Name: Creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de PDX y organoides derivados de PDX para la investigación farmacológica del cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Aprenda a crear organoides derivados de xenoinjertos de pacientes (PDX) para establecer modelos in vivo/in vitro emparejados. Este método permite el cribado in vitro de terapias contra el cáncer con alta precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a la Dra. Jody Barbeau, Federica Parisi y Rajendra Kumari por la lectura crítica y la edición del manuscrito. Los autores también quieren agradecer al equipo de Oncología in vitro e in vivo de Crown Bioscience por sus grandes esfuerzos técnicos.

Todos los protocolos y enmiendas o procedimientos relacionados con el cuidado y uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Crown Bioscience (IACUC) antes de realizar los estudios. El cuidado y uso de los animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices internacionales de la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio) según lo informado en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación (2011). Todos los procedimientos experimentales en animales se llevaron a cabo en condiciones estériles en instalaciones libres de patógenos específicos y se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de diferentes instituciones gubernamentales (por ejemplo, los Institutos Nacionales de Salud). Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la institución de la instalación (por ejemplo, el Comité institucional de la IACUC).
1. Preparación para el trasplante de tumores
<ol><li>
Alojamiento de animales
	<ol>
<li>Casa Balb / c ratones desnudos (n = 5) en jaulas ventiladas individuales, a 20-26 ° C, 30-70% de humedad, y un ciclo de iluminación de 12 h luz / 12-h oscuro, con ropa de cama de mazorca de maíz cambiada semanalmente, y la irradiación esterilizada alimentos gránulos secos más agua potable estéril ad libitum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de fragmentos tumorales de donantes
	<ol>
<li>Vigile de cerca a los ratones donantes que contienen tumores para el peso corporal (BW, vía la balanza de pesaje), y el volumen del tumor (TV, por la medida de la pinza).</li>
		<li>Cuando la TV alcanza los 800-1000 mm3,eutanasia a los animales que contienen tumores en una capucha de riesgo biológico.<ol>
<li>Coloque los ratones en una cámara de eutanasia con una tapa que entregue gas CO2 a la cámara. Descargue gas en la cámara a una velocidad de flujo que produzca una rápida inconsciencia con una angustia mínima para el animal. El caudal óptimo para el CO2 es de alrededor de 2-2,5 Lpm.</li>
			<li>Asegurar la eutanasia observando que los animales no recuperan la conciencia.</li>
			<li>Después de la muerte clínica aparente, mantenga el flujo de gas durante >1 minuto para minimizar la posibilidad de que un animal pueda recuperarse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Esterilizar la piel alrededor del tumor usando hisopos de yodoforo. Recoger los tumores mediante la extracción de tejidos adyacentes no tumorales y la colocación en una placa de Petri que contiene 20 mL de PBS, pre-refrigerado (4 °C) antes de la eutanasia.</li>
		<li>Lave los tumores con PBS en otra placa de Petri para eliminar los componentes sanguíneos seguidos de cortar por la mitad y eliminar cualquier piel, vasos sanguíneos, calcificación y/o necrosis adicionales.</li>
		<li>Coloque solo piezas tumorales intactas en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con 20 mL de PBS, antes de transportarlos a una sala de animales separada para su trasplante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Crecimiento tumoral subcutáneo
<ol><li>
Inoculación subcutánea del pedazo del tumor en ratones immunocompromised
	<ol>
<li>Corte el tumor pdx en pedazos de 2 milímetros con un bisturí, y coloque cada uno en los trocars para la implantación subcutánea (SC).</li>
		<li>Anestesiar a los animales receptores con isoflurano al 5% (mantenido por un cono nasal al 1%). Los animales se relajan, perdiendo su reflejo corrector y eventualmente quedando inmóviles, hasta no responder al dolor. Fije los ratones anestesiados en un tablero de experimento en la posición lateral correcta y esterilice con hisopos de yodoforo, particularmente las áreas que rodean el sitio de inoculación del tumor.</li>
		<li>En la piel del flanco izquierdo justo craneal a la cadera, hacer una incisión de 0,5 cm con un bisturí y crear un túnel debajo de la piel hacia el miembro anterior, 2-3 cm, utilizando pórceps contundentes.</li>
		<li>Transferir asépticamente un cubo de fragmento de tumor por sitio de inoculación desde el medio y colocar profundamente dentro del túnel subcutáneo. Confirme visualmente la posición del fragmento antes del cierre de la herida con los clips de la herida.</li>
		<li>Monitorear a los ratones implantados en el tumor (5) hasta que se vuelvan conscientes para mantener la reclinación esternal, y luego devolverlos a su jaula solo después de su recuperación completa de la anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monitoreo de la salud de ratones con tumores
	<ol>
<li>Compruebe el consumo de agua y alimentos diariamente y registre el peso corporal semanalmente.</li>
		<li>Revise los ratones durante el monitoreo de rutina. Registre cualquier efecto sobre la movilidad, la respiración, el aseo y la apariencia general, el consumo de alimentos y agua, la ganancia / pérdida de BW, la ascitis, etc.</li>
		<li>Mida la TV dos veces por semana usando pinzas y exprese en mm3 por: TV = 0.5 a × b2,donde a y b son la longitud y la anchura del tumor, respectivamente.</li>
		<li>Sacrificar animales para recoger muestras cuando aparezca alguno de los siguientes signos: pérdida de BW >20%; movilidad deteriorada (no capaz de comer o beber); incapaz de moverse normalmente debido a ascitis significativa o abdomen agrandado; esfuerzo en la respiración; muerte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Necropsia y cosecha tumoral
<ol><li>Cuando el volumen tumoral alcanzó los 200-800 mm3,eutanasia a los ratones según los protocolos aprobados (véase el paso 1.2.2).</li>
	<li>Recoja los tejidos del tumor quitando los tejidos no-tumorales adyacentes, seguido colocando el tejido en un tubo plástico de 50 mL con AD+++ (en el hielo) antes de la disociación.</li>
</ol>4. Preparación para el cultivo organoide derivado de PDX
NOTA: Todos los siguientes pasos se realizaron dentro de un gabinete de bioseguridad por las pautas estándar de cultivo de tejidos. Mantenga las existencias precalentadas de placas de 96, 24 y 6 pozos en una incubadora de 37 °C antes de su uso.
<ol><li>Preparaciones de reactivos<ol>
<li>Prepare la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) (factor de crecimiento reducido, Fenol Rojo-libre). Mantenga 10 mL de BME en un refrigerador de 4 °C durante la noche. Una vez descongelado, gire la botella de BME para asegurar la dispersión.</li>
		<li>Prepare el medio base/tampón de lavado AD+++. Añadir 5 mL de L-glutamina de 200 mM, HEPES de 1 M y Pluma/Estreptococo al medio AVANZADO DMEM/F12 pipeteando con una pipeta de 5 mL.</li>
		<li>Preparar el medio organoide del colon descrito por Sato et al.18 mediante la suplementación de medios base con N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nicotinamida (10 mM), SD202190 (10 nM), R-espondina (500 ng/mL), L-glutamina (2 mM), HEPES (10 μM), penicilina-estreptomicina (1x) e Y-27623 (10 μM)19.</li>
		<li>Preparar AD+++Medio de digestión: 10 mL de 1x medio de cultivo organoide con 500 μL de colagenasa tipo II (20 mg/mL) y 10 μL de RhoKI Y-27632 (10 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disociacióntumoral 20<ol>
<li>Transfiera el tumor en un tubo plástico de 50 mL a una placa de Petri de 10 cm. Tome una fotografía macroscópica junto a una regla y registre una descripción de sus condiciones (es decir, tamaño, tejidos grasos, vascularización, necrosis, etc.).</li>
		<li>Elimine el exceso de AD+++ por aspiración y corte el tejido tumoral en trozos pequeños con tijeras seguidas de transferencia de 1-2 piezas en un microtubo de 2 mL para la congelación instantánea en hielo seco. Conservar a -80 °C para perfiles genómicos. Picar las piezas restantes en piezas más finas por tijeras antes de transferir a un tubo de plástico de 50 mL utilizando AD +++.</li>
		<li>Lavar el tejido picado 2-3 veces por 35 mL de AD+++, seguido de la adición de 10 mL de medio de digestión (ver paso 4.1.4) y la colocación en una coctelera orbital a 4 x g durante 1 h a 37 °C.</li>
		<li>Homogeneizar el tejido digerido pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de plástico estéril de 5 mL, seguida de la adición de 20 mL de AD+++ y la filtración por colador celular de 100 μm.</li>
		<li>Lavar el paso a través dos veces con AD +++ (girar a 450 x g durante 5 min), seguido de resuspensión en BME (añadir 4x volumen de BME a la pastilla para la suspensión) y mantener en el hielo19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del cultivo organoide<ol>
<li>Agregue la suspensión de celda BME en la placa de 6 pozos en múltiples gotas hasta un total de 200 μL por pozo.</li>
		<li>Transfiera la placa a una incubadora de 37 °C. Después de 30 min, las gotas de gel se solidifican.</li>
		<li>Añadir 2 mL de medio organoide a cada pozo, con las gotas representativas registradas por fotografía microscópica antes de transferir a una incubadora (37 °C y 5% deCO2).</li>
		<li>Mantener los cultivos organoides con cambio medio cada 3-4 días, y el paso en una proporción de 1:2 cada 7 días o dependiendo de su crecimiento y densidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Histopatología y análisis de secuenciación de próxima generación (NGS)
<ol><li>histopatología<ol>
<li>Recoger organoides del pozo con el medio existente utilizando una pipeta P1000, seguida de centrifugación (espín a 450 x g durante 5 min), lavado con PBS y fijación en formalina al 10% durante 1 h.</li>
		<li>Coloque los organoides fijos en gelatina al 100% en la parte inferior del tubo cónico de 50 mL, seguido de procesamiento e incrustación de tejidos de rutina.</li>
		<li>Realice la coloración de hematoxilina-eosina (H&E) utilizando protocolos estándar en secciones de parafina de 4 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNAseq y secuenciación completa del exoma<ol>
<li>Recoger organoides del pozo con el medio de cultivo existente utilizando una pipeta P1000, seguido de centrifugación utilizando una microcentrífuga a la velocidad máxima (12.000 x g)durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Recoja el pellet eliminando el sobrenadante medio para asegurarse de que no haya BME visible presente, seguido de congelación instantánea en un microtubo (hielo seco) y luego transferirlo a un congelador de -80 °C.</li>
		<li>Extraiga el ARN o la DNA usando el procedimiento estándar de fabricantes y realice el análisis de NGS para RNAseq y la secuenciación entera del exoma (WES).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. EnsayoIC 50 20
<ol><li>Siembra organoide en placa de 384 pozos para ensayo IC50<ol>
<li>Disociar organoides en gotas de BME de cada pozo (digerir BME) mediante la adición de 20 μL de solución de dispase 100x a cada pozo (placa de 6 pozos), que contenía 2 mL de medio organoide, seguido de 10 min de incubación a 37 °C.</li>
		<li>Pipette digirió organoides de todos los pozos a través de un filtro de 70 μm en un tubo de plástico de 50 mL para recoger los organoides.</li>
		<li>Contar los organoides bajo microscopía para la determinación de la concentración organoide. Suspenda los organoides utilizando el medio de cultivo, antes de añadir BME para alcanzar la concentración final del 5% (v/v) sobre hielo.</li>
		<li>Agregue 50 μL de la suspensión organoide en cada placa de 384 pozos con el dispensador de líquido, de acuerdo con el mapa de la placa con una densidad de siembra de 200 PDXOs CR2110 por pozo en el medio de cultivo organoide correspondiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamiento con cisplatino e irinotecán<ol>
<li>Use cisplatino (con la concentración más alta de 100 μM) e "irinotecán" (con la concentración más alta de 10 μM). Añadir SN-38 (un metabolito de irinotecán, a diferencia del irinotecán que se suele utilizar para estudios in vivo) a cada pozo según el esquema de dilución del fármaco durante 9 dosis, en dilución en serie por dispener digital.</li>
		<li>Cree el mapa de placas utilizando la herramienta de software del dispensador digital. Incluir un vehículo de control negativo con 100% de viabilidad y control postivo de starurosporina de 5 μM, que mostró 0% de viabilidad.</li>
		<li>Vuelva a colocar las placas de 384 pozos tratadas con fármacos en la incubadora de 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinación de la viabilidad de las células organoides después del tratamiento farmacológico<ol>
<li>Al final de los 5 días de tratamiento farmacológico, determine la viabilidad de las células organoides utilizando reactivos de viabilidad de células luminiscentes según el procedimiento recomendado por el fabricante. Agregue el reactivo luminiscente en cada pozo con el disipador líquido y mezcle durante 5 minutos en una coctelera de placas, seguida de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Grabe la señal luminiscente en un lector de placas multi-pozo de luminiscencia.</li>
		<li>Calcule las viabilidades normalizadas de cada pozo utilizando las lecturas en bruto del lector de placas y cree una curva dosis-respuesta y valores de IC50 por ajuste de curva no lineal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+erlotinib+resistance+with+tailored+treatment+regimen+in+patient-derived+xenografts+from+naive+Asian+NSCLC+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients.</a> International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).</li>
<li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+Cancer+Researchearch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in Cancer Researchearch.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Models+of+Cancer+Explode+with+Possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Weeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+genetic+diversity+in+organoids+cultured+from+biopsies+of+human+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Organoids+Predict+Chemoradiation+Responses+of+Locally+Advanced+Rectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Yang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+RNAi+library+based+on+partially+randomized+consensus+sequences+of+nuclear+receptors%3A+identifying+the+receptors+involved+in+amyloid+beta+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation.</a> Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+gastric+cancers+with+EGFR+amplification+and+overexpression+respond+to+cetuximab+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy.</a> Scientific Reports. 3, 2992(2013).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+defined+oncogenic+mutation+alleles+seems+to+better+predict+the+response+to+cetuximab+in+CRC+patient-derived+xenograft+than+KRAS+12%2F13+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations.</a> Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathology+of+Patient+Tumors%2C+Patient-Derived+Xenografts%2C+and+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines.</a> Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+Organoid+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Corcoran, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+BRAF+and+MEK+Inhibition+With+Dabrafenib+and+Trametinib+in+BRAF+V600-Mutant+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. , (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
</ol>

Todos los autores son los actuales empleados a tiempo completo de Crown Bioscience, Inc.

Los datos preliminares para PDX-/PDXO-CR2110 en este informe apoyan la equivalencia biológica entre PDX y su derivado, PDXO, con respecto a la genómica, la histopatología y la farmacología, puesto que ambos modelos representan las formas de la enfermedad derivadas del CSC original del paciente. Ambos modelos son modelos de enfermedad derivados del paciente, potencialmente predictivos de la respuesta clínica de los pacientes10,11,12,</...

Los cánceres son una colección de diversos trastornos genéticos e inmunológicos. El desarrollo exitoso de tratamientos efectivos depende en gran medida de los modelos experimentales que predicen eficazmente los resultados clínicos. Las bibliotecas grandes de xenoinjertos paciente-derivados bien-caracterizados (PDX) se han visto durante mucho tiempo como el sistema in vivo traslacional de la opción para probar chemo- y/o terapias apuntadas debido a su capacidad de recapitular características del tumor paciente, heterogeneidad y respuesta de la droga paciente1,así permitiendo que la fase II-como los ensayos clínicos del ratón mejore éxito clínico2,3. Los PDX se consideran generalmente como enfermedades de células madre cancerosas, con estabilidad genética, en contraste con los xenoinjertos derivados de la línea celular2. En las últimas décadas, se han creado grandes colecciones de PDXs en todo el mundo, convirtiéndose en el caballo de batalla del desarrollo de medicamentos contra el cáncer en la actualidad. Aunque son ampliamente utilizados y con un gran valor de traslación, estos modelos animales son intrínsecamente costosos, consumen mucho tiempo y bajo rendimiento, por lo tanto, inadecuados para el cribado a gran escala. Los PDX también son indeseables para las pruebas de inmunooncología (IO) debido a una naturaleza inmunocomprocomprotege4. Por lo tanto, no es práctico aprovechar al máximo la gran biblioteca disponible de PDXs.
Descubrimientos recientes, iniciados por el laboratorio5de Hans Clevers, han llevado al establecimiento de cultivos in vitro de organoides generados a partir de células madre adultas en la mayoría de los órganos humanos de origen epitelial5. Estos protocolos se han perfeccionado aún más para permitir el crecimiento de organoides a partir de supuestos CSCs en carcinomas humanos de diversas indicaciones6,7. Estos organoides derivados de pacientes (DOP) son genómicamente estables8,9 y se ha demostrado que son altamente predictivos de los resultados del tratamiento clínico10,11,12. Además, la naturaleza in vitro de las DOP permite el cribado de alto rendimiento (HTS)13,lo que potencialmente ofrece una ventaja sobre los modelos in vivo y aprovecha las grandes bibliotecas organoides como sustituto de la población de pacientes. Las DOP están preparadas para convertirse en una importante plataforma de descubrimiento y traslación, superando las muchas limitaciones de las PDX descritas anteriormente.
Tanto la DOP como la PDX son modelos derivados de pacientes e impulsados por CSC, con la capacidad de evaluar la terapéutica en el contexto de un tratamiento personalizado o un formato de ensayo clínico. Las grandes bibliotecas existentes de PDXs, como la colección patentada de >3000 PDXs14,15,16,17,son por lo tanto adecuadas para la rápida generación de bibliotecas de organoides tumorales (organoides derivados de PDX, o PDXO), lo que resulta en una biblioteca emparejada de modelos pdx y pdxo emparejados. Este informe describe el procedimiento para crear y para caracterizar el cáncer colorrectal PDXO-CR2110 en lo referente a su modeloparental 16de PDX-CR2110.

<table><tbody><tr><td>Tecnologías avanzadas DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Medio base</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td>Medio de lavado</td></tr><tr><td>Colágeno tipo II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Digest tumor</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matriz de cultivo de organoides (Extracto de membrana basal, factor de crecimiento reducido)</td></tr><tr><td>N-Ac</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C Medio de cultivo de</td><td>organoides</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7076</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>Rspondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38-1000 Medio de</td><td>cultivo de organoides</td></tr><tr><td>L-glutamina Life</td><td>Technologies</td><td>35050038</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies 15140122</td><td></td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>Medio de cultivo de organoides</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Ensayo de cribado</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Ensayo de cribado (indicador de ATP luminiscente)</td></tr><tr><td>Dosificador multigota</td><td>Thermo Fisher</td><td>Multidrop combi</td><td>Organoides de recubrimiento/CellTiter-Glo Adición 3D</td></tr><tr><td>Dispensador digital</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>Adición de compuestos</td></tr><tr><td>Envision Lector de placas</td><td>Perkin Elmer</td><td>2104</td><td>Lectura de luminiscencia</td></tr><tr><td>Balb/c ratones desnudos</td><td>Beijing HFK Bio-Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>kit</td></tr> <tr><td>de purificación de ARNtDNAeasy Blood & Kit de tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Kit de purificación de ADN</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td>Incrustación de organoides</td></tr></tbody></table>

creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de pdx y organoides derivados de pdx para la investigación farmacológica del cáncer

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Los xenoinjertos de tumores derivados de pacientes (PDXs) se consideran los modelos preclínicos más predictivos, en gran parte se cree que son impulsados por células madre cancerosas (CSC) para la evaluación convencional de medicamentos contra el cáncer. Una gran biblioteca de PDXs refleja la diversidad de las poblaciones de pacientes y, por lo tanto, permite ensayos preclínicos basados en la población ("Ensayos clínicos con ratones tipo Fase II"); sin embargo, PDX tiene limitaciones prácticas de bajo rendimiento, altos costos y larga duración. Los organoides tumorales, también siendo modelos impulsados por CSC derivados por pacientes, pueden considerarse como el equivalente in vitro de PDX, superando ciertas limitaciones de PDX para tratar con grandes bibliotecas de organoides o compuestos. Este estudio describe un método para crear los organoids PDX-derivados (PDXO), así dando por resultado los modelos apareados para la investigación in vitro e in vivo de la farmacología. los tumores Subcutáneo-trasplantados PDX-CR2110 fueron recogidos de ratones del tumor-cojinete cuando los tumores alcanzaron 200-800 milímetros3,por un procedimiento aprobado de la autopsia, seguido por el retiro de los tejidos adyacentes del no-tumor y la disociación en pequeños fragmentos del tumor. Los pequeños fragmentos de tumor se lavaron y pasaron a través de un colador celular de 100 μm para eliminar los desechos. Los racimos celulares fueron recogidos y suspendidos en la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) y plateados en una placa de 6 pozos como gotita sólida con los medios líquidos circundantes para el crecimiento en una incubadora del CO2. El crecimiento organoide fue supervisado dos veces semanalmente bajo microscopia ligera y registrado por la fotografía, seguida por el cambio medio líquido 2 o 3 veces por semana. Los organoides crecidos fueron pasados más a fondo (7 días más adelante) en un ratio 1:2 interrumpiendo los organoids encajados BME usando el esquileo mecánico, ayudado por la adición de tripsina y la adición de 10 μM Y-27632. Los organoides fueron criopreservados en crio-tubos para almacenamiento a largo plazo, después de la liberación de BME por centrifugación, y también muestreados (por ejemplo, ADN, ARN y bloque FFPE) para su posterior caracterización.

Morfología de PDXOs, típica de organoides bajo microcopia ligera, y consistente con PDX parental por tinción H&amp;E Bajo microscopía de luz, PDXO-CR2110 demuestra una morfología quística típica(Figura 1A),como se describió anteriormente para organoides derivados de pacientes (DOP), evidencia que apoya la similitud entre PDXO y DOP bajo las mismas condiciones de cultivo.
El examen histopatológico por tinción H&amp;E revela que las estructuras t...

Un método se describe para crear organoids usando los xenografts paciente-derivados (PDX) para la investigación in vitro, dando por resultado pares hechos juego de modelos in vivo/ines vitro. Los tumores de PDX fueron cosechados/procesados en pedazos pequeños mecánicamente o enzimático, seguidos por el Clevers' método para crecer los organoids del tumor que fueron pasados, cryopreserved y caracterizados contra el PDX original.

Creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de PDX y organoides derivados de PDX para la investigación farmacológica del cáncer

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Este protocolo se puede utilizar para establecer una biblioteca emparejada de xenoinjertos paciente-derivados apareados, o PDX, y de líneas organoides paciente-derivadas correspondientes. La ventaja de este método es que se puede utilizar para crear organoides utilizando PDX para el cribado in vitro, lo que resulta en pares emparejados de modelos in vivo / in vitro. Comience por cosechar los tumores y procesar el tejido como se describe en el manuscrito del texto.Después de la digestión del tejido, pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de plástico estéril de cinco mililitros. Luego agregue 20 mililitros de AD + al homogeneado y filtre con un colador celular de 100 micrómetros. Lave el filtrado dos veces con AD+, luego transfilázquelo a un tubo de plástico y centrífugalo a 450 veces G durante cinco minutos.Resuspend las células en BME y mantenerlas en el hielo. Para preparar el cultivo organoide, transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de seis pozos e incube la placa a 37 grados Centígrados durante 30 minutos. Agregue dos mililitros de medios organoides a cada pozo e imagen del representante cae bajo un microscopio.Mantener los cultivos organoides a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono con cambios medios cada tres a cuatro días y pasar en una proporción de uno a dos cada siete días. Después de disociar los organoides, ejecutarlos a través de un filtro de 70 micrómetros en un tubo de plástico de 50 mililitros. Cuente los organoides bajo un microscopio y resuspend ellos en BME en el hielo para una concentración final del 5%Agregue 50 microlitros de la suspensión organoide en cada placa de 384 pozos con un dispensador líquido para una densidad de siembra de 200 CR2110 PDXOs por pozo.Utilice el dispensador digital para añadir SN38 a cada pozo en dilución en serie. Cree un mapa de placas utilizando la herramienta de software dispensador digital. Los tratamientos deben incluir un vehículo de control negativo con viabilidad al 100% y control positivo de cinco estaurosporinasporas micromolares con viabilidad al 0%.Cuando haya terminado, coloque las placas de 384 pozos tratadas con drogas de nuevo en la incubadora de 37 grados Celsius. Bajo microscopia ligera, PDXO CR2110 demuestra la morfología enquistada típica que demuestra la semejanza entre los organoids PDX-derivados y los organoids paciente-derivados bajo mismas condiciones de la cultura. La examinación histopatológica por la coloración de H&E revela que las estructuras del tejido y los tipos de la célula de PDXO CR2110 son similares al PDX original CR2110.Las comparaciones de perfiles genómicos de PDX y PDXO demuestran una correlación del 94,92% de la expresión del transcriptoma y una concordancia del 97,67% de las mutaciones del ADN, lo que sugiere una similitud genómica general entre este par de modelos. Los análisis de la sensibilidad de la droga fueron realizados en PDXO CR2110 en las placas de 384 pozos. PDXO CR2110 era sensible al irinotecan y resistente al cisplatin, constante con resultados del tratamiento de PDX.El par emparejado de modelos in vitro e in vivo puede complementarse entre sí para la detección in vitro y la validación in vivo, mejorando la tasa de éxito del descubrimiento de fármacos y reduciendo potencialmente las tasas de deserción en el desarrollo clínico.

creating-matched-vivoin-vitro-patient-derived-model-pairs-pdx-pdx

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Los cultivos organoides derivados del paciente de adenocarcinoma ductal pancreático son un modelo tridimensional rápidamente establecido que representa compartimentos de células tumorales epiteliales con alta fidelidad, lo que permite la investigación traslacional sobre esta malignidad letal. Aquí, proporcionamos métodos detallados para establecer y propagar organoides, así como para realizar ensayos biológicos relevantes utilizando estos modelos.

Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente

Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

En el siguiente trabajo, describimos los pasos consecutivos necesarios para el establecimiento de un gran biobanco de cáncer colorrectal y pancreático.

Creación y mantenimiento de un biobanco vivo - Cómo lo hacemos

Se desarrolló un sistema de ensayo de alto rendimiento in vitro de alta precisión para evaluar medicamentos contra el cáncer utilizando organoides tumorales (PDO) derivados del paciente, similares a los tejidos cancerosos, pero que no son adecuados para sistemas de ensayo de alto rendimiento in vitro con placas de 96 pocillos y 384 pocillos.

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Este protocolo describe un método semiautomatizado para exámenes de detección de fármacos con organoides de rendimiento medio a alto y software de análisis de imágenes automatizado e independiente del microscopio para cuantificar y visualizar las respuestas multiparamétricas a fármacos de un solo organoide para capturar la heterogeneidad intratumoral.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

El presente protocolo establece y caracteriza un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), ya que los modelos PDX se están convirtiendo rápidamente en el estándar en el campo de la oncología traslacional.

Establecimiento y caracterización de modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de carcinoma anaplásico de tiroides y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello

Presentamos un protocolo que se puede utilizar para realizar pruebas terapéuticas de fármacos con organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes.

Modelos de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario para pruebas preclínicas de medicamentos

Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.

Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Los organoides tumorales derivados de pacientes son un sistema modelo sofisticado para la investigación básica y traslacional. Este artículo de métodos detalla el uso de imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas para la evaluación cinética simultánea de diferentes fenotipos de organoides.

Imágenes multiplexadas de células vivas para las respuestas a los medicamentos en modelos de organoides derivados de pacientes de cáncer

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.

Presentación de oportunidades terapéuticas con modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma

Aprenda a crear organoides derivados de xenoinjertos de pacientes (PDX) para establecer modelos in vivo/in vitro emparejados. Este método permite el cribado in vitro de terapias contra el cáncer con alta precisión.

Creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de PDX y organoides derivados de PDX para la investigación farmacológica del cáncer (Video) | JoVE Journal

Creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de PDX y organoides derivados de PDX para la investigación farmacológica del cáncer

Explorar más videos