Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

Como el ATP es un mensajero celular importante, desarrollamos un método que nos permite medir la unión del ATP a sus receptores con alta precisión. Usando FRET entre derivados de nucleótidos y proteínas marcadas con fluorescencia, podemos monitorear la unión de nucleótidos a receptores funcionales intactos en tiempo real y con una excelente resolución espacial. Utilizamos este método para comprender los efectos del metabolismo celular en el canal de potasio sensible al ATP, que está implicado en ciertas formas de diabetes.

Para establecer un experimento de membrana sin techo, primero use un par de pinzas para romper un pequeño fragmento de un resbalón de cubierta con células transfectadas y enjuague el fragmento con PBS. Si el cubreobjetos está precubierto con polilisina, coloque el fragmento en el fondo de un plato de 35 milímetros que contenga dos mililitros de PBS y sostenga un sonicador de sonda de tres a cinco milímetros por encima de la muestra, pulsando a 50 vatios y 20 a 40% de amplitud durante 200 a 500 milisegundos para destechar las celdas. Si los resbalones de la cubierta no están pre-recubiertos, después de enjuagar con PBS, sumerja el fragmento en un tubo que contenga 0,1% de poli-L-lisina durante unos 30 segundos antes de destechar las celdas con una breve sonicación como se demuestra.

Transfiera el fragmento sonicado a un plato cubierto de 35 milímetros con fondo de vidrio que contenga dos mililitros de solución de baño y monte el plato en un microscopio invertido equipado con un objetivo de inmersión en agua de 60x de alta apertura numérica. Compruebe que el puerto de la cámara del microscopio esté conectado a un espectrógrafo en serie con una cámara CCD de alta sensibilidad y utilice una bomba peristáltica para perfundir la cámara de baño con tampón a un caudal de 0,5 a un mililitro de tampón por minuto. Para identificar fragmentos de membrana sin techo que expresan el canal marcado ANAP, vea la muestra para localizar membranas con canales fluorescentes.

Acople parcialmente la máscara del espectrómetro entre el puerto de la cámara en el microscopio y el espectrógrafo. La sombra de la máscara aparecerá en la imagen de la cámara. Adquirir una imagen de campo brillante y fluorescencia de la membrana sin techo para permitir la selección de la región de interés para el análisis.

Acerque la punta del sistema de perfusión de microvolúmenes a la membrana sin techo. Para adquirir una imagen de fluorescencia ANAP, excite la membrana con un LED de 385 nanómetros a través de un filtro de excitación de paso de banda de 390/18 nanómetros y un dicroico de borde de 416 nanómetros, recogiendo la luz emitida a través de un filtro de emisión de paso largo de 400 nanómetros. Acople la máscara del espectrómetro y asegúrese de que la luz emitida pase a través de ella.

Alinee la región de interés con la ranura de la máscara del espectrómetro. Acople las rejillas del espectrómetro. Con las rejillas en su lugar, la luz difractada por el espectrómetro se proyectará en el chip de la cámara CCD para producir imágenes espectrales.

Las imágenes retendrán información espacial en la dimensión Y. La dimensión X será reemplazada por longitud de onda. Mientras se perfunde con una solución tampón libre de nucleótidos, obtenga una o más exposiciones de 0,1 a diez segundos para la corrección posterior y la normalización de los datos recopilados durante el resto del experimento.

A continuación, aplique un rango de concentraciones de ATP TNP en solución de baño para establecer una curva de respuesta de concentración, perfundiendo cada solución durante al menos un minuto para asegurarse de que se alcanza un estado estacionario y obtener una exposición para cada concentración. Después de cada concentración, lave el ATP TNP con solución de baño libre de nucleótidos durante al menos un minuto antes de adquirir una imagen de exposición posterior al tratamiento. Para realizar un experimento de fluorometría de abrazadera de parche, primero tire de las pipetas de parche de los capilares de vidrio de borosilicato de paredes gruesas a una resistencia de 1,5 a 2,5 megaohmios cuando se llenen con solución de pipeta.

A continuación, transfiera un cubreobjetos con células transfectadas al plato de 35 milímetros con fondo de vidrio que contenga dos mililitros de solución de baño y monte el plato en el microscopio invertido. Perfundir la cámara de baño con solución de baño e identificar una célula que exprese canales marcados ANAP. Aplique una presión positiva suave a una pipeta de parche y coloque la pipeta en una cámara de baño.

Presione la pipeta contra la membrana de la célula y aplique una succión suave para lograr un sello de gigaohmios. Para extirpar el parche, aleje rápidamente el soporte de la pipeta de la celda parcheada. Acerque la punta de la pipeta del parche a la punta del sistema de perfusión y compruebe que el parche está dentro de la hendidura de la máscara del espectrómetro.

Luego aplique TNP ATP y recopile espectros de imágenes. En estas imágenes, se puede observar un fragmento típico de membrana sin techo de una célula HEK293T que expresa canales de potasio sensibles al ATP marcados con proteína fluorescente naranja. En esta imagen espectral de canales de potasio sensibles a ATP marcados con ANAP en una membrana sin techo de una célula HEK293T expuesta a cinco micromolares de ATP TNP, se pueden observar dos regiones de alta intensidad que corresponden a la emisión máxima de ANAP y TNP ATP.

Se puede obtener un espectro final restando el espectro de fondo promediado del espectro de región de interés promediado. Aquí, se puede observar la reducción en la fluorescencia máxima de ANAP después de múltiples exposiciones. La fluorescencia máxima de varias exposiciones en ausencia de ATP TNP se ajustó a una sola disminución exponencial.

Estos datos se utilizaron para corregir artefactos de fotoblanqueo. Aquí, se muestran imágenes espectrales representativas de una membrana sin techo obtenidas de una célula que expresa canales de potasio sensibles al ATP marcados con ANAP en ausencia y presencia de ATP TNP. La observación de los espectros de emisión corregidos revela una clara separación entre la emisión fluorescente donante y aceptora.

En esta figura, se muestran corrientes y espectros representativos de canales de potasio sensibles al ATP marcados por ANAP de un experimento típico de fluorometría de pinza de parche. Los espectros de emisión se corrigen para el fondo y el blanqueo como se demuestra para las membranas sin techo. Tenga cuidado con los controles para verificar que la señal fluorescente sea específica de su receptor.

Asegúrese de que su profusión sea rápida, eficiente y completa y mantenga sus exposiciones lo más cortas posible. Este método responde preguntas sobre la ocupación del receptor y cómo se relaciona con la función. Otras técnicas FRET utilizadas con una configuración similar pueden sondear cambios confirmacionales inducidos por ligandos en el receptor.