto nuevo. Cuando se les presentaba una novela y un objeto familiar, los ratones adultos pasaban más tiempo explorando el objeto novedoso. En la tarea de sociabilidad, los ratones adultos de control pasaron cantidades similares de tiempo explorando un ratón nuevo y una taza vacía.

Este comportamiento se rastreó automáticamente con el software DeepLabCut etiquetando varios puntos en un mouse, incluidas las extremidades, el centroide, la cabeza y las orejas. El software también se utilizó para determinar cuándo se estaban criando los ratones mediante el examen de la longitud del cuerpo del ratón, ya que esta distancia se acorta cuando el ratón se encabrita. Siguiendo este procedimiento, se pueden responder muchas preguntas moleculares celulares examinando el tejido y ensayando diferentes medidas, como la densidad de la columna vertebral o los niveles de expresión de varias proteínas.