Unión Neuromuscular In vitro inducida a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Aquí proporcionamos un protocolo para generar NMJ in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Este método puede inducir NMJ con morfología madura y función en 1 mes en un solo pozo. Los NMJ resultantes podrían utilizarse potencialmente para modelar enfermedades relacionadas, para estudiar mecanismos patológicos o para detectar compuestos farmacológicos para la terapia.

Este sistema de inducción de unión neuromuscular humana se puede utilizar para inducir la formación de componentes pre y post-sinápticos, incluyendo neuronas motoras, músculo esquelético, y células Schwann. No sólo se puede obtener una estructura NMJ madura y compleja en un solo plato de cultivo de una sola población celular inicial, sino que la NMJ resultante también posee la capacidad de contraer. Este método tiene potencial para estudiar enfermedades neuromusculares, como la atrofia muscular espinal, y para el cribado de compuestos terapéuticos.

El NMJ diferenciado es un tejido muy grueso y complejo, y es difícil de visualizar. Al demostrar el procedimiento, podemos indicar a los lectores cómo identificar estructuras específicas. Lavar las células con tres mililitros de PBS antes de agregar un mililitro de solución de desprendimiento celular a un plato de Petri.

Después de 10 minutos a 37 grados Celsius, agregue tres mililitros de medio de células madre embrionarias de primate a cada pozo y pipetee suavemente tres veces para disociar las células de los cubreobjetos. A continuación, acomúe los sobrenadantes separados que contienen células madre en un tubo cónico de 50 mililitros para centrifugación y resuspenda el gránulo de células madre en tres mililitros de medio de células madre embrionarias de primates frescos complementados con 10 micromolares Y-27632 inhibidores de ROCK para el recuento. Luego diluir las células a un dos veces 10 a las cinco células por mililitro de medio suplementado con concentración de inhibidores de ROCK y devolver dos mililitros de células a cada cubrep en cada pozo de la placa de seis pozos recubierta de matriz extracelular.

Después de 24 horas, reemplace el sobrenadante en cada pozo por dos mililitros de medio de células madre embrionarias de primate fresco complementados con un microgramo por mililitro de doxiciclina y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al final de la incubación, sustituya los sobrenadantes por dos mililitros de medio de diferenciación complementados con doxiciclina por pozo y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 10 días. Al final de la incubación, sustituya los sobrenadantes por dos mililitros de medio de diferenciación miogénico complementado con doxiciclina por pozo y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 10 días adicionales.

Al final de la incubación, sustituya los sobrenadantes por dos mililitros de medio de unión neuromuscular por pozo y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 30 días. Al final de la incubación, visualizar las uniones neuromusculares diferenciadas mediante microscopía invertida. Para desencadenar las contracciones de miotu, agregue 25 cloruros de calcio milimolar a cada pozo de células de unión neuromusculares diferenciadas.

Y dentro de uno a dos minutos del tratamiento, coloque la placa en el escenario de un microscopio invertido. Usando microscopía de células vivas, graba una película de la contracción del miotu durante 20 segundos. Al final de la grabación, agregue 300 nanogramos por mililitro de curare al medio de cultivo y grabe la película durante otros 20 segundos antes de abrir el archivo de película en un programa de software de análisis de vectores de movimiento adecuado para su análisis.

La tinción inmunofluorescente de los vasos sinápticos neurofilamentos y receptores de acetilcolina se puede realizar para identificar las neuronas. Las neuronas motoras podrían identificarse mediante la tinción de TUJ 1 e Islet 1, mientras que los miotubos postsinápticos se pueden identificar mediante tinción para la cadena pesada de miosina. Las células Schwann se pueden etiquetar con anticuerpo S-100.

En estas imágenes de microscopía electrónica de barrido, la morfología de las uniones neuromusculares maduras se puede observar con una visualización clara de los terminales de axón expandido, axones y fibras musculares. La microscopía electrónica de transmisión se puede utilizar para visualizar la estructura ultra madura de los componentes neuromusculares, incluyendo el terminal de axón presináptico con vesículas sinápticas y la región postsináptica, que está separada por la hendidura sináptica. Los pliegues de unión marcan la unión entre la neurona y las fibras musculares.

Aquí, se muestran terminales de axón maduros que contienen vesículas sinápticas. En conjunto, estas características morfológicas indican que los componentes neuromusculares fueron bien inducidos y madurados. La evaluación funcional de las células revela que las señales prominentes de movimiento de unión neuromuscular pueden ser inducidas por cloruro de calcio y que estas contracciones pueden ser interrumpidas por curare confirmando que las señales de la neurona motora se transmiten a través de la unión neuromuscular para desencadenar la contracción muscular.

La densidad de siembra celular influye en la eficiencia de la formación NMJ. Se puede modificar para adaptarse al protocolo, de acuerdo con los propósitos experimentales. Este cultivo de unión neuromuscular contiene múltiples tipos de células, y estos componentes se pueden utilizar para estudiar las interacciones entre estas células durante el desarrollo de la unión neuromuscular o en respuesta a patologías específicas de la enfermedad.