Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral
27 de agosto de 2020
Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.
Este método permite proporcionar expresión de microARN en riñones de ratones con una amplia gama de afecciones patológicas, como la fibrosis renal. La principal ventaja de esta técnica es que permite el perfilado de expresiones de microARN con alta precisión y sensibilidad mediante el uso de un proceso simple que ahorra tiempo y evita errores técnicos. Para realizar la cirugía falsa, utilice tijeras quirúrgicas y pinzas para hacer una incisión en la piel en el abdomen y cortar el músculo y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
Humedezca dos hisopos de algodón con PBS y tire cuidadosamente de los intestinos hacia un lado. Coloque los hisopos humedecidos para identificar el riñón izquierdo y el uréter. Cierre la membrana peritoneal y luego la incisión con nylon 4-0.
Para realizar la obstrucción uretral unilateral, o UUO, haga una incisión en la piel en el abdomen y corte el músculo y la membrana peritoneal como se demostró para la cirugía falsa. Coloque una jeringa de 2,5 mililitros debajo del ratón. Humedezca dos hisopos de algodón con PBS, luego tire de los intestinos cuidadosamente hacia un lado con las pinzas y coloque los hisopos para identificar el uréter izquierdo.
Use las pinzas para levantar el riñón izquierdo. Use 4-0 de seda para ligar el uréter izquierdo en dos lugares de aproximadamente un centímetro de distancia. Corte el uréter en el punto central de las dos ligaduras y luego use suturas de nylon 4-0 para cerrar la membrana peritoneal y la incisión.
Después de cortar la membrana peritoneal, como se ha demostrado anteriormente, levantarla con pinzas y utilizar tijeras quirúrgicas para hacer una incisión lateral en el borde superior, luego continuar la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas. Identifique el riñón izquierdo y reflujo con PBS hasta que el riñón se vuelva amarillo-blanco. Retire el riñón cortando la arteria renal izquierda y la vena con las tijeras quirúrgicas y colóquelo en una placa de Petri, luego lávelo cuidadosamente con PBS.
Cortar el riñón en muestras de aproximadamente 10 miligramos con las tijeras quirúrgicas y pinzas, poner cada pedazo del riñón en su propio tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y cerrar la tapa del tubo. Ponga una muestra de riñón en el homogeneizador de silicona y agregue 700 microlitros de un reactivo de lysis a base de fenilo/guanidina. Presione y retuerza lentamente el peste del homogeneizador contra la muestra de riñón para homogeneizarla.
Repita el prensado y la torsión hasta que la muestra se disuelva por completo en el reactivo de lelisis. Para homogeneizar aún más la muestra, transfiera el izado homogeneizado a la columna de giro del biopolímero y gírrela a 14.000 veces G durante tres minutos, luego transfiera el izado precipitado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros no utilizado. Combine el ésato en el tubo con 140 microlitros de cloroformo y tapón el tubo firmemente.
Para mezclar el izado y el cloroformo, invierta el tubo 15 veces. Incubar las muestras durante dos o tres minutos a temperatura ambiente, luego girarlas a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Sin perturbar el precipitado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y agregue 1,5 veces su volumen de 100% etanol.
Vórtice la mezcla durante cinco segundos. Cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de centrifugado anclada a membrana en un tubo de recogida de dos mililitros. Cierre la tapa de la columna y gire la columna a 15.000 veces G durante 15 segundos y, a continuación, tire el izado precipitado en el tubo de recogida.
Lave bien la muestra añadiendo 700 microlitros de tampón de lavado uno a la columna de centrifugado anclada a la membrana en un tubo de recogida de dos mililitros. A continuación, repita la centrifugación y tire el tubo de recogida. Repita el lavado dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado dos por lavado.
Después del último lavado, gire la columna de espín anclada a la membrana en un tubo de recogida de dos mililitros a 15.000 veces G durante un minuto y tire el lysate precipitado. Transfiera la columna de centrifugado anclada a la membrana a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Disuelva el ARN total añadiendo 30 microlitros de agua libre de RNase a la columna, cierre la tapa de la columna y déjela durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego gira la columna a 15.000 veces G durante un minuto. Transfiera la muestra que contiene ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga sobre hielo y mida la concentración de ARN total por espectrofotometría. Prepare una solución de mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue ocho microlitros a cada tubo de una tira de tubo de ocho pozos.
Después de ajustar la densidad total de ARN, coloque una alícuota de 12 microlitros del ARN total en cada tubo y cierre la tapa. Centrifugar los tubos durante 15 segundos. Poner los tubos en el termociclo e incubarlos durante 60 minutos a 37 grados centígrados.
Cuando haya terminado, incubarlos inmediatamente durante cinco minutos a 95 grados centígrados para la síntesis de ADNc. Transfiera el ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y diluya 10 veces con agua destilada. Vórtice y centrifugar el tubo durante cinco segundos, luego realizar PCR cuantitativo en tiempo real, como se describe en el manuscrito de texto.
Este protocolo se utilizó para crear un modelo unilateral de ratón de obstrucción uretral a través de la ligadura ureteral izquierda en ratones macho de ocho semanas de edad que pesan de 20 a 25 gramos. Los uréteres estaban completamente obstruidos por doble ligadura con 4-0 suturas de seda. Los riñones se recolectaron a los ocho días después de la cirugía.
Los datos de microRNA qRT-PCR indicaron que el nivel de microRNA 3070-3p aumentó significativamente y los niveles de microARN, 7218-5p y microRNA 7219-5p disminuyeron en los riñones de los ratones UUO en comparación con los controles. Al intentar este protocolo, recuerde repetir la torsión de la muestra de riñón hasta que se disuelva completamente en el reactivo de lysis a base de fenilo/guanidina para lograr una buena extracción de ARN.
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Descripción general
Este artículo describe un método para evaluar la expresión de microARN en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa. La técnica permite una alta precisión y sensibilidad en el perfilado de la expresión de microARN en diversas condiciones patológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Patología renal
Antecedentes
- Los microARN desempeñan un papel fundamental en la regulación génica.
- La obstrucción ureteral unilateral (UUO) es un modelo para el estudio de enfermedades renales.
- El conocimiento de los perfiles de microARN puede aportar información sobre la fibrosis renal.
- Los métodos actuales pueden carecer de sensibilidad y precisión.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para evaluar la expresión de microARN en tejidos renales.
- Facilitar la investigación sobre enfermedades renales y sus mecanismos subyacentes.
- Mejorar la comprensión de los roles de los microARN en condiciones patológicas.
Métodos Utilizados
- Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR).
- Cirugía simulada para preparar el modelo de ratón.
- Uso de instrumentos quirúrgicos para la manipulación del tejido.
- Aplicación de PBS para el manejo del tejido.
Resultados principales
- El método permite un perfilado preciso de microARN.
- Alta sensibilidad para detectar niveles de microARN en tejidos renales.
- Facilita el estudio de diversas patologías renales.
- Reduce los errores técnicos en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta valiosa para la investigación renal.
- Mejora la comprensión de las funciones de los microARN en las enfermedades renales.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El perfilado preciso de la expresión de microARNs en modelos de fibrosis renal respalda la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos para enfermedades renales. Este método de qRT-PCR permite la cuantificación reproducible de microARNs asociados a la enfermedad, proporcionando confianza predictiva para la interrogación de vías y la alineación de biomarcadores. Aborda una brecha crítica en el análisis de tejido renal, facilitando pruebas de hipótesis en etapas tempranas y la priorización de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la disregulación de miARN en la fibrosis renal inducida por UUO.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo confiable para el aislamiento y la medición de miARN a partir de tejido renal, reduciendo la variabilidad técnica.
- Valor predictivo: Facilita la validación funcional de dianas al vincular los cambios en la expresión de miARN con vías relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera datos cuantitativos estandarizados de expresión de miARN adecuados para la optimización de ensayos y la preparación para cribado.
- Valor operativo: Ofrece alta sensibilidad y especificidad en la detección de miARN, lo que permite una evaluación confiable del efecto de compuestos.
- Escalabilidad: Utiliza un proceso simplificado de extracción y qRT-PCR compatible con aplicaciones de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los hallazgos de microARN en fase de descubrimiento con la validación preclínica en un modelo de fibrosis clínicamente relevante.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la evaluación de miRNA-3070-3p, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p como posibles biomarcadores traslacionales.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar al proporcionar lecturas moleculares reproducibles a partir de tejido renal enfermo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando datos de fenotipificación molecular que orientan la toma temprana de decisiones.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis sobre mecanismos mediados por miARN en la fibrosis renal mediante un perfil de expresión preciso.
- Selección: Genera resultados cuantitativos y reproducibles que respaldan el cribado confiable de compuestos y el análisis de relaciones estructura-actividad.
- Análisis: Proporciona valores de Ct normalizados y mediciones de cambio relativo que permiten la comparación entre condiciones y la evaluación estadística.
- Investigación Traductiva: Se alinea con la continuidad preclínica mediante el uso de un modelo UUO relevante para la enfermedad, para evaluar cambios en miARN asociados con la patología.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada para el análisis de miARN aplicable a múltiples modelos y proyectos de enfermedades renales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías impulsadas por miARN.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad entre laboratorios mediante un flujo de trabajo bien definido y controlado frente a contaminaciones.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en dianas basándose en un fenotipado molecular robusto.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos cuantitativos de miARN que orientan la selección y el avance de dianas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ARN, generación de modelos quirúrgicos y optimización de qRT-PCR.
- Depende del acceso a instrumentos quirúrgicos, equipos de homogenización y dispositivos de PCR en tiempo real.
- Necesita la estandarización de los pasos de extracción de ARN y síntesis de ADNc entre diferentes usuarios y centros.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a distintas regiones renales o modelos de enfermedad.
- Incluye limitaciones prácticas relacionadas con la variabilidad en el rendimiento de ARN y la necesidad de réplicas técnicas para garantizar la solidez de los datos.
