Name: Enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en Chlamydia trachomatis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende un enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en Chlamydia trachomatis. Este método utiliza reportadores fluorescentes y microscopía para rastrear el ciclo en tiempo real.

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Agradecemos al Dr. Anders Omsland en la Universidad Estatal de Washington por suministrar los medios de comunicación haxénicos CIP-1. Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01AI130072, R21AI135691 y R21AI113617. El apoyo adicional fue proporcionado por los fondos de inicio de la Universidad de Idaho y el Centro para Modelar Interacciones Complejas a través de su subvención NIH P20GM104420.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La disección de los mecanismos que controlan el ciclo de desarrollo de la clamidia se ha visto obstaculizada por las limitaciones de las herramientas genéticas actualmente disponibles. Empleando a nuestro promotor-reportero Chlamydia en conjunto con la microscopía automatizada de células vivas, se construyó un sistema que permite monitorear el desarrollo de tipo celular en inclusiones individuales durante un período de 24 horas. Este sistema, en combinación con la mutagénesis química y el aislamiento de inclusió...

Chlamydia trachomatis (Ctr) es un patógeno intracelular obligado que progresa a través de un ciclo de desarrollo bifásico que es esencial para su supervivencia y proliferación1. Este ciclo consta de dos formas de desarrollo, el cuerpo elemental (EB) y el cuerpo reticulado (RB). El EB es incompetente de replicación, pero media la invasión celular a través de la endocitosis inducida por el efector2. Una vez en el host, el EB madura al RB replicativo. El RB lleva a cabo múltiples rondas de replicación antes de convertir de nuevo al EB con el fin de iniciar rondas posteriores de infección.
La limitada gama de herramientas genéticas ha restringido la mayor parte de la investigación clamidia a estudios bioquímicos o el uso de sistemas sustitutos. Como consecuencia, el esclarecido de la regulación genética y el control del ciclo de desarrollo ha sido difícil3,4. Uno de los desafíos más importantes en el campo del clamidia es el seguimiento temporal de alta resolución del ciclo de desarrollo clamidial y la identificación de las proteínas implicadas en su regulación. La expresión génica durante el ciclo de desarrollo clamidial se ha realizado tradicionalmente mediante métodos destructivos de "punto final", incluyendo RNAseq, qPCR y microscopía de células fijas5,,6. Aunque estos métodos han proporcionado información invaluable, las técnicas empleadas son laboriosas y tienen baja resolución temporal5,,6.
En la última década, la manipulación genética de Ctr ha progresado con la introducción de la transformación del plásmido y los métodos para la mutagénesis7,8,9. Para este estudio, se desarrolló un sistema basado en plásmidos para monitorear el desarrollo de la clamidia en inclusiones individuales en tiempo real en el transcurso de una infección. Se creó un transformador de clamidia que expresaba un promotor-reportero específico de tipo célula RB y EB. El reportero específico de RB fue construido fusionando al promotor del gen RB temprano euo aguas arriba de la proteína fluorescente Clover. EUO es un regulador transcripcional que reprime un subconjunto de genes asociados a EB tardía10. El promotor de hctB,que codifica una proteína similar a la histona implicada en la condensación nucleoides EB, fue clonado directamente aguas arriba de mKate2 (RFP) para crear el reportero específico del EB11. La columna vertebral de hctBprom-mKate2/euoprom-Clover fue p2TK2SW27. Los promotores de hctB y euo se amplificaron a partir del ADN genómico Ctr-L2. Cada secuencia promotor consistía en 100 pares base aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción pronosticada para el gen clamidial especificado más los primeros 30 nucleótidos (10 aminoácidos) del ORF respectivo. Las variantes fluorescentes FP se obtuvieron comercialmente como bloques genéticos optimizados Ctr codón y se clonaron en fotograma con los primeros 30 nucleótidos de cada gen clamidol y promotor. El terminador incD fue clonado directamente aguas abajo de mKate2. El segundo promotor-reportero se insertó aguas abajo del terminador de incD. El gen de resistencia a la ampicilina (bla) en p2TK2SW2 fue reemplazado por el gen aadA (Resistencia a la espectinomicina) de pBam4. Esto dio lugar a la construcción final p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) que se transformó en Ctr-L27. Esta cepa reportera de RB/EB permitió la observación del ciclo de desarrollo dentro de inclusiones individuales utilizando microscopía de células vivas (Figura 1B,C).
Empleando nuestra construcción promotor-reportero en combinación con la mutagénesis química, se ideó un protocolo para rastrear y aislar clones individuales que mostraban anomalías en el desarrollo de poblaciones mutadas de Ctr serovar L2. Este protocolo permite el monitoreo directo de inclusiones clamidiales individuales, el seguimiento de los perfiles de expresión génica a lo largo del tiempo, la identificación de clones clamiales que expresan un patrón alterado de expresión génica del desarrollo, y el aislamiento clonal de la clamidia a partir de inclusiones individuales.
Aunque este protocolo ha sido creado específicamente para la identificación de genes implicados en el desarrollo clamidial, podría adaptarse fácilmente para interrogar cualquier número de vías genéticas clamidiales.

<table><tbody><tr><td>Placas de poliestireno de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Crecimiento de cultivos celulares para la reinfección de aislados Placas con fondo de vidrio de</td></tr><tr><td>6 pocillos</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Crecimiento de cultivos celulares para la obtención</td></tr><tr><td>de imágenes Placas con fondo de vidrio de 96 pocillos</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>Crecimiento de cultivos celulares para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Unidad de CO2</td><td>de línea audaz Unidad de CO2 de OKO Labs</td><td>UNIDAD de CO2 BL</td><td>Incubadora de etapa Control de CO2</td></tr><tr><td>Línea en negrita Unidad</td><td>T OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>Control de temperatura de la incubadora</td></tr> de <tr><td>etapa Tubos capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Instrument</td><td>B1005010</td><td>Tubos capilares Filtro de emisiones de</td></tr><tr><td>paso de banda BrightLine (514/30nm)</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>Cubo de filtro fluoescente</td></tr><tr><td>Filtro de emisiones de paso de banda BrightLine (641/75nm)</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/ 75-25</td><td>Cubo de filtro fluorescente</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinyector</td></tr><tr><td>Chlamydia trachmatis serovar L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>Chlamydia trachomatis</td></tr><tr><td>CIP-1 medios internos</td><td></td><td>NA</td><td>Axenic media. IPB suplementado con 1% de FBS, 25 &mu; M aminoácidos, 0,5 mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT y 50 &mu; M GTP, UTP y CTP. (Omsland, A. 2012) hecho internamente.</td></tr><tr><td>Células Cos-7 (ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Célula de riñón de mono verde africano (células huésped)</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td>194527 Inhibidor del crecimiento de la célula huésped</td></tr><tr><td>Metanosulfonato de etilo, 99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC205260100</td><td>mutágeno</td></tr><tr><td>Fetal Plex</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-602</td><td>Suplemento para medios de crecimiento base</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>Software de análisis de imágenes Open Sourse. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 Galaxy 170</td><td>S Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>Incubación de cultivos</td></tr><tr><td>celulares gblocks (variantes fluorescentes de FP: Clover y mKate2)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>gblock ORFs de Ctr optimizado para la clonación en p2TK2SW2</td></tr><tr><td>Gentamicina 10mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>Antibiótico para medios de crecimiento</td></tr><tr><td>HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>Enjuague de las células huésped</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Amersham Life Science</td><td>16920</td><td>inhibe y revierte las interacciones electrostáticas tempranas entre la célula huésped y los EB</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>Tampón de pH para medios de crecimiento</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Micromanipulador</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>Visualización de trazas de inclusión. https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Instrument</td><td>LB10-3 Controlador de</td><td>rueda de filtros</td></tr><tr><td>Oko Touch OKO</td><td>Labs</td><td>Oko Touch</td><td>Interface para controlar la línea Bold T y la unidad de CO2</td></tr><tr><td>Etapa XY anterior</td><td>Anterior</td><td>H107</td><td>Etapa de microscopio XY motorizada</td></tr><tr><td>Centrífuga PrismR</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>Microcentrífuga con control de temperatura</td></tr><tr><td>Problot Horno de hibridación</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>Incubadora oscilante para infección por clamidia</td></tr><tr><td>Proscan II</td><td>Anterior</td><td>H30V4</td><td>XYZ Controlador de etapa de microscopio</td></tr><tr><td>Purificador Clase 2 Gabinete de bioseguridad</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>Trabajo de cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sin rojo fenol)</td><td>Gibco</td><td>11835-030 Medios de</td><td>crecimiento base para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (rojo de fenol)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td>Medios de crecimiento base</td></tr><tr><td>scopeLED de excitación LED (470nm, 595nm)</td><td>scopeLED</td><td>F140</td><td>Luz de excitación</td></tr><tr><td>Desmembrador sónico modelo 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>Sonicador, pellet de clamidia resuspendente</td></tr><tr><td>Incubadora de etapa</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Cámara de incubación de placa de pocillo de racimo</td></tr><tr><td>tampón de sacarosa-fosfato-glutamato 1X (SPG)</td><td>Tampón</td><td></td> de <td>almacenamiento interno de clamidia NA. (10 mM de fosfato sódico [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM de sacarosa, 0,50 mM de ácido L-glutámico; pH 7,4)</td></tr><tr><td>Matraces T-75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>Crecimiento de cultivos celulares</td></tr><tr><td>Microscopio invertido TE 300</td><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>16724</td></tr><tr><td>THOR LED</td> Thor <td>Labs</td><td>LEDD1B</td><td>Luz blanca</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>Desaloja las células huésped del matraz para sembrarlas en placas</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>Cámara de imágenes ZYLA-5.5-USB3</td><td></td></tr><tr><td>y micro; Paquete</td> de <td>software de control de microscopio automatizado</td> Manager 2.0gamma<td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td> Open sourse</tr></tbody></table>

enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en chlamydia trachomatis

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

El patógeno bacteriano intracelular Chlamydia trachomatis se somete a un ciclo de desarrollo que consiste en dos formas de desarrollo morfológicamente discretas. El cuerpo elemental no replicativo (EB) inicia la infección del huésped. Una vez dentro, la EB se diferencia en el cuerpo reticulado (RB). A continuación, el RB se somete a varias rondas de replicación, antes de diferenciarse de nuevo a la forma de EB infecciosa. Este ciclo es esencial para la supervivencia clamydial, ya que la falta de conmutación entre tipos de celdas impide la invasión del host o la replicación.
Las limitaciones en las técnicas genéticas debidas a la naturaleza intracelular obligatoria de la clamidia han obstaculizado la identificación de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de tipo celular. Diseñamos un novedoso sistema de plásmido de doble promotor-reportero que, junto con la microscopía de células vivas, permite la visualización del cambio de tipo celular en tiempo real. Para identificar los genes implicados en la regulación del desarrollo de tipo celular, el sistema promotor-reportero de células vivas se aprovechó para el desarrollo de un enfoque genético hacia adelante mediante la combinación de mutagénesis química de la cepa de reportero dual, imágenes y seguimiento de la clamidia con cinética alterada del desarrollo, seguido por el aislamiento clonal de mutantes. Este flujo de trabajo genético directo es una herramienta flexible que se puede modificar para el interrogatorio dirigido a una amplia gama de vías genéticas.

La mutagénesis directa del SME de nuestra cepa clamidia promotor-reportero dio lugar a una reducción del 75% en la infectividad. Usando el protocolo de imágenes de células en vivo descrito, se tomaron imágenes de 600 inclusiones y se realizaron un seguimiento durante un período de 24 horas. La cinética de expresión fluorescente de ambos reporteros en cada inclusión se visualizó mediante scripts de bloc de notas de Python personalizados. Se implementaron dos enfoques de visualización para identificar la clamidia ...

Este protocolo utiliza promotor-reporteros fluorescentes, microscopía de células vivas y extracción de inclusión individual en un enfoque genético hacia adelante dirigido para identificar y aislar mutantes del desarrollo de Chlamydia trachomatis.

Enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Este protocolo proporciona una herramienta única para la generación y aislamiento de chlamydia con perfiles de desarrollo alterados, permitiendo en última instancia la identificación de los genes que regulan el ciclo de desarrollo. Las principales ventajas de este método son la capacidad de rastrear el desarrollo del tipo de célula de clamidia en tiempo real y la capacidad de aislar la clamidia, con programas de desarrollo alterados. Para mutagenizar a un reportero de clamidia trachomatis, vio un stock de clamidia que contenía aproximadamente tres veces el décimo a los séptimos cuerpos elementales.Transformado con el plasma reportero de interés y pellet, el pensamiento se siembra por centrofugación. utilizar la sonicación a 10% de potencia durante 10 segundos, para resuspender los cuerpos elementales en 100 microlitros de tampón de metabolismo accidental y dividir la suspensión elemental resultante del cuerpo por igual, entre dos tubos de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 50 microlitros de solución de metabolismo EMS recién preparada en las alícuotas de clamidia para mutagénesis y 50 microlitros de tampones del metabolismo vaccicín a la alícuota clamidial sólo para mutagénesis de stock e incubar ambas muestras durante 20 minutos, a temperatura ambiente.EMS es un guante de desgaste carcinógeno conocido durante la manipulación, y remoje todo el equipo contaminado con EMS y medio, en un hidróxido de sodio molar durante 24 horas antes de su eliminación. Establecer un cultivo al por mayor, para la toma de imágenes y el aislamiento de los tracómetros de clamidia mutigenizados. Las placas inferiores de seis pozos de semillas, con seis veces 10 a la quinta, cuestan siete células, en dos mililitros de medio completo por pozo y siembran una placa de poliestireno de 24 pozos con 10 a la quinta causa siete células en un mililitro de medio completo por pozo.Para infectar el cultivo de la célula huésped con negaciones mutagenizadas chlamydia trachomatis infect, cinco Pozos de una placa de fondo de vidrio con aproximadamente seis veces 10 a la quinta, de cuerpos elementales mutagenizados. En 1,5 mililitros de HBSS helado por pozo. e infectar el pozo restante, con aproximadamente dos veces 10 a la quinta simulacro de cuerpos elementales mutagenizados en 1,5 mililitros de hielo frío HBSS por pozo, después de una incubación de 15 minutos a 37 grados Celsius, con balanceo, lavar las células infectadas con 37 grados Celsius HBSS complementado con un miligramo por mililitro de heparina, seguido inmediatamente por un enjuague HBS.lavar las células con heparina de nuevo, seguido inmediatamente por dos enjuagues con HBSS solo para asegurarse de que se retira toda la heparina. Después del último lavado, agregue cuatro mililitros de 37 grados Celsius de medio de imagen, a cada pozo. Y llene los espacios entre pozos con 37 grados Celsius desionized water luego coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 10 horas.Al final de la incubación, la incubadora de la etapa del microscopio se desprendió de 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Y coloque la placa inferior de seis vasos, en la incubadora del escenario. En el software de imágenes, Utilice el plugin de cribado de alto contenido para seleccionar la plantilla de placa de seis pozos y generar una lista de posiciones de imagen que consta de 12 campos de visión por pozo, utilice la opción de enfoque automático para establecer el enfoque de la imagen automatizada y establezca la exposición en 250 milisegundos a una intensidad del 4% en el canal GFB y un 18% de densidad en el canal RFP.Por lo tanto, en el ciclo de imágenes durante 24 horas, con intervalos de 30 minutos, para capturar la cinética del ciclo de desarrollo y establecer la captura de imagen para incluir varias pilas Z con un rango de enfoque que termina a cada lado del sector InFocus, luego seleccione Z relativa para imágenes, varios sectores en la ventana de adquisición y utilice la opción de archivo de pila de imágenes. para configurar las imágenes que se guardarán como archivos de pila TIFF. Para identificar pistas de inclusión, con alter perfiles de desarrollo, utilice la celda de importación en la pantalla emS, rebaja el bloc de notas de Python, para importar los datos de seguimiento de inclusión de los puntos en las estadísticas de pista, archivos CSV en el marco de datos de Panda.Utilice la celda calcular para calcular el tiempo para tener la expresión máxima para los reporteros tempranos y tardíos para cada pista y utilice el paquete de trazado bokeh, en la celda de trazado medio máximo, para visualizar el tiempo dos expresión media máxima a la expresión media máxima contra la de hctB prom. Utilice el Explorador de ID de pista interactiva bokeh, para identificar inclusiones de la población mutante, que están fuera de la nube de dispersión tratada simulada. Para visualizar los cambios en la expresión del promotor cinética dinámicamente en el gráfico de células sanguíneas animadas, las intensidades de expresión de EOU prom contra hctB prom.A continuación, visualice una instantánea desde el gráfico animado, en la celda del localizador de inclusión. Para aislar el desarrollo Newtons, de las inclusiones de interés, posicionar el campo de visión sobre un pozo con una inclusión identificada, y pasar la aguja sobre la fuente de luz de canal de luz blanca de contraste de interferencia diferencial de fase, para visualizar la aguja, utilizar el 595 nanómetro, canal de excitación, para visualizar los cuerpos elementales para la extracción. Y utilizar el ajuste fino y el micro manipulador, para maniobrar la aguja capilar a la inclusión, romper la inclusión con la aguja, y utilizar el micro inyector para dibujar los cuerpos elementales en la punta de la aguja capilar.Expulsar los cuerpos elementales extraídos, de la aguja capilar en un solo pozo, de la placa de poliestireno de 24 pocillos, y utilizar una nueva aguja capilar para la siguiente extracción. Después de una expansión suficiente de cada aislado, interrumpa la monocapa infectada con una punta de micropipet de un mililitro y transfiera los desechos de células medias y la clamidia liberada en un nuevo tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitros. Pelecilar la clamidia cosechada por centrifugación, y resuspender el pellet en 75 microlitros de hielo frío, tamampón de glutamato de fosfato de sacarosa, luego dividir la suspensión de inclusión por igual, entre tres nuevos tubos micro centrífugos de tapa de tornillo de 1,5 mililitros, y almacenar los tubos en menos 80 para leer Celsius.Para establecer un cultivo de células huésped para la toma de imágenes de mutagen ISED aísla la semilla de una placa inferior de vidrio de 96 pozos con 1,6 veces 10 al cuarto costo siete células, en 100 microlitros de medio completo por pozo. Después de que la monocapa de células anfitrionas alcance el descongelación de la confluencia, los clones mutantes cosechados y las poblaciones de clamidia de tipo salvaje sobre hielo y utilicen una columna por aislado para realizar, una dilución serial dos veces de cada aislado mutante. Infectar, la columna restante con clamidia de tipo salvaje, en una multiplicidad de infección de aproximadamente 0,5, y colocar una placa en la incubadora de cultivo celular durante 10 horas al final de la incubación, seleccionar tres pozos por aislado mutante que corresponden a una multiplicidad de infección de menos de uno, y generar una lista de posición de imagen.que consiste en dos campos de visión por pozo. En esta gráfica de dispersión, el tiempo a la media expresión máxima de los promotores de EOU y hctB a partir de aislados clamidiales individuales se puede observar clones A3667 y B3858 fue elegido para el aislamiento, ya que produjeron tiempos más cortos para tener la expresión máxima, del promotor EOU y más tiempo cuatro hctB. Las inclusiones con cinética alterada se pueden identificar en función de la visualización, de la expresión génica dinámica de los dos promotores, y se puede utilizar una instantánea del gráfico animado, para identificar la ubicación de las inclusiones de interés.En estas visualizaciones representativas, se identificaron un total de 24 inclusiones para el aislamiento, 10 de las cuales presentaban cinética diferencial, tras volver a realizar pruebas en tres categorías fenotípicas diferentes, ocho aislados mostraron una disminución de la expresión promotora de la EOU a aproximadamente 24 horas después de la infección. Como lo demuestra el clon A3667, el aislado B3858, también exhibió una disminución de la expresión promotora de EOU, a unas 24 horas después de la infección. Pero un aumento general en la expresión del promotor de hctB, mientras que el aislado B3662, expresó mayores niveles de florescencia del promotor de la EOU seguido de una repentina pérdida de expresión en ambos promotores.El análisis de los micrografías de células vivas para el mutante B3662, revela que la lelisis de la célula huésped ocurrió, en células infectadas con este mutante, mucho antes que en las células infectadas de tipo salvaje. El desarrollo de la célula deficienciada de la clamidia, puede no ser posible, ya que estas células no pueden reinfectar al huésped. Los estudios de asociación del genoma se pueden utilizar después del aislamiento, para identificar genes del desarrollo, a través de la correlación estadística, con la incorporación de reporteros promotores alternativos.Este método puede extenderse, al sondeo de numerosas vías genéticas, a la disección de mecanismos de circuito genético, y otros patógenos intracelulares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Resistencia al estrés es una de las señas de identidad de la longevidad y es conocido por ser gobernado genéticamente. Aquí, hemos desarrollado un método de alto rendimiento imparcial para la detección de mutaciones que confieren resistencia al estrés en células madre embrionarias con el que desarrollan modelos de ratón para estudios de longevidad.

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VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped

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Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</empara la resistencia a IFN-γ por células dependiente&gt; Genes Importante Inmunidad Autónoma

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