Caracterización de células inmunes y mediadores proinflamatorios en el ambiente pulmonar

Este protocolo se puede utilizar para investigar las alteraciones en el entorno pulmonar después de un accidente cerebrovascular isquémico. Este método permite la identificación de 13 tipos de células inmunitarias pulmonares y 13 citocinas y quimiocinas diferentes en el mismo ratón mediante análisis de citometría de flujo. Este método se ha utilizado para evaluar las alteraciones en el ambiente pulmonar después de un accidente cerebrovascular isquémico.

Sin embargo, también puede servir para investigar cambios durante una respuesta alérgica o infección. Para realizar la perfusión transcárdica de cuerpo entero, confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesiado y asegure el ratón a una plataforma quirúrgica. Humedece el pelaje con etanol al 70% para reducir la distribución del pelaje en la cavidad corporal y haz una incisión vertical en la piel de la línea media para exponer el peritoneo intacto, deteniendo la incisión tan pronto como se haya alcanzado la cavidad torácica.

Use tijeras de disección finas para hacer una incisión en la línea media del peritoneo, deteniéndose en la cavidad torácica antes y use fórceps para agarrar el extremo distal del esternón. Use las tijeras para cortar el diafragma sin dañar el corazón, los pulmones o la vasculatura. Cuando los tejidos subyacentes sean visibles, haga una incisión a través de la caja torácica y asegure los lados de las costillas para que el corazón y los pulmones queden completamente expuestos.

Realice con cuidado una pequeña incisión en la aurícula derecha, cerca del arco aórtico, para que sirva como salida para la perfusión, e inserte rápida pero suavemente una aguja de calibre 25 en la superficie superior distal del ventrículo izquierdo. Una vez que la aguja esté en su lugar, enjuague suavemente 10 mililitros de PBS frío en el corazón. El tejido debe comenzar a limpiarse de sangre.

Cuando se haya entregado todo el volumen, perfunde una segunda alícuota de 10 mililitros de PBS frío hasta que el hígado exhiba una apariencia marrón claro y los pulmones hayan pasado de un color rosa rojizo a un color mayormente blanco. Con fórceps y tijeras de disección finas, retire con cuidado todos los tejidos circundantes antes de separar los lóbulos pulmonares y colocarlos en una placa de Petri que contenga de uno a dos mililitros de células pulmonares frías, medio en hielo. Para preparar el tejido pulmonar para las matrices de perlas multiplexadas, agregue 200 microlitros de tampón de homogeneización en frío a un tubo de dos mililitros que contenga tres perlas estériles de zirconia/sílice de 2,3 mililitros, y pese el lóbulo pulmonar de interés.

Transfiera de 50 a 100 miligramos de tejido pulmonar al tubo preenfriado de perlas y tampón de homogeneización y homogeneice el lóbulo utilizando un homogeneizador basado en perlas a 4.000 rotaciones por minuto durante al menos dos minutos. Cuando el tejido se haya homogeneizado por completo, centrifugar el tubo para sedimentar el tejido y transferir el sobrenadante a un microtubo preenfriado de 1,5 mililitros en hielo. Para la disociación del tejido pulmonar, decantar cuidadosamente el medio de células pulmonares del lóbulo pulmonar restante e insertar una aguja de calibre 25 en el tejido.

Inyecte de 200 a 250 microlitros de tampón de disociación en cada lóbulo pulmonar para inflar los pulmones hasta que cada uno de los lóbulos se haya inyectado dos o tres veces. Después de una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, use tijeras de disección fina para picar los pulmones en trozos pequeños y transfiera la solución de tejido a un tubo de crónica de 15 mililitros. Agregue seis mililitros de tampón de disociación adicional a la muestra y haga vórtice vigorosamente durante un minuto.

A continuación, incube las piezas de tejido durante 45 minutos a 37 grados centígrados en un vórtice cada siete u ocho minutos. Al final de la incubación, agite la muestra vigorosamente durante un minuto y pase la muestra a través de un filtro de células de 100 micras para eliminar cualquier tejido conectivo e intersticial residual no deseado. Recoja el tejido por centrifugación y vuelva a suspender al pellet con cinco mililitros de medio de pulmón frío.

Centrifugar la muestra de nuevo y resuspender el pellet en un mililitro de medio de pulmón frío con un suave vórtice. Luego, filtre las células a través de un colador de 100 micras antes de contar. Para evaluar las poblaciones de células inmunitarias dentro del tejido pulmonar aislado, siembre uno o dos veces 10 por el sexto anticuerpo de las células de potencia en el número apropiado de pocillos con una placa inferior redonda de 96 pocillos y disponga las células al fondo de la placa por centrifugación.

Agregue 25 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado en tampón FACS frío a cada pocillo y mezcle con suaves caricias en pipa. Después de 20 minutos, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de tampón FACS frío por pocillo y transfiera las muestras a tubos individuales de poliestireno de cinco mililitros con fondo redondo que contengan 150 microlitros de tampón FACS adicional por tubo. Luego, analice inmediatamente las muestras en un citómetro de flujo de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de citometría de flujo.

En este análisis representativo, se identificaron 13 poblaciones diferentes de células inmunitarias en los pulmones utilizando tres conjuntos de cinco a siete combinaciones de anticuerpos. Las células muertas se excluyeron mediante una tinción de muertos vivos y los diferentes tipos de células inmunitarias se distinguieron mediante los anticuerpos y marcadores enumerados en la tabla. En el primer grupo se identificaron macrófagos alveolares e intersticiales, células dendríticas CD103 y CD11B positivas y eosinófilos.

Se identificaron monocitos y neutrófilos proinflamatorios en el grupo dos y se identificaron linfocitos T CD4 positivos y CD8 positivos, linfocitos B, linfocitos plasmocitoides, linfocitos NK y linfocitos NKT en el tercer grupo. El número total de células viables, el porcentaje de células CD45 positivas y el número total de células CD45 positivas obtenidas fueron similares entre las poblaciones celulares que se aislaron según lo demostrado y las poblaciones celulares que se aislaron utilizando un disociador de tejidos disponible comercialmente. Además, el porcentaje de muerte celular entre las células CD45 positivas fue inferior al 10% para ambos protocolos, lo que sugiere que el protocolo demostrado facilita una recuperación celular de alto rendimiento y alta calidad sin la ayuda de un disociador de tejidos automatizado.

Además, el uso de un ensayo múltiplex disponible en el mercado junto con un análisis de citometría de flujo permite determinar la concentración de quimiocina en cada muestra por miligramo de tejido. La concentración de colagenasa D, el tiempo de incubación y la temperatura utilizados durante el aislamiento de una sola célula tienen un impacto crítico en la recuperación de las células inmunitarias.