Name: Neisseria meningitidis Infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a utilizar células endoteliales cerebrales derivadas de iPSC para estudiar interacciones huésped-patógeno con Neisseria meningitidis. Este modelo humano permite analizar infecciones en la barrera hematoencefálica.

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L.M.E. cuenta con el apoyo del programa de formación en investigación de DFG GRK2157 titulado "Modelos de tejidos 3D para el estudio de infecciones microbianas por patógenos humanos" otorgado a A. S-U. B.J.K. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación Alexander von Humboldt. Además, reconocemos a Lena Wolter por su asistencia técnica en la generación de los iPSC-BEC en cultura.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelado de BECs y la BBB ha tenido desafíos, ya que los BECs humanos primarios e inmortalizados, in vitro, tienden a carecer de fenotipos de barrera robustos. El advenimiento de las tecnologías de células madre humanas ha permitido la generación de células similares a BEC derivadas de iPSC que conservan los fenotipos característicos esperados de la BBB, como los marcadores endoteliales, la expresión de la unión estrecha, las propiedades de barrera, la respuesta a otros tipos de células del SNC y los transpor...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

La barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica meníngea (mBCSFB) son barreras celulares extremadamente estrechas que separan la circulación del sistema nervioso central (SNC) y están compuestas principalmente por células endoteliales cerebrales (BEC) altamente especializadas1,2. Juntos, los BEC mantienen una homeostasis cerebral adecuada mediante la regulación de nutrientes y productos de desecho dentro y fuera del cerebro, al tiempo que excluyen muchas toxinas, medicamentos y patógenos 1,2. La meningitis bacteriana se produce cuando las bacterias transmitidas por la sangre son capaces de interactuar y penetrar en la barrera formada por los BEC y causar inflamación. Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) es una bacteria gramnegativa que coloniza la nasofaringe del 10-40 % de los individuos sanos, pero en algunos casos puede causar enfermedades sistémicas graves3. En los individuos afectados, el Nm puede acceder al torrente sanguíneo donde puede causar púrpura fulminante, así como penetrar en los BEC que acceden al SNC causando meningitis3. La NM es una de las principales causas de meningitis bacteriana en todo el mundo y, a pesar de los esfuerzos de vacunación, sigue siendo una de las principales causas de meningitis4. Las intervenciones médicas modernas, como el tratamiento con antibióticos, han hecho que estas condiciones sean superables, sin embargo, los afectados por meningitis a menudo quedan con daño neurológico permanente 5,6.
Estudios previos han identificado factores bacterianos y la señalización del huésped que contribuyen a las interacciones Nm-BEC 7,8,9,10,11. Las adhesinas e invasinas identificadas, como la proteína de opacidad Opc y los pili tipo IV, así como receptores como CD147, se han realizado en varios modelos BEC in vitro, sin embargo, estos modelos carecen de muchas propiedades definitorias de la BHE 7,9,11,12. La comprensión completa de las interacciones Nm-BEC sigue siendo difícil de alcanzar debido en parte a la incapacidad de utilizar modelos in vivo, la protección incompleta de la vacunación y la falta de modelos BEC humanos robustos in vitro.
El modelado de hBEC in vitro ha sido un reto debido a las propiedades únicas de los BEC. En comparación con las células endoteliales periféricas, las BEC tienen una serie de fenotipos que mejoran sus propiedades de barrera, como la alta resistencia eléctrica transendotelial (TEER) debido a las uniones estrechas complejas12. Una vez removidos del microambiente cerebral, los BEC pierden rápidamente sus propiedades de barrera, lo que limita la utilidad de los modelos primarios o inmortalizados in vitro que solo forman una barrera débil12,13. La combinación de la especificidad humana de las infecciones por Nm, la falta de modelos in vivo robustos y los desafíos para modelar BEC humanos in vitro crea la necesidad de mejores modelos para comprender la compleja interacción huésped-patógeno entre Nm y BEC. Recientemente, utilizando tecnologías modelo de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), se han derivado células similares a BEC a partir de iPSC que imitan mejor a las BEC in vivo12,13,14,15. Las iPSC-BEC son de origen humano, fácilmente escalables y poseen fenotipos BEC esperados en comparación con sus contrapartes primarias o inmortalizadas12,13,14,15. Además, nosotros y otros hemos demostrado que las iPSC-BEC son útiles para modelar diversas enfermedades del SNC, como la interacción huésped-patógeno, la enfermedad de Huntington y la deficiencia de MCT8 que causa el síndrome de Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Aquí, demostramos cómo derivar iPSC-BEC a partir de fuentes renovables de iPSC y la infección de iPSC-BEC con Nm que conduce a la activación de la respuesta inmune innata. Creemos que este modelo es útil para interrogar la interacción huésped-patógeno que no se puede recapitular en otros modelos in vitro y es especialmente útil cuando se examinan las interacciones con patógenos específicos humanos como Nm.

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td>Reactivo de disociación de células enzimáticas</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico totalmente trans (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 (PECAM-1)</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glut-1</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>SPM498 (MA5-11315)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ocludin</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-52751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptona</td><td>BD 211684</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Placas y matraces de cultivo celular</td> Centrífuga <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Heraeus Megafuge 1.0R)</td>Cabina de bioseguridad <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clase II</td> Incubadora de CO2 <td>Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>(Incubadora con camisa de aire de CO2 DHD Autoflow)</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Columbia ager + 5 % sangre de oveja</td><td>Biomerieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell filtros de poliéster (12 o 24 pocillos)</td><td>Corning</td><td>3460, 3470</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Voltímetro epitelial (Millicell ERS-2) con electrodo STX</td><td>Merck (Millipore)</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td>Microscopio</tr> de <tr><td>fluorescencia Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>(Eclipse Ti)</td> Hemacitómetro <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Neubauer)</td><td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Medio libre de suero endotelial humano (hESFM)</td><td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido (Wilovert)</td><td>Hund (Will Wetzlar)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 células</td><td></td><td></td><td></td>Para</tr><tr>preparar 110 ml de suplemento<td>Kellogg's</td><td></td><td></td><td>, prepare 100 ml de 4 g/ml de glucosa, 0,1 g/ml de glutamina y 0,2 mg/ml de pirofosfato de tiamina y 10 ml de 5 mg/ml de Fe(NO3)3 y combine las soluciones. Filtre, esterilice y almacene la alícuota a -20 °C.</td></tr><tr><td>Reemplazo de suero knockout (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td> kit de <td>síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ROTH</td><td>4627.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Micropipetas ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>(Research Plus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Kit de aislamiento de ARN</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td>kit de aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Pipeta boy (Accu-Jet Pro)</td><td>Marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino derivado de plasma pobre en plaquetas (PDS)</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4211971</td><td></td></tr><tr><td>placas de qPCR (MicroAmp Fast de 96 pocillos)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK, Y27632 diclorhidrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR termociclador (StepOnePlus)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex medio basal + 50x suplemento StemFlex</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>Medio de mantenimiento de células madre</td></tr><tr><td>Rotor de cubo oscilante (Heraeus #2704)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td>Reactivo de disociación celular no enzimática (EDTA)</td></tr></tbody></table>

neisseria meningitidis infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

La meningitis meningocócica es una infección potencialmente mortal que se produce cuando Neisseria meningitidis (meningococo , Nm) puede acceder al sistema nervioso central (SNC) penetrando en las células endoteliales cerebrales (BEC) altamente especializadas. Dado que el Nm es un patógeno específico del ser humano, la falta de sistemas modelo in vivo robustos dificulta el estudio de las interacciones huésped-patógeno entre el Nm y los BEC y establece la necesidad de un modelo basado en el ser humano que imite a los BEC nativos. Las BEC poseen propiedades de barrera más ajustadas en comparación con las células endoteliales periféricas caracterizadas por uniones estrechas complejas y una elevada resistencia eléctrica transendotelial (TEER). Sin embargo, muchos modelos in vitro , como los BEC primarios y los BEC inmortalizados, carecen o pierden rápidamente sus propiedades de barrera después de la eliminación del microambiente neural nativo. Los avances recientes en las tecnologías de células madre humanas han desarrollado métodos para derivar células endoteliales similares al cerebro a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que fenocopian mejor las BEC en comparación con otros modelos humanos in vitro . El uso de BEC derivadas de iPSC (iPSC-BEC) para modelar la interacción Nm-BEC tiene la ventaja de utilizar células humanas que poseen propiedades de barrera BEC y puede utilizarse para examinar la destrucción de la barrera, la activación inmunitaria innata y la interacción bacteriana. Aquí demostramos cómo derivar iPSC-BEC a partir de iPSC, además de la preparación bacteriana, la infección y la recolección de muestras para su análisis.

El protocolo descrito aquí es una adaptación de Stebbins et al. y destaca el proceso para diferenciar las iPSC en células endoteliales similares al cerebro que poseen propiedades de BBB, y cómo utilizar este modelo para estudios de infección utilizando iPSC-BEC con Nm19,22. Las iPSC-BECs, cuando se diferencian adecuadamente, exhiben propiedades de barrera ajustadas medidas por TEER que a menudo son mayores de 2000 Ω·cm2, y expresan marcadores endotelia...

El protocolo descrito aquí destaca los principales pasos en la diferenciación de células madre pluripotentes derivadas de células madre cerebrales inducidas, la preparación de Neisseria meningitidis para la infección y la recolección de muestras para otros análisis moleculares.

Neisseria meningitidis Infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

Este protocolo demuestra el uso de células endoteliales similares al cerebro derivadas de iPSC para examinar las interacciones entre el huésped y el patógeno en las barreras hematoencefálicas, como las barreras meníngeas de sangre y LCR, en un modelo que puede imitar mejor las células endoteliales cerebrales in vivo. El examen in vitro de las propiedades de la barrera de las células endoteliales cerebrales y las interacciones con patógenos específicos de los seres humanos puede ser un desafío debido a las limitaciones en el modelado. Las células endoteliales cerebrales derivadas de iPSC son particularmente útiles para estas aplicaciones, ya que poseen fenotipos de barrera superiores y son de origen humano.Mantenga las células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en placas de seis pocillos con dos mililitros de medio de mantenimiento de células madre. Para el paso de las células, aspire el medio desde un pocillo que no sea confluente y agregue un mililitro de reactivo de disociación celular no enzimática. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados durante siete minutos.Mientras tanto, reemplace la solución de gel de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Este video muestra un protocolo para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en células endoteliales cerebrales.

Generación de células endoteliales cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas

Este video muestra un proceso de varios pasos para diferenciar las iPSCs humanas en células endoteliales microvasculares cerebrales. Las células diferenciadas resultantes imitan de cerca a las células endoteliales microvasculares del cerebro, caracterizadas por uniones estrechas, lo que las hace ideales para la investigación de enfermedades cerebrales.

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano en células endoteliales microvasculares cerebrales

Fuente: Parajuli, B., et.al. Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en cerebro de ratones inmunocompetentes por vía transnasal no invasiva. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el trasplante transnasal de células de microglía humana derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en un cerebro de ratón. La hialuronidasa se aplica a las fosas nasales de un ratón con agotamiento microglial para mejorar la permeabilidad. La suspensión...

Trasplante transnasal de células microgliales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas en el cerebro del ratón

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.

Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal

Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.

Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.

Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva

Aquí, describimos un protocolo, el método de cultivo de células endoteliales extendidas (EECM), que permite la diferenciación de células madre pluripotentes a células similares a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas células muestran la expresión de la molécula de adhesión de células endoteliales y, por lo tanto, son un modelo de barrera hematoencefálica humano adecuado para estudiar las interacciones de las células inmunes in vitro.

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos a células cerebrales similares a células endoteliales microvasculares con un fenotipo inmune maduro

Aprende a utilizar células endoteliales cerebrales derivadas de iPSC para estudiar interacciones huésped-patógeno con Neisseria meningitidis. Este modelo humano permite analizar infecciones en la barrera hematoencefálica.

Neisseria meningitidis Infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas

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