Name: Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a investigar la motilidad bacteriana impulsada por flagelos en Escherichia coli mediante tres técnicas establecidas. Este método sistemático permite analizar la motilidad individual y colectiva con aplicaciones en patógenos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención GM118085 de los Institutos Nacionales de Salud y en parte por la Fundación Robert Welch (subvención F-1811 a R.M.H.).

1. Aislamiento de mutantes supresores en cepas deficientes en motilidad
Nota : utilice este método como un amplio 'catch-all' para identificar la naturaleza general del defecto de motilidad.
<ol><li>Preparación de placas de agar blando NOTA: El agar blando, también conocido como motilidad o agar nadador, es un agar de bajo porcentaje (~ 0.2-0.35% p / v), utilizado durante mucho tiempo para ensayar quimiotaxis31,32.<ol>
<li>Añadir 3 g de bacto-agar (0,3% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O (agua doble destilada) al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Dejar enfriar con agitación suave usando la varilla / placa como arriba. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 50 °C, vierta 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), y deje que el agar fundido se ajuste con la tapa en su lugar durante al menos 1 h, para su uso dentro de 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de cultivo, inoculación y aislamiento de mutantes supresores NOTA: E. coli inoculada en el centro de medios ricos en nutrientes solidificados con agar blando consumen nutrientes localmente, creando un gradiente de nutrientes que siguen. A medida que se mueven hacia el exterior, aparecen "anillos" definidos (Figura 1A), que están relacionados con quimioatrayentes específicos a los que responden las bacterias. Los defectos en el sistema de quimiotaxis o los componentes estructurales del motor de flagelos pueden comprometer el rendimiento en este ensayo. A menudo, los mutantes con una ventaja de motilidad surgen durante el cribado, y se pueden ver emergiendo de puntos únicos o múltiples a lo largo de la periferia del anillo, desde donde 'estallan' hacia fuera (Figura 1C). Uno notará que el borde más externo del frente de natación contrasta fácilmente con el agar suave virgen no colonizado.<ol>
<li>Cultivar durante la noche cultivos de la cepa deficiente en motilidad deseada en 5 mL de Caldo Lennox (LB; 10 g/L triptona, 5 g/L de extracto de levadura, y 5 g/L de NaCl, Tabla de Materiales)a 30 °C con agitación horizontal (220 r.p.m.). Al día siguiente, sub-cultivo (dilución 1:100) en LB fresco, creciendo en las mismas condiciones a fase exponencial (OD600 de 0,6).</li>
		<li>Inocular 6 μL del cultivo en el centro de una placa de agar blando (1.1) usando una pipeta, empujando la punta estéril cargada en el agar para expulsar suavemente el contenido. Transferir a 30 °C e incubar (Figura 1B), hasta que la motilidad 'brotes' son evidentes, emanando del punto de inoculación o de la periferia de los anillos de motilidad, típicamente en 24-36 h (Figura 1C). NOTA: En ensayos de motilidad, inocular una cepa de tipo salvaje junto con los aislados mutantes para la comparación. Esta cepa de tipo salvaje mostrará los anillos quimiotácticos concéntricos característicos(Figura 1A)y llenará la placa dentro de 8-10 h.</li>
		<li>Use un lazo de alambre estéril para levantar las células de la región de "llamarada" y la raya para purificar colonias individuales en una placa de agar duro LB (LB preparado como el anterior, solidificado con 15 g / L bacto-agar).</li>
		<li>Recoger colonias individuales de la placa de raya utilizando un bucle de alambre estéril y volver a purificar por rayas para colonias individuales para asegurar el aislamiento de un aislado de colonia "pura".</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmación, y caracterización de mutantes supresores
	<ol>
<li>Confirme que los mutantes supresores aislados han restaurado la motilidad. Preparar placas de agar blando (1.1) y cultivos para cepas de interés (como en 1.2.1), incluyendo el tipo salvaje y la cepa inicial "deficiente en motilidad" para la comparación.</li>
		<li>Inocular las placas (como en 1.2.2) e incubar a 30 °C durante 8-10 h.</li>
		<li>Registre el diámetro del anillo más externo (borde del círculo) y compare para establecer cuál de los aislados ha restaurado sustancialmente la motilidad. NOTA: Se recomienda que las placas sean fotografiadas a lo largo del tiempo-curso del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice un dispositivo de "cubo de luz"30,donde se monta una cámara digital sobre una fuente de luz para una mejor iluminación para medir el diámetro de la colonia de natación y distinguirla del agar no colonizado.</li>
		<li>El tema verificó aislantes a WGS según lo requerido, permitiendo suficiente " cobertura de la secuencia" para identificar positivamente las mutaciones que restauraron el salvaje-tipo función.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cuantificación del comportamiento motor de los flagelos a través del atado celular
Nota : utilice este método cuando el comportamiento normal de correr-caída (quimiotaxis) parece estar comprometido.
<ol><li>
Preparación del cultivo y esquila de flagelos
	<ol>
<li>Preparar un cultivo de fase exponencial de la cepa de interés como se describe en el paso 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 mL de células por centrifugación a 2.000 x g durante 3 min antes de resuspender en 10 mL de Tampón de Motilidad esterilizado por filtro (MB; tampón de fosfato de potasio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4,0,0065 M KH2PO4,pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOTA: MB apoya la motilidad, pero no apoya el crecimiento bacteriano</li>
		<li>Repetir el paso 2.1.2 dos veces más antes de volver a gastar el pellet final en 1 mL de MB.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a una jeringa de 1 ml y coloque una aguja de 23G al extremo. Monte un aparato idéntico de jeringa/aguja y coloque los dos juntos a través de 6 pulgadas de tubo de polietileno (diámetro interior de 0,58 mm) firmemente envainado sobre cada punta de aguja.</li>
		<li>Esquile los flagelos (son frágiles y se rompen fácilmente) pasando suavemente la suspensión celular de un lado a otro de una jeringa a la otra 50x, con 1 min de pausa entre cada 10 pasadas.</li>
		<li>Centrifugar las células cizalladas a 2.000 x g durante 3 min y resuspend en un volumen final de 500 μL de MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de diapositivas y atado celular
	<ol>
<li>Prepare una cámara de fijación celular apilando una cubierta de 18 mm x 18 mm sobre una corredera de microscopio de vidrio de 3 pulgadas x 1 pulgada x 1 mm, separada por cinta adhesiva de doble cara (Figura S1).</li>
		<li>Enjuague la cámara con solución de poli-lisina al 0,01% (p/v) aplicándola en la parte superior de la cámara. Incline el borde inferior (el cubrebocas al ras con la corredera del microscopio) sobre un limpiaparabrisas de tarea (papel tisú) para ayudar a dibujar la solución a través de la cámara (Figura S1). Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Lavar la cámara tres veces con 40 μL de MB utilizando como se describe en el paso 2.2.2</li>
		<li>Añadir 40 μL de la suspensión de células cizalladas (preparada arriba) en la parte superior de la cámara e incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que las células se adhieran al cubrebocas.</li>
		<li>Enjuague suavemente la cámara con 40 μL de MB como en 2.2.3 para eliminar las células no unidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registro y cuantificación de la rotación celular
	<ol>
<li>Transfiera el portaobjetos del microscopio cargado con células atados a la etapa del microscopio.</li>
		<li>Usando microscopía de contraste de fase y un objetivo de 100x, escanee la población en busca de células que estén fijas en su lugar, y gire en un solo eje, es decir, rotaciones suaves en un punto fijo en lugar de presentarse en un ángulo en el que la célula se mueva dentro y fuera del enfoque (Video 1).</li>
		<li>Utilice un microscopio comercial y una cámara asociada. Abra el software asociado, asegúrese de que las celdas de interés estén enfocadas y haga clic en adquisición de video para grabar la rotación de celdas durante un minuto (a 10 cuadros por segundo o más).</li>
		<li>A partir de la reproducción de vídeo, cuantifique el número de rotaciones completas por minuto y el número de veces que la celda cambia de dirección (frecuencia de conmutación). NOTA: Las velocidades de rotación y la frecuencia de conmutación pueden ser demasiado rápidas para medir a simple vista, por lo que se recomienda utilizar un software de vídeo que ofrezca una reproducción lenta/fina, o que adopte un sistema de software automatizado para cuantificar los patrones de rotación33. Una alternativa sería aumentar la viscosidad del MB usando metilcelulosa (o agente similar) para ayudar a ralentizar y resolver la rotación de bacterias más rápidas o compensar cuando se utilizan cámaras con bajas tasas de fotogramas.</li>
		<li>Repita el paso 2.3.2 con réplicas biológicas para compilar una representación de la población de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación de enjambres en un ensayo de cruce de fronteras
NOTA: Utilice este método para evaluar el impacto de una mutación o condición en la motilidad del grupo. Enjambre-agar se refiere al agar donde el porcentaje es típicamente más alto que el del agar blando. En el agar blando (0,3 %), las células nadan individualmente dentro del agar. En el agar enjambre (0,5% y más), las células se mueven como un grupo en la superficie. Mientras que las placas de enjambre deben usarse como se detalla aquí, las placas de natación tienen una vida útil más larga y se pueden usar durante varios días. Nuestra preferencia personal es utilizar en 1-2 días.
<ol><li>
Preparación del agar enjambre
	<ol>
<li>Añadir 5 g de agar Eiken (0,5% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deje enfriar con una agitación suave para evitar cualquier burbuja de aire usando la varilla / placa como se indicó anteriormente. Cuando sea aproximadamente 50 °C, añadir glucosa esterilizada por filtro para una concentración final del 0,5 %.</li>
		<li>Verter 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm) y dejar fijar a temperatura ambiente durante al menos 14 h y no más de 20 h. No almacenar para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculación e incubación de placas de enjambre
	<ol>
<li>Inocular 6 μL de un cultivo exponencial medio (preparado como en 1.2) manchando en la parte superior del agar.</li>
		<li>Deje la tapa apagada durante 5-10 minutos y reemplácela cuando el inóculo se haya secado en la superficie del agar.</li>
		<li>Incubar a 30 °C durante 8 h. Evite la tentación de inspeccionar el progreso del enjambre quitando la tapa, ya que esto contribuirá al secado del agar y perjudicará el enjambre. NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del fenotipo de la cepa. Algunas mutaciones aisladas pueden dificultar la capacidad de enjambre y requerirán un porcentaje reducido de agar o un período más prolongado de incubación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de placas de ensayo para cruzar la frontera NOTA: Este ensayo utiliza una placa de Petri modificada, donde una división plástica (borde) crea dos cámaras, en lugar de una(Figura 2A). Cada cámara se puede preparar independientemente de la otra, ofreciendo diferentes condiciones para el enjambre, antes de 'conectar' los dos. Dependiendo del diseño experimental, la primera cámara (designada a la izquierda) se puede preparar con agar de baño (0.3% p/v) o agar de enjambre (0.5% p/v) desde donde las bacterias pueden migrar a través de la frontera hacia la cámara derecha que contiene agar enjambre +/- cualquier suplemento o desafío requerido (por ejemplo, antibióticos). La migración en cualquiera de los agares se mide/compara típicamente registrando el diámetro más ancho de la colonización bacteriana (de borde a borde) desde el punto original de inoculación.<ol>
<li>Prepare el agar para nadar como se describe en 1.1 si es necesario.</li>
		<li>Preparar el agar enjambre como se describe en 3.1.</li>
		<li>Verter ~ 30 mL de agar enjambre (con la suplementación deseada si es necesario) en la cámara derecha de una placa de Petri de doble compartimento (100 mm x 15 mm), hasta el punto en que esté nivelado con el divisor de plástico entre las cámaras, pero no desbordando hacia la izquierda (Figura 2B).</li>
		<li>Después de que el agar se haya endurecido, llene la cámara izquierda con ~ 30 mL de agar de baño o enjambre, de nuevo hasta el punto de contacto con la división de plástico (Figura 2C). Antes de que se establezca, utilice una punta de pipeta estéril para arrastrar suavemente el agar sobre el borde para conectar los dos lados con un puente de agar de ~ 1 mm de altura que abarca toda la longitud de la división (Figura 2D).</li>
		<li>Dejar secar la placa a temperatura ambiente (3.1). NOTA: Un método alternativo de creación de puente es permitir que el agar de la cámara izquierda se seque y luego pipetee lentamente ~ 100 μL de agar enjambre fundido a lo largo del divisor de plástico para unir las dos cámaras (3.4). Inocular las placas en la cámara izquierda como se detalla anteriormente para nadar (1.2.2) o enjambre (3.2) agar, antes de incubar a 30 °C durante 12-16 h, o hasta que los enjambres hayan progresado lo suficiente sobre la cámara derecha para permitir comparaciones entre cepas de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El aislamiento y caracterización de mutaciones supresoras han contribuido con éxito a identificar componentes clave del sistema de quimiotaxis35,36,37,así como la propia maquinaria motora38,39,40. Durante el uso del Protocolo 1, es importante incluir múltiples réplicas independientes para asegurar el aislamiento de un amplio espectro de...

Las bacterias emplean muchos apéndices para el movimiento y la dispersión en sus nichos ecológicos1. La motilidad impulsada por flagelos es la más rápida de ellas, promoviendo la colonización de localizaciones favorables en respuesta a las señales ambientales, y contribuyendo significativamente a la capacidad patógena de algunas especies2,3. Las bacterias flageladas pueden nadar individualmente en líquido a granel, o enjambre como un colectivo sobre una superficie semisó sólida4. Los flagelos extracelulares se unen y son accionados por motores rotativos incrustados en la membrana, que aprovechan la potencia de los gradientes iónicos para generar un par que provocala rotación 1,2,4,5,6,7,8. En E. coli,cuyos motores funcionan a un par constantede 9,la salida del motor se puede clasificar en términos de velocidad de rotación y conmutación del rotor entre las direcciones en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) y en el sentido de las agujas del reloj (CW). La rotación CCW promueve la formación de un haz flagelar coherente que impulsa la célula hacia adelante (run), mientras que un interruptor transitorio en dirección rotacional (CW) hace que el haz se desmonte parcial o totalmente10,y la célula reoriente su dirección de natación (caída). E. coli típicamente corre por un segundo y cae por una décima de segundo. La frecuencia de conmutación del rotor o 'sesgo de caída' es controlada por el sistema de señalización quimiotaxis, en el que los quimiorreceptores transmembrana detectan señales químicas externas y las transmiten a través de fosforelay al motor flagelar para extender las corridas en respuesta a los atrayentes, o suprimirlas en respuesta a productos químicos tóxicos11,12. La motilidad de natación se ensaya en agar blando al 0,3%.
Durante el enjambre, las bacterias navegan en una superficie semisólida como un colectivo denso, donde los paquetes de bacterias fluyen en un movimiento continuo de remolino2,13,14,15. Los enjambres de E. coli exhiben fisiología quimiosensorial alterada (menor sesgo de caída), velocidades más altas y mayor tolerancia a los antimicrobianos sobre las células que nadan en líquido a granel16,17. Los enjambres varían en su despliegue de una gran cantidad de estrategias que ayudan al movimiento, incluyendo la producción de surfactante, hiperflagelación y elongación celular2. El enjambre ofrece a las bacterias una ventaja competitiva tanto en entornos ecológicos como clínicos18,19,20. Hay dos categorías de bacterias de enjambre: enjambres templados, que pueden enjambre sólo en medios solidificados con 0,5-0,8% de agar, y enjambres robustos, que pueden navegar a través de concentraciones de agar más altas21.
Existe una variedad de ensayos para interrogar la motilidad de la natación y su regulación. Cuando se ve afectada por mutaciones o condiciones ambientales, la motilidad en sí misma ofrece una fuerte selección para identificar mutaciones supresoras de ganancia de función. Estos supresores pueden ser revertientes genuinos de la mutación original, o pseudo-revertores, donde una segunda mutación restaura la funcionalidad. Tales mutantes pueden ser identificados por secuenciación del genoma completo (WGS). Una alternativa a la selección imparcial del supresor es una estrategia sesgada de la mutagénesis apuntada (e.g., mutagénesis de la polimerización en cadena). Estas metodologías a menudo arrojan luz sobre la función o la regulación ambiental del aparato de motilidad. Si el objetivo es estudiar la función motora, entonces la restauración de la motilidad de tipo salvaje medida en agar blando puede no indicar necesariamente la restauración de la salida del motor de tipo salvaje. El ensayo de atado celular, en el que las células se unen a una superficie de vidrio por un solo flagelo y la rotación del cuerpo celular se supervisa posteriormente, puede ser el ensayo inicial de elección para evaluar el comportamiento motor. Aunque ahora se dispone de metodologías más sofisticadas para supervisar las propiedades del motor, la configuración requerida de la cámara de alta velocidad y la aplicación de paquetes de software para el análisis de movimiento limitan su uso generalizado22,23,24,25. El ensayo de atado celular requiere solo que los flagelos estén cortados, lo que permite la unión de los filamentos cortos a un portaobjetos de vidrio, seguido de grabar en video la rotación del cuerpo celular. Aunque las velocidades registradas del motor sean bajas en este ensayo debido a la alta carga que el cuerpo celular ejerce sobre el flagelo, este ensayo ha contribuido sin embargo a información valiosa sobre las respuestas quimiotácticas26,27,28,29,y sigue siendo una herramienta de investigación válida como se discute a continuación.
La motilidad del enjambre plantea un conjunto diferente de desafíos a los investigadores. La selección de supresores de ganancia de función sólo funciona en enjambres que producen tensioactivos copiosos y enjambres fácilmente13. Los no productores de surfactantes como E. coli son exigentes con respecto a la elección del agar, la composición de los medios y la humedad del ambiente2,13,14,21. Una vez que se establecen las condiciones de enjambre, el ensayo de cruce de fronteras17 es una metodología útil para interrogar la capacidad de un enjambre para navegar por condiciones nuevas / duras. Aunque los protocolos presentados a continuación se relacionan con E. coli,pueden ser fácilmente adaptados para su aplicación en otras especies.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></fuerte></td>Bacto Agar deshidratado Fisher Scientific DF0140-15-4 EDTA Sal disódica, dihidratada Fisher Scientific 02-002-786 Agar Eiken Eiken Chemical Co. Japón E-MJ00 Esencial para el enjambre de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>E. coli</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Glucosa D (+)Fisher Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>410955000</tr><tr><td>LB (Lennox) Caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Materials and Equipment</td>CellSense software de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagen para microscopio (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>O software equivalente para microscopio usado</td></tr><tr><td>Electrónica Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio esmerilados 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus BX53</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Se puede utilizar cualquier microscopio de fase vertical o invertida</td></tr><tr><td>Placas de Petri (100 mm de diámetro)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Para ensayos de agar blando</td></tr><tr><td>Nebulizador de polietileno Tubo capilar (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>9908265</tr><tr><td>Placa de Petri redonda con 2 compartimentos</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>Para ensayos de cruce de fronteras</td></tr><tr><td>Agujas hipodérmicas de seguridad (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A Jeringa</td><td></td></tr><tr><td>estéril - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas para tareas/pañuelos</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>o equivalentes toallitas tisú de un solo uso</td></tr><tr><td>VWR micro cubierta de vidrio de 18x18 mm</td><td>Cámara VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>o cámara microscópica equivalente</td></tr></tbody></table>

investigación de la motilidad impulsada por flagelos en escherichia coli mediante la aplicación de tres técnicas establecidas en una serie

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

La motilidad es crucial para la supervivencia y el éxito de muchas especies bacterianas. Existen muchas metodologías para explotar la motilidad para comprender las vías de señalización, para dilucidar la función y el ensamblaje de las partes flagelares, y para examinar y comprender los patrones de movimiento. Aquí demostramos una combinación de tres de estas metodologías. La motilidad en el agar blando es la más antigua, ofreciendo una fuerte selección para aislar las mutaciones supresoras de ganancia de función en cepas con problemas de motilidad, donde la motilidad se restaura a través de una segunda mutación. La técnica de atado celular, empleada por primera vez para demostrar la naturaleza rotatoria del motor flagelar, se puede utilizar para evaluar el impacto de los efectores de señalización en la velocidad del motor y su capacidad para cambiar la dirección de rotación. El ensayo de "cruce de fronteras" es más reciente, donde las bacterias nadadoras se pueden preparar para la transición a moverse colectivamente como un enjambre. En combinación, estos protocolos representan un enfoque sistemático y poderoso para identificar los componentes de la maquinaria de motilidad, y para caracterizar su papel en diferentes facetas de la natación y el enjambre. Se pueden adaptar fácilmente para estudiar la motilidad en otras especies bacterianas.

El aislamiento de pseudo-revertores en una cepa de E. coli cuya motilidad se ve afectada por altos niveles de la molécula de señalización c-di-GMP, fue detallado en un trabajo reciente de nuestro laboratorio34. Esta cepa (JP1442) albergaba dos mutaciones: ΔyhjH y ΔycgR. YhjH es la fosfodiesterasa más activa que degrada c-di-GMP en E. coli. La ausencia de YhjH conduce a niveles elevados de c-di-GMP y a la inhibición de la motilidad. YcgR es un efector c-di-GMP. E...

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Los protocolos demostrados en este video pueden ser reproducidos en cualquier laboratorio del mundo. En combinación, representan un enfoque sistemático y poderoso para caracterizar la motilidad del flagelo bacteriano. La motilidad es un aspecto crucial de la diseminación y supervivencia bacteriana, y estos tres métodos son herramientas útiles y poderosas para el análisis de la motilidad tanto individual como colectiva.Las técnicas descritas aquí se pueden aplicar fácilmente para estudiar una variedad de bacterias, incluidas las clasificadas como patógenas en la naturaleza. Cuando intente este procedimiento por primera vez, tenga en cuenta que si las placas de enjambre se preparan incorrectamente, se puede observar un comportamiento inconsistente o patrones que imitan pero no reflejan realmente el movimiento colectivo. Cultivar durante la noche la cepa de deficiente de motilidad deseada en cinco mililitros de caldo Lennox a 30 grados centígrados con agitación horizontal, luego subcultivar en LB fresco en las mismas condiciones hasta la fase exponencial.Inocular seis microlitros del cultivo en el centro de una placa de agar blanda, empujando la punta de la pipeta cargada en el agar para expulsar suavemente el contenido. Incubar la placa a 30 grados centígrados hasta que se evidencien brotes de motilidad, que emanan del punto de inoculación o de la periferia de los anillos de motilidad. Use un bucle de alambre estéril para levantar las células de la región de la llamarada y colocarlas en una placa de agar duro LB para purificar colonias individuales.Para confirmar que los mutantes supresores aislados han restaurado la motilidad, cultíquelos en placas de agar blandas para obtener cepas de interés. Incluya el tipo salvaje y la cepa de motilidad deficiente inicial para comparar. Después de incubar las placas de cultivo a 30 grados centígrados durante ocho a 10 horas, registre el diámetro del anillo más externo para establecer cuáles de los aislados han restaurado sustancialmente la motilidad.Preparar una cultura de fase exponencial de la cepa de interés. A continuación, granule 10 mililitros de células por centrifugación a 2000 veces G durante tres minutos, y vuelva a suspenderlas en 10 mililitros de tampón de motilidad esterilizado por filtro, o MB. Lavar las células dos veces más en MB y resuspenderlas en un mililitro de MB después de la centrifugación final. Transfiera la suspensión de celdas a una jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 23 en el extremo.Ensamble una jeringa y un aparato de aguja idénticos y únalos a través de seis pulgadas de tubo de polietileno, firmemente enfundado sobre cada punta de la aguja. Corta los flagelos pasando suavemente la suspensión celular de una jeringa a la otra 50 veces, con pausas de un minuto entre cada 10 pasadas. A continuación, centrifugar las células cortadas a 2000 veces G durante tres minutos y volver a suspenderlas en 500 microlitros de MB.To preparar una cámara de fijación de células, apilar un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio separado por cinta adhesiva de doble cara.Agregue una solución de polilisina al 0,01% en la parte superior de la cámara para enjuagarla. Incline el borde inferior sobre una toallita para extraer la solución a través de la cámara, luego déjela a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lave la cámara tres veces con 40 microlitros de MB y agregue 40 microlitros de suspensión de celda cortada en la parte superior de la cámara.Deje que las células se adhieran al cubreobjetos durante 10 minutos, luego enjuague suavemente la cámara con 40 microlitros de MB para eliminar las células no adheridas. Transfiera el portaobjetos a la platina del microscopio y utilice la microscopía de contraste de fase y un objetivo 100X para escanear la población en busca de células que estén fijas en su lugar y giren sobre un solo eje. Abra el software del microscopio, asegúrese de que las células estén enfocadas y comience la adquisición de video para registrar la rotación de la célula durante un minuto.A partir de la reproducción de vídeo, cuantifique el número de rotaciones completas por minuto y el número de veces que la celda cambia de dirección. Inocular seis microlitros de un cultivo exponencial medio colocándolo encima del agar. Deje la tapa abierta durante cinco a 10 minutos y reemplácela cuando el inóculo se haya secado en la superficie del agar.Luego incube la placa a 30 grados centígrados durante ocho horas. Vierta aproximadamente 30 mililitros de agar enjambre en la cámara derecha de una placa de Petri de doble compartimento, asegurándose de que esté nivelada con el divisor de plástico entre las cámaras, pero que no se desborde hacia la izquierda. Después de que el agar se endurezca, llene la cámara izquierda con aproximadamente 30 mililitros de agar de natación o enjambre.Antes de que se asiente, use una punta de pipeta estéril para conducir suavemente el agar sobre el borde y conectar los dos lados con un puente de agar de un milímetro de altura que se extiende a lo largo de toda la división. Deje que la placa se seque a temperatura ambiente. A medida que viertes el agar, presta atención a su profundidad.Si es demasiado alto, se desbordará. Si es demasiado bajo, no podrá puentear las dos cámaras. Este protocolo se utilizó para aislar brotes pseudo revertentes en una cepa de E. coli doble mutante con motilidad alterada.Uno de estos revertidos mostró una motilidad cercana a la del tipo salvaje. Se utilizaron como controles el progenitor doble mutante y la cepa isogénica de tipo salvaje. Las capturas de video se analizaron para calcular las rotaciones por minuto y la fracción de tiempo que los motores giran en el sentido de las agujas del reloj, o polarización de caída.El mutante yhjH mostró unas pocas rotaciones por minuto y un menor sesgo de caída en comparación con E. coli de tipo salvaje, como se esperaba. Tanto el doble mutante como su supresor mostraron un comportamiento motor similar al del tipo salvaje. El ensayo de cruce de fronteras se utilizó para comparar las capacidades del tipo salvaje y el aislado supresor para enjambrar y luego para moverse a través de la frontera y enjambrar en agar suplementado con kanamicina.Ambas cepas mostraron tasas similares de enjambre desde un punto de inoculación idéntico, pero el cruce del enjambre a la cámara de antibióticos fue consistentemente mayor para el tipo salvaje que para el supresor. La diferencia entre las dos cepas fue más pronunciada a concentraciones más altas de kanamicina. Los ensayos de enjambre pueden ser difíciles de configurar.Es posible que tenga que dedicar algún tiempo a optimizar las condiciones de dibujo para que se adapten a las bacterias de interés, así como a las condiciones de laboratorio durante la preparación de los medios. Las técnicas de este protocolo se han aplicado a una variedad de bacterias flageladas, y probablemente se puedan aplicar a una gran cantidad de especies no probadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe el desarrollo de un dispositivo de microfluidos para la investigación de la quimiotaxis bacteriana en los gradientes de concentración estable de chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Fuente: Morales-Soto, N. et. al., Preparación, obtención de imágenes y cuantificación de ensayos de motilidad de la superficie bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un ensayo de enjambre utilizando bacterias que expresan proteína verde fluorescente para observar la motilidad de la superficie en agar blando. Las imágenes de lapso de tiempo capturan la expansión coordinada y la formación de zarcillos, destacando la motilidad de la superficie bacteriana.

Ensayo de enjambre para visualizar la motilidad de la superficie bacteriana

Fuente: Pioli, R., et al., Patrón de microorganismos y micropartículas a través del ensamblaje secuencial asistido por capilaridad. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el método de capturar células individuales de Escherichia coli (E. coli) marcadas con fluorescencia en trampas microfluídicas utilizando una suspensión libre de carbono y un flujo controlado, seguido de la adición de nutrientes para desencadenar el crecimiento y las imágenes de fluorescencia de las microcolonias.

Patrones microfluídicos y seguimiento basado en fluorescencia del crecimiento bacteriano unicelular

Fuente: Scheidweiler, D., et al. Combinar dispositivos fluídicos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a escalas espaciales. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para cuantificar la motilidad bacteriana a través de una matriz porosa compuesta por pilares dispuestos aleatoriamente. Se introducen bacterias marcadas con fluorescencia en el dispositivo, se fotografían mediante microscopía a medida...

Evaluación de la motilidad bacteriana utilizando un dispositivo microfluídico

La motilidad del enjambre está influenciada por factores físicos y ambientales. Describimos un protocolo de dos fases y pautas para sortear los desafíos comúnmente asociados con la preparación de ensayos de enjambre y la recopilación de datos. Se emplea una técnica de imagen macroscópica para obtener información detallada sobre el comportamiento del enjambre que no proporciona las técnicas de análisis actuales.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Hallazgos recientes sugieren que los motores flagelares bacterianos detectan una variedad de señales ambientales y se remodelan en respuesta. Se espera que los ensayos de perlas discutidos aquí ayuden a explicar el papel de la remodelación en la adaptación celular a los factores estresantes ambientales.

Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la motilidad bacteriana basada en una reacción de color. Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y más preciso, y no requiere equipo especializado.

Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Este protocolo presenta un método rápido y eficiente para identificar los factores genéticos involucrados en varios tipos de motilidades en Pseudomonas aeruginosa.

Método de alto rendimiento para observar fenotipos de motilidad en Pseudomonas aeruginosa

Aprende a investigar la motilidad bacteriana impulsada por flagelos en Escherichia coli mediante tres técnicas establecidas. Este método sistemático permite analizar la motilidad individual y colectiva con aplicaciones en patógenos.

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie (Video) | JoVE Journal

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

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