Biofuncionalización de Nanomateriales Magnéticos
16 de julio de 2020
En este trabajo, proporcionamos un protocolo para biofuncionalizar nanomateriales magnéticos con anticuerpos para la diana celular específica. Como ejemplos, utilizamos nanocables de hierro para atacar las células cancerosas.
La característica clave de este protocolo es que se puede aplicar en una amplia gama de nanomateriales de óxido de hierro y hierro. Además, se puede aplicar en nanomateriales multisegmentados, como nanocables de hierro y oro. Este protocolo se puede realizar de forma segura en cualquier laboratorio biológico estándar.
Las principales ventajas de esta técnica de biofuncionalización es la capacidad de producir un nanomaterial específicamente dirigido basado en un fuerte enlace covalente entre el nanocable y los anticuerpos. Comience cortando los discos de aluminio en pedazos pequeños con una cuchilla de un solo filo y un martillo pequeño. Coloque las piezas cortadas en un tubo de dos mililitros y llénelo con un mililitro de hidróxido de sodio de un molar, asegurándose de que todas las piezas de aluminio estén cubiertas.
Deje el tubo a temperatura ambiente en una campana de gases químicos durante 30 minutos. Después de la incubación, retire las piezas de aluminio con una pinza y mantenga los nanocables liberados en hidróxido de sodio durante 30 minutos más. Coloque el tubo en una rejilla magnética para secado, espere dos minutos y reemplace la solución con hidróxido de sodio fresco.
Sonicar el tubo de dos mililitros con los nanocables durante 30 segundos y dejarlo durante una hora dentro de una campana de gases químicos. Repita este paso al menos cuatro veces. Cuando termine, coloque el tubo de dos mililitros en la rejilla magnética, deseche el hidróxido de sodio y reemplácelo con un mililitro de etanol absoluto.
Sonicar los nanocables durante 30 segundos, colocar el tubo en la rejilla magnética y reemplazar el etanol. Repita el lavado con etanol al menos cuatro veces. Después de lavar los nanocables, transfiéralos a un tubo de vidrio de cinco mililitros con una pipeta de un mililitro.
Agregue 100 microlitros de APTES a la solución de nanocables y agite el tubo de vidrio durante 20 segundos. Coloque el tubo en un baño ultrasónico y sonicélo durante una hora. Luego saque el tubo de la bañera y agregue 400 microlitros de agua desionizada y 20 microlitros de hidróxido de sodio de un molar.
Repita la sonicación de una hora. Después de sacar el tubo de vidrio del baño ultrasónico, colóquelo junto a un imán para recoger los nanocables. Sustituya el sobrenadante por un mililitro de etanol absoluto fresco y sonique el tubo durante 10 segundos.
Repita el lavado con etanol y la sonicación dos veces. Disuelva 0,4 miligramos de EDC y 1,1 miligramos de Sulfo-NHS y un mililitro de MES en un tubo de dos mililitros. En otro tubo de dos mililitros, agregue 960 microlitros de PBS 0.1 molar y agregue 30 microlitros de anticuerpo anti-CD44.
A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla EDC/Sulfo-NHS previamente preparada a este tubo. Coloque el tubo de anticuerpos en un agitador y agítelo a 10 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, coloque un imán junto al tubo con los nanocables recubiertos de APTES durante dos minutos, deseche el etanol y reemplácelo con PBS.
Sonicar los nanocables durante 10 segundos. Después del último lavado con PBS, recoja los nanocables y transfiera la solución de anticuerpos activados al tubo de los nanocables. A continuación, sónigalo durante 10 segundos.
Vuelva a colocar el tubo en el rotador durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, recoja los nanocables con el imán y deseche el sobrenadante. Agregue un mililitro de 2%BSA e incube el tubo durante una hora a cuatro grados centígrados para bloquear la reacción.
La espectroscopia de pérdida de energía electrónica o los mapas EELS se pueden utilizar para visualizar los átomos de silicio en la superficie del nanocable y confirmar la presencia del recubrimiento APTES. En los nanocables no recubiertos, los átomos de hierro aparecen en azul oscuro y los átomos mezclados de hierro y oxígeno son de color azul claro. El mapeo EELS correspondiente de nanocables no recubiertos muestra una mayor intensidad de hierro frente al oxígeno en el centro que en la superficie, lo que indica una estructura de óxido de hierro-hierro.
El mapeo demostró que la capa de óxido de hierro consta de más óxido de hierro (II, III) que óxido de hierro (III). La antigenicidad de los anticuerpos adheridos se confirmó mediante los ensayos de inmunoprecipitación y Western blot. Se utilizó el ensayo BCA para cuantificar el número de anticuerpos en los nanocables.
Se utilizó la medición del potencial zeta para dilucidar la funcionalización de la superficie. El grupo amina terminal de APTES redujo la carga negativa en comparación con los nanocables no recubiertos. La funcionalización de anticuerpos redujo aún más la carga.
El objetivo celular específico de los nanocables funcionalizados con anticuerpos se confirmó mediante microscopía confocal. Las figuras A y B representan las imágenes de microscopía de campo claro de los especímenes C y D, respectivamente. El color rojo corresponde a la representación de la membrana celular, el azul representa el núcleo y los grupos verdes representan la presencia de nanocables CD44 unidos y dirigidos.
Además, se utilizó el ensayo de viabilidad celular para verificar que los nanocables no recubiertos, recubiertos de APTES y recubiertos de anticuerpos eran biocompatibles. En el recubrimiento del proceso APTES, es muy importante agregar el agua desionizada antes de la solución de hidróxido de sodio para mejorar la unión entre la molécula APTES y los nanocables. Además, durante el proceso de biofuncionalización, es necesario lavar el nanocable con tampón PBS un par de veces para mejorar el enlace covalente entre el anticuerpo y los nanocables.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para la biofuncionalización de nanomateriales magnéticos con anticuerpos con el fin de lograr un direccionamiento celular específico, utilizando particularmente nanocables de hierro para dirigirse a células cancerosas.
Componentes clave del estudio
Área de la Ciencia
- Nanotecnología
- Biomateriales
- Biología celular
Antecedentes
- Los nanomateriales magnéticos tienen aplicaciones potenciales en la administración dirigida de fármacos.
- La biofuncionalización mejora la especificidad de los nanomateriales para tipos celulares particulares.
- Los nanocables de hierro pueden modificarse para mejorar sus capacidades de direccionamiento.
- Comprender la interacción entre los nanomateriales y los sistemas biológicos es crucial para su aplicación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para la biofuncionalización de nanocables de hierro.
- Demostrar la eficacia de los nanocables funcionalizados con anticuerpos en el direccionamiento de células cancerosas.
- Evaluar la biocompatibilidad de los nanocables modificados.
Métodos Utilizados
- Preparación de nanocables de hierro mediante procesos químicos.
- Recubrimiento de nanocables con APTES para facilitar la unión de anticuerpos.
- Uso de EDC/Sulfo-NHS para activar anticuerpos.
- Caracterización de nanocables mediante espectroscopía de pérdida de energía de electrones y mediciones de potencial zeta.
Resultados principales
- El protocolo produjo con éxito nanocables de hierro funcionalizados con anticuerpos.
- La microscopía confocal confirmó la localización específica de células cancerosas por medio de los nanocables modificados.
- Los ensayos de biocompatibilidad indicaron que los nanocables eran seguros para aplicaciones celulares.
- La funcionalización de la superficie se validó mediante diversas técnicas de caracterización.
Conclusiones
- Esta técnica de biofuncionalización permite la administración dirigida de agentes terapéuticos.
- El protocolo puede adaptarse para diversos tipos de nanomateriales.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir terapias contra el cáncer dirigidas utilizando estos nanocables.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la producción de nanomateriales magnéticos específicamente dirigidos mediante la unión covalente de anticuerpos, lo que favorece el desarrollo de terapéuticas y diagnósticos de precisión. Al mejorar la especificidad del blanco y permitir el control magnético a distancia, el método contribuye a la reducción de riesgos mecanicistas en programas oncológicos de fase inicial. El enfoque mejora la confianza predictiva en las intervenciones basadas en nanomateriales al validar tanto la eficiencia de direccionamiento como la biocompatibilidad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el direccionamiento específico de marcadores de superficie celular, como la sobreexpresión de CD44 en células cancerosas.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al confirmar la antigenicidad de los anticuerpos unidos mediante inmunoprecipitación y western blot.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al demostrar direccionamiento específico y biocompatibilidad en modelos celulares pertinentes.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Produce sistemas biológicos validados listos para flujos de trabajo posteriores, con funcionalización de superficie confirmada mediante mediciones de potencial zeta y espectroscopía de pérdida de energía de electrones (EELS).
- Valor operativo: Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante pasos controlados de enlazado covalente y bloqueo utilizando albúmina sérica bovina (BSA).
- Valor de escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en nanomateriales de hierro-óxido de hierro y en estructuras segmentadas múltiples, incluyendo nanocables de hierro-oro.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Demuestra continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento por microscopía confocal y ensayos de viabilidad celular.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al verificar la biocompatibilidad de los nanomateriales sin recubrimiento, recubiertos con APTES y recubiertos con anticuerpos.
- Reducción del riesgo mecanicista: Disminuye la ambigüedad en los mecanismos de direccionamiento al vincular la unión del anticuerpo con la unión específica a células observada en las imágenes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos, permitiendo la evaluación confiable de compuestos mediante nanomateriales cuantificables y magnéticamente responsivos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la administración específica a células cancerosas positivas para CD44.
- Selección: Proporciona preparación para ensayos y resultados cuantitativos mediante cambios en el potencial zeta y la modificación superficial confirmada por EELS.
- Análisis: Ofrece lecturas mensurables, como la cantidad de anticuerpos mediante el ensayo BCA y la absorción celular mediante microscopía confocal.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la biocompatibilidad demostrada y la administración específica en modelos celulares.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para generar nanomateriales dirigidos en múltiples proyectos y formatos de nanomateriales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en las interacciones entre nanomateriales y células.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la biofuncionalización en diferentes entornos de laboratorio.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo de nanoterapéuticos.
- Impacto en la cartera: Priorización y decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en perfiles validados de dirigimiento y seguridad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de nanomateriales, conjugación de anticuerpos y técnicas de caracterización de superficies.
- Depende del acceso a baños ultrasónicos, soportes magnéticos e instrumentación para análisis de EELS, potencial zeta y blotting occidental.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de lavado, bloqueo e incubación para garantizar la consistencia entre lotes.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes formas, composiciones o químicas superficiales de nanomateriales.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de una secuenciación cuidadosa de reactivos (por ejemplo, agua desionizada antes de hidróxido de sodio) para mejorar la unión de APTES.
