Name: Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprende a preparar secciones transversales de semillas de arroz intactas utilizando puntas de pipeta como soporte para microscopía electrónica de barrido. Este método permite visualizar la morfología de los gránulos de almidón y facilita los programas de mejoramiento de variedades.

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Los autores agradecen a Systems for Research (SFR Corp.) por el uso de su instrumento Phenom ProX Desktop SEM, así como por la asistencia técnica proporcionada por Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) y Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Facultad de Medicina, Universidad de Ottawa). La financiación fue proporcionada por el Fondo de Innovación de Bajo Carbono (LCIF) del Ministerio de Desarrollo Económico, Creación de Empleo y Comercio del Gobierno de Ontario, y Proteins Easy Corp.

1. Preparación de la sección transversal de arroz
<ol><li>Descascarillar granos secos e intactos como se muestra en la Figura 1A.<ol>
<li>Afloje las cáscaras y descascarche los granos de arroz moliendo los granos entre dos tapones de goma planos. Retire los granos de arroz descascarillados de la panícula, si es necesario.</li>
		<li>Coloque un solo grano sobre un tapón de goma plano en un banco de trabajo (Figura 1B). Asegúrese de que este tapón permanezca estacionario.</li>
		<li>Utilice un segundo tapón de goma plana(Figura 1C)para desgastar el grano girándolo contra el primer tapón de goma, utilizando suficiente presión(Figura 1D). Retire las cáscaras del grano, teniendo cuidado de no romper el endospermo. Retire cualquier cáscara restante con fórceps finos. Un núcleo descascarillado se muestra en la Figura 1E.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando fórceps finos, inserte un grano descascarillado individual en una punta de pipeta de plástico (tamaño de 250 μL, una semilla / punta) (Figura 1F). Asegúrese de que el extremo embrionario del núcleo esté orientado hacia el extremo (cónico) de la punta de la pipeta(Figura 1G). NOTA: Insertar el kernel de esta manera asegura que el kernel encajará lo más ajustadamente posible en la punta de la pipeta ya que el kernel es más estrecho hacia su extremo proximal.</li>
	<li>Inserte una segunda punta de pipeta de 250 μL para forzar el núcleo en la punta de la pipeta y mantener el núcleo inmóvil durante la seccionamiento, teniendo cuidado de no dañar el núcleo ni doblar la segunda punta de pipeta (Figura 1H). El ensamblaje adecuado del "telescopio" se indica en la Figura 1I.</li>
	<li>Coloque el conjunto de la punta de la pipeta plano en un banco de trabajo y manténgalo en su lugar a mano (Figura 1J). Con la otra mano, use una cuchilla de bisturí afilada (No. 20) para cortar a través del centro del grano y cortar el extremo de la punta de la pipeta(Figura 1K). Usando el bisturí corte secciones de 1 mm de grosor del grano de arroz (Figura 1L). NOTA: La sección del núcleo está estrechamente encerrada dentro de un anillo de plástico (Figura 1M). El espesor medio de la sección para tres genotipos ejemplares se encuentra en la Tabla 1. Las secciones significativamente más delgadas que 1 mm se romperán o se desmoronarán. Es importante tener en cuenta a partir de qué parte del grano se origina cada sección si este experimento se está realizando en varias variedades de arroz para la comparación, ya que la morfología del almidón varía a lo largo del endospermo11.</li>
</ol>2. Microscopía de luz reflejada de secciones transversales de arroz
<ol><li>Use fórceps finos para colocar las secciones transversales de arroz (preparadas en la sección 1) sobre un trozo negro de papel negro de calibre pesado.</li>
	<li>Obtenga imágenes de luz de secciones transversales de Nipponbare utilizando un estereomicroscopio con cuellos de cisne montados para iluminación oblicua, como se muestra en la Figura 1N-S.</li>
	<li>Observe la morfología del endospermo con un aumento de al menos 10x. NOTA: Cualquier fuente de epilight es preferible a la microscopía de campo brillante, ya que las secciones obtenidas con esta técnica no son lo suficientemente delgadas como para que la luz pase.</li>
</ol>3. Microscopía electrónica de barrido de secciones transversales de arroz
<ol><li>Coloque las muestras en un disco de carbono pegado a un talón de aluminio y colóquelas en un soporte de muestra de reducción de carga. Retire el anillo de plástico del soporte de la punta de la pipeta con pinzas finas para evitar que el plástico entre en el aparato de vacío del SEM. NOTA: Las imágenes de celdas de endospermo, SG y subgránulos se obtienen utilizando una máquina SEM de escritorio que no requiere que las muestras estén recubiertas de pulverización.</li>
	<li>Obtenga las imágenes utilizando un detector de electrones de retrodispersión multimodo (BSE) de alta sensibilidad a 10 kV.</li>
</ol>

<ol><li>James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+synthesis+in+the+cereal+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Starch synthesis in the cereal endosperm.</a> Current Opinion in Plant Biology. 6 (3), 215-222 (2003).</li>
<li>Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosperm+and+starch+granule+morphology+in+wild+cereal+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Genetic+Resources%22%5BJournal%5D)">Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives.</a> Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).</li>
<li>Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+physical%2C+and+chemical+properties+of+grain+and+flour+from+chalky+rice+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants.</a> Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).</li>
<li>Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+direct+observation+method+to+isolate+mutants+with+defects+in+starch+grain+morphology+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stable+QTLs+causing+chalk+in+rice+grains+in+nine+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).</li>
<li>Nagato, K., Ebata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+temperature+during+ripening+period+on+the+development+and+the+quality+of+rice+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels.</a> Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).</li>
<li>Zhao, X., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change%3A+implications+for+the+yield+of+edible+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Climate change: implications for the yield of edible rice.</a> PLoS One. 8 (6), 66218(2013).</li>
<li>Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+hydrostatic+pressure+and+microbial+transglutaminase+treatment+on+structure+and+gelation+properties+of+sweet+potato+protein%5BTitle%5D)+AND+%22LWT+-+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein.</a> LWT - Food Science and Technology. 115, 108436(2019).</li>
<li>Feiz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puroindolines+co-localize+to+the+starch+granule+surface+and+increase+seed+bound+polar+lipid+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content.</a> Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+preparing+the+whole+section+of+starchy+seed+to+investigate+the+morphology+and+distribution+of+starch+in+different+regions+of+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed.</a> Plant Methods. 14 (1), 16(2018).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li>
<li>Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+and+application+of+the+new+combination+of+hybrid+rice+%22Xieyou+7954%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+%28Agriculture+and+Life+Sciences%29%22%5BJournal%5D)">Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954".</a> Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).</li>
<li>Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+digestion+properties+of+rice+different+in+resistant+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Slow digestion properties of rice different in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+soluble+starch+synthase+SSIIIa+and+granule-bound+starch+synthase+Waxy+in+synthesizing+resistant+starch+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).</li>
<li>Yang, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+properties+of+mutant+rice+high+in+resistant+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Starch properties of mutant rice high in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).</li>
<li>Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+methods+for+resistance+starch+content+of+Yi-Tang+rice+and+optimization+of+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment.</a> Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-transformed+rice+plants+expressing+synthetic+cryIA%28b%29+and+cryIA%28c%29+genes+are+highly+toxic+to+striped+stem+borer+and+yellow+stem+borer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+P-35S+and+T-nos+in+genetically+modified+organisms+by+recombinase+polymerase+amplification+combined+with+a+lateral+flow+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip.</a> Food Control. 107, 106775(2020).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+with+a+synthetic+cry1Ab+gene+from+Bacillus+thuringiensis+were+highly+resistant+to+eight+lepidopteran+rice+pest+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species.</a> Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).</li>
<li>Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalky+and+translucent+rice+grains+differ+in+starch+composition+and+structure+and+cooking+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties.</a> Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+development+of+starch+granules+and+the+regulation+of+starch+biosynthesis+in+Brachypodium+distachyon%3A+comparison+with+common+wheat+and+Aegilops+peregrina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 198(2014).</li>
<li>Giroux, M. J., Morris, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+grain+hardness+results+from+highly+conserved+mutations+in+the+friabilin+components+puroindoline+a+and+b%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).</li>
<li>Matsushima, R., Hisano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+amyloplasts+in+the+developing+endosperm+of+barley+and+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice.</a> Scientific Reports. 9, 3745(2019).</li>
<li>Matsushima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloplast-localized+SUBSTANDARD+STARCH+GRAIN4+protein+influences+the+size+of+starch+grains+in+rice+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm.</a> Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).</li>
<li>Monjardino, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+flange+and+reticulate+wall+ingrowths+in+maize+%28Zea+mays+L.%29+endosperm+transfer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells.</a> Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).</li>
<li>Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for transmission electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).</li>
<li>International Rice Genebank. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.irri.org">www.irri.org</a> (2018).</li>
<li>Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chalkiness+on+cooking%2C+eating+and+nutritional+qualities+of+rice+in+two+indica+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Rice+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties.</a> Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).</li>
<li>Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Countermeasures+for+heat+damage+in+rice+grain+quality+under+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Production+Science%22%5BJournal%5D)">Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change.</a> Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La técnica presentada aquí representa un enfoque rápido, simple y agudo hacia la preparación de secciones transversales de arroz transversales para la visualización SEM de escritorio. Esta técnica de seccionamiento permite la observación rápida de la estructura del endospermo, la forma, el tamaño y el patrón de las células del endospermo, los gránulos compuestos y la morfología del almidón. A los efectos del fenotipado del endospermo y el cribado de germoplasma, es fundamental obtener una sección transversal completa del grano de arroz4,23,24. Es primordial insertar el grano completamente dentro de la punta de la pipeta para evitar que la presión de la hoja del bisturí obligue al endospermo a desmoronarse o romperse. Siempre que el conjunto del "telescopio" esté construido correctamente, las muestras se pueden preparar para su visualización en 15 segundos(Tabla 2)empleando materiales que ya están en la mano en un entorno de laboratorio típico. Esta técnica es aplicable a la sección transversal de cualquier semilla elipsoidal de aproximadamente cuatro milímetros de diámetro en su punto más ancho. Las semillas de la hierba modelo Brachypodium distachyon (Figura S2A) pueden seccionarse de manera similar, pero no permanecen encerradas dentro del anillo. Las semillas más grandes, como el trigo, se fracturan fácilmente y requieren cuidado al seccionar (Figura S2B).
Sin embargo, hay varias limitaciones a la técnica presentada aquí. Las secciones obtenidas utilizando esta técnica no son lo suficientemente delgadas para que la luz pase a través de lo que prohíbe el uso de esta técnica para enfoques microscópicos basados en la luz transmitida como el campo brillante (500 μm de espesor máximo de muestra para las secciones25del grano de arroz) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) (espesor máximo de muestra de 500 nm26 ). El uso de una punta de pipeta como la "matriz" de seccionamiento también limita el tamaño de la semilla que se puede seccionar utilizando esta técnica. Se requeriría una mayor solución de problemas para adaptar esta técnica para especies muy diferentes del arroz, y el tamaño de la "matriz" está limitado por el tamaño de las puntas de pipeta disponibles para la compra.
Otra ventaja distintiva que proporciona esta técnica es la calidad de las muestras que se pueden producir a partir de granos de arroz de fenotipo calcáreo. Vale la pena señalar que incluso el estudio de Matsushima admitió que era difícil obtener secciones transversales utilizando ese método particular para los fenotiposcalcáreos 4,como se replica en este estudio con el propósito de comparar(Figura 1S). En su caso, se hizo necesario fijar químicamente sus muestras de arroz calcáreo e incrustarlas en resina para su seccionamiento. La nueva técnica, junto con imágenes SEM de escritorio, permite al investigador preparar fácilmente secciones transversales de granos de arroz para microscopía con más consistencia que sin soporte de inmovilización(Tabla 3).
En la nueva era de la fenómica y la metabolómica, es importante monitorear las líneas mutagenizadas y las bibliotecas etiquetadas con transposones para comprender mejor la función y la importancia del almidón en las semillas. Además, el Banco Internacional de Germoplasma del Arroz posee más de 130 000 accesiones de arroz27. Una técnica rápida de fenotipado de semillas como la que aquí se presenta aceleraría la clasificación y el muestreo para la calidad nutricional28. Por último, esta técnica puede ser útil a la luz de los impactos del cambio climático invasor. El estrés estacional a altas temperaturas durante el llenado de granos ya se había identificado como una de las principales causas de la calcárea6, pero estudios recientes han implicado el aumento de las temperaturas globales en el aumento de la calcificación de los rendimientos de arroz7,29. Tal fenotipo acelerado del endospermo puede ayudar a proporcionar una imagen agrícola amplia del efecto del aumento de las temperaturas globales.

Los gránulos de almidón (SG) exhiben diferentes morfologías dependiendo de la especie vegetal, especialmente en el endospermo de la familia Poaceae 1,2. El fenotipo de endospermo se puede utilizar para clasificar genotipos basados en el fenotipo SG utilizando el análisis microscópico electrónico de barrido. Los SG se pueden visualizar utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) cortando el núcleo y haciendo palanca en las paredes celulares del endospermo2.
El propósito de esta técnica es preparar fácilmente secciones transversales de granos de arroz únicamente para el análisis rápido de SEM. El desarrollo de esta técnica fue motivado por la necesidad de un enfoque de sección transversal rápida mediante el cual las muestras se preparan para la microscopía SEM inmediatamente antes de la visualización utilizando un equipo mínimo.
Esta técnica consiste en la inserción del grano de arroz descascarillado en la punta de la pipeta para una inmovilización completa. Esto es particularmente importante cuando se sección transversal de fenotipos de granos de arroz calcáreos, que son friables y se desmoronan fácilmente bajo presión3. La cizalladura es una cualidad indeseable en el arroz, ya que afecta la apariencia del grano y hace que el grano se rompa fácilmente durante el pulido y la molienda3. La tiza se presenta como un área opaca en una sección transversal del grano que se puede observar a simple vista; a nivel microscópico, la cizalladura se caracteriza por gránulos de almidón pequeños y poco empaquetados. Las causas de la calcárea pueden sergenéticas4,5 oambientales6,7.
Las secciones transversales de semillas de cereales se han preparado tradicionalmente utilizando métodos de fijación química y seccionamiento después de la incrustación de la muestra en cera de parafina u otra matriz sólida4,8,9,10. En 2010, se introdujo el método Matsushima como una forma de evitar la complicada y lenta preparación de muestras de grano de arroz4. Este método implicaba la inserción del grano de arroz descascarillado en una punta de pipeta truncada. La punta se mantiene estacionaria mediante un recortador de bloques, y las secciones delgadas y parciales de endospermo se cosechan con una cuchilla de afeitar de mano. Otra técnica rápida desarrollada en 2016 permitió la sección completa delgada de una amplia variedad de semillas secas, incluidas las variedades calcáreas10. Estos métodos motivaron el desarrollo de la técnica rápida presentada aquí.
Esta nueva técnica es apropiada para los investigadores que desean obtener secciones transversales transversales intactas de granos de arroz para el fenotipado de endospermo y el análisis de la morfología del almidón utilizando SEM.
Este protocolo representa una adaptación del método4de punta de pipeta truncada de Matsushima, con varias modificaciones notables: (1) los núcleos no se absorben en ningún punto de la técnica; (2) no se requiere ni un recortador de bloques ni un ultramicrotomo para preparar las secciones. En este estudio se examinaron un cultivar "translúcido" de tipo silvestre(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) y una línea mutagenizada "calcárea" de Nipponbare(ssg1,grano de almidón de calidad inferior1)4. Estos dos cultivares fueron seleccionados para el análisis aquí para demostrar las diferencias técnicas y visuales en el procesamiento de secciones de arroz translúcidas y calcáreas.

<table><tbody><tr><td>JMP 15</td><td>SAS</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Paquete de 100)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3347N</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Phenom Pro Desktop SEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHENOM-PRO</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta RC UNV 250 &micro; l</td><td>rainin</td><td>17001116</td><td>n/a</td></tr><tr><td>sem pin stub & oslash; Tapa de 12,7 Diámetro, Pin Estándar, Aluminio</td><td>Micro a Nano</td><td>10-002012-50</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon Microdiseccionadora de Puntas Finas Pinzas para el pulgar, Puntas Finas, 12,7 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120019</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí Shandon n.º 20, estéril, 4,5 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>28618256</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon Mango de hoja de bisturí de acero inoxidable</td><td>Thermo Scientific</td><td>5334</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Zeiss V20 Discovery</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

seccionamiento transversal de arroz maduro (oryza sativa l.) núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Los gránulos de almidón (SG) exhiben diferentes morfologías dependiendo de la especie de planta, especialmente en el endospermo de la familia Poaceae. El fenotipo de endospermo se puede utilizar para clasificar genotipos basados en el morfotipo SG utilizando el análisis microscópico electrónico de barrido (SEM). Los SG se pueden visualizar utilizando SEM cortando a través del núcleo (pericarpio, capas de aleurona y endospermo) y exponiendo el contenido organelar. Los métodos actuales requieren que el grano de arroz se incruste en resina plástica y se seccione con un microtomo o se incruste en una punta de pipeta truncada y se seccione a mano con una cuchilla de afeitar. El primer método requiere equipo especializado y requiere mucho tiempo, mientras que el segundo introduce una nueva serie de problemas dependiendo del genotipo del arroz. Las variedades de arroz calcáreo, en particular, representan un problema para este tipo de seccionamiento debido a la naturaleza friable de su tejido endospermo. Aquí se presenta una técnica para preparar secciones de granos de arroz translúcidas y calcáreas para microscopía, que requiere solo puntas de pipeta y una hoja de bisturí. La preparación de las secciones dentro de los límites de la punta de una pipeta evita que el endospermo del grano de arroz se rompa (para fenotipos translúcidos o "vítreos") y se desmorone (para fenotipos calcáreos). Usando esta técnica, se puede observar el patrón de células de endospermo y la estructura de los SG intactos.

Las secciones Nipponbare de tipo salvaje(Figura 2A)y ssg1 (Figura 2B)se examinaron bajo tres aumentos: 260x, 920x y 4200x. Esta técnica permite la preparación de secciones de calidad suficiente para observar toda la célula del endospermo(Figura 3A),gránulos compuestos de almidón(Figura 3B)y subgránulos individuales(Figura 3C). Los granos descascarillados tardan más en procesarse que los granos pulidos, ya que los cascos secos deben eliminarse por abrasión antes de seccionarse. Los granos calcáreos también tardan más en procesarse que los granos translúcidos pulidos, ya que se debe tener cuidado de no romper el núcleo durante la seccionamiento. Una sección de arroz debidamente preparada debe tener un grosor aproximado de 0,9 mm (Tabla 1) con una rotura mínima o nula del endospermo (Figura 1N) y capas intactas de pericarpio y aleurona (Figura 1O). La colocación incorrecta del bisturí en la punta de la pipeta cuando se secciona puede conducir a secciones 'astilladas'(Figura 1P). Del mismo modo, las imágenes de campo brillante de secciones transversales óptimas de ssg1 (Figura 1Q)demostraron capas intactas de endospermo, pericarpio y aleurona intactas y disponibles para su visualización(Figura 1R). Una sección de kernel calcáreo rota(Figura 1S)aún puede usarse para la visualización si el único propósito es observar los SG, pero el patrón de celdas de endospermo no será visible. Una sección rota puede ser difícil de manejar para el análisis. Se observó un mayor cizallamiento de las paredes celulares del endospermo en el tipo salvaje Nipponbare, ya que las células están más empaquetadas y son menos friables que los granos ssg1. No se observó cizallamiento de las células de endospermo en las secciones ssg1 y los gránulos de almidón compuesto están intactos.
La Figura S1 demuestra la fiabilidad de los resultados utilizando la técnica del "telescopio" para seccionar los granos de arroz. Líneas de arroz identificadas como productoras de granos translúcidos: línea híbrida de almidón resistente (RS) de tipo silvestre Xieyou 7954(Oryza sativa L. ssp. indica)12,13, 14 (Figura S1A)y mutante generado por cobalto RS11113 , 15(Figura S1B)produjeron secciones a través de las cuales la luz fue visible utilizando un estereomicroscopio. Las imágenes SEM correspondientes revelaron que estas líneas producen el fenotipo de endospermo de arroz "normal": gránulos de almidón poliédricos bien empaquetados. Los productores de granos calcáreos, la variedad comercial Yi-Tang16 (Figura S1C)y RS413,un mutante de RS11115 (Figura S1D),exhibieron secciones de grano blancas y opacas. Las imágenes SEM correspondientes mostraron una morfología marcadamente diferente en comparación con la línea de fondo RS translúcida de tipo salvaje: los gránulos de almidón eran redondos y poco empaquetados. El tipo salvaje Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Figura S1E) y su mutante, KMD1 (Kemingdao1), que expresan el gen Cry1Ab para inhibir la depredación de insectos17,18,19 ( FiguraS1F) exhibieron secciones y morfotipos de endospermo similares a las líneas RS translúcidas.
La técnica presentada aquí es óptima para preparar muestras de granos de arroz de tipo calcáreo para el análisis fenotípico, pero también proporciona ventajas para seccionar fenotipos translúcidos de granos de arroz20:cortar las muestras usando presión desde arriba reduce el riesgo de ruptura del endospermo y dislocación. Las muestras se pueden preparar fácilmente en cuestión de segundos (Tabla 2). Se analizaron múltiples genotipos utilizando esta técnica para probar su eficacia (Tabla 3). Como se muestra en la Figura S2,esta técnica se puede aplicar a semillas de otras especies. El modelo monocotiledónea Brachypodium distachyon produce semillas muy duras que contienen únicamente almidón B-gránulo21,que carecen de puroindolina A, una proteína que confiere suavidad a los gránulos de almidón22. Todavía era posible obtener una sección transversal intacta(Figura S2A). La obtención de una sección transversal intacta a partir de trigo blanco blando de invierno (SWWW) fue un desafío, pero se puede realizar (Figura S2B). Las semillas SWWW son altas en puroindolina A y grandes en comparación con las semillas de B. distachyon y los granos de arroz. Estas semillas se desmoronan con frecuencia cuando se seccionan usando el conjunto del telescopio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotipo</td>
			<td>Anchura media de la sección (μm) utilizando el ensamblaje del telescopio</td>
			<td>Ancho medio de sección (μm) seccionando a mano alzada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nipponbare (descascarillado)</td>
			<td>971.7 ± 152.4ab
</td>
			<td>1059.571 ± 394.2ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Xieyou 7954</td>
			<td>825,1 ± 128,3b
</td>
			<td>1306.187 ± 179.1a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>910.6 ± 165.0ab
</td>
			<td>1126.694 ± 395.3ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Las medias seguidas de las mismas letras no son significativamente diferentes en P &lt; 0,01 utilizando un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (n = 10). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software JMP 15.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Espesor medio de la sección del núcleo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotipo</td>
			<td>Tiempo medio(s)*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nipponbare (descascarillado)</td>
			<td>14,7 ± 1,36a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Xieyou 7954</td>
			<td>9,81 ± 0,98b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>11,9 ± 1,28c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*Uso del ensamblaje del telescopio.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Las medias seguidas de las mismas letras no son significativamente diferentes en P &lt; 0,01 utilizando un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (n = 10). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software JMP 15.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Tiempo medio de preparación de la muestra.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotipo</td>
			<td>Fondo</td>
			<td>Calidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nipponbare</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
			<td>Translúcido</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Grano de almidón de calidad inferior1 (ssg1)</td>
			<td>Nipponbare</td>
			<td>Calizo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Almidón resistente (RS) Xieyou 7954</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
			<td>Translúcido</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS111</td>
			<td>Xieyou 7954</td>
			<td>Translúcido</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>RS111</td>
			<td>Calizo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yi-Tang, 'Nueva Vida', marca Lujuren</td>
			<td>Xieyou 7954</td>
			<td>Calizo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Xiushui 11</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
			<td>Translúcido</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kemingdao1 (KMD1)</td>
			<td>Xiushui 11</td>
			<td>Translúcido</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Genotipos de arroz examinados en este estudio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig01.jpg"> Figura 1: Preparación de secciones transversales de arroz. (A) Núcleo de Nipponbare de tipo salvaje con cáscara intacta. (B). Núcleo colocado en un tapón de goma plano de cuatro pulgadas de diámetro. (C) Las cáscaras se eliminaron moliendo el grano entre dos tapones de goma de aplomo. (D) La cáscara se ha separado del grano de arroz. (E) Primer plano del grano de arroz descascarillado. El extremo embrionario está indicado. (F) Inserción del núcleo en la punta de la pipeta utilizando pinzas finas. (G) El núcleo se alojó en el extremo distal de la punta de la pipeta. (H) Inserción de la segunda punta de pipeta para inmovilizar el núcleo para la sección (el ensamblaje del 'telescopio'). (I) El grano de arroz se colocó cómodamente en el extremo distal de la punta de la pipeta. (J) Seccionamiento del grano de arroz dentro del ensamblaje. (K) Primer plano del corte de sección. (L) Una sección del grano encerrada por el anillo de plástico. (M) Primer plano de la sección transversal. (N) Sección transversal de tipo salvaje Nipponbare. (O) Primer plano del endospermo dentro de la sección Nipponbare de tipo salvaje. (P) Sección pobre y subóptima del núcleo nipponbare de tipo salvaje. (Q) Sección transversal del mutante nipónbaro ssg14. (R) Primer plano del endospermo dentro de la sección ssg1. (S) Sección pobre y subóptima de ssg1. Barra (paneles A, N-S) = 1 mm. El grano de arroz entero y las secciones se tomaron imágenes utilizando un estereomicroscopio con una cámara de zoom digital y luces de cuello de cisne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes SEM de secciones transversales del núcleo. (A) Nipponbare de tipo salvaje, un cultivar translúcido. Los gránulos de almidón compuesto se cementaron firmemente entre sí; (B) Mutante de Nipponbare ssg14, un fenotipo calcáreo. Los gránulos de almidón compuesto estaban empaquetados libremente y carecían de la naturaleza cementicia del morfotipo de almidón Nipponbare de tipo salvaje. Ampliación de izquierda a derecha: 260x, 920x y 4200x. La longitud de la barra se indica en los paneles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig03.jpg"> Figura 3: Anatomía microscópica SEM de una sección transversal del núcleo de Xiushui 11. (A) Una sola celda de endospermo está delineada en rojo. Aumento de 260x. (B) Un gránulo de almidón compuesto se delinea en rojo. Aumento de 920x. (C) Múltiples subgránulos de almidón están delineados en rojo. Aumento de 2250x. Las longitudes de las barras se indican en los paneles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura S1: Secciones transversales de otros genotipos de arroz preparados para SEM utilizando esta técnica. (A) Almidón resistente (RS) Xieyou 795412. (B) RS111, un mutante transparente de alto RS de 795413. (C) RS4, un mutante calcáreo de RS11115. (D) Yi-Tang, una variedad comercial de arroz con alto contenido de amilosa16. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. Aumento de 10x para imágenes de campo brillante. Barra blanca = 1 mm. Aumento de 2250x para imágenes SEM. Las longitudes de las barras se indican en los paneles. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig01.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Figura S2: La técnica es útil para otras semillas. (A) Sección transversal de falso bromo púrpura (Brachypodium distachyon L. accession Bd21) semilla. (B) Sección transversal de trigo blanco blando de invierno (Triticum aestivum L. cv. Augusta) semilla. Campo brillante, aumento de 20x. Barra = 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig02.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

Este protocolo permite la preparación de secciones transversales de semillas de cereales (por ejemplo, arroz) para el análisis de la morfología del endospermo y los gránulos de almidón mediante microscopía electrónica de barrido.

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Este protocolo permite que las semillas se corten intactas para que no se desmoronen, lo que permite la visualización de gránulos de almidón en cualquier semilla que pueda caber en una punta de pipeta. El cono de plástico maleable soporta la estructura nativa de los tejidos y órganos secos, por lo que este colector barato y fácil permite procesar muchas muestras en poco tiempo. Para pasar de la ventaja de la microscopía forense aquí, el almidón resistente, algo que todos estamos buscando, la accesibilidad de las enzimas a ese almidón crudo, la amilólisis, el índice glucémico y los picos de glucosa, estos son parámetros centrales para criar mejores variedades de arroz para combatir la diabetes tipo 2 en todo el mundo hoy en día.Y ahora es un gran placer presentarle al Dr. Kiah Barton. Barton es de nuestro laboratorio y utilizará la instalación de imágenes central de la facultad para mostrarle cómo se implementa esta técnica. Comience descascarillando los granos secos.Coloque un solo grano en un tapón de goma plano en un banco de trabajo y asegúrese de que este tapón permanezca estacionario. Use un segundo tapón de goma plano para desgastar el grano girándolo contra el primer tapón de goma, luego retire las cáscaras del grano, teniendo cuidado de no romper el endospermo ni moler las semillas demasiado agresivamente entre los dos tapones de goma. Retire las cáscaras restantes con pinzas finas e inserte un grano descascarillado individual en una punta de pipeta de plástico de 250 microlitros.Asegúrese de que el extremo embrionario del grano esté orientado hacia el extremo cónico de la punta de la pipeta. Inserte una segunda punta de pipeta de 250 microlitros para forzar el núcleo en la primera punta de pipeta y mantener el núcleo inmóvil durante la sección, teniendo cuidado de no dañar el núcleo ni doblar la segunda punta de pipeta. Coloque el conjunto de la punta de la pipeta plano en un banco de trabajo y manténgalo en su lugar con la mano.Con la otra mano, use una cuchilla de bisturí afilada para cortar a través del centro del grano, cortando el extremo de la punta de la pipeta. Corte hacia abajo a través del ensamblaje y luego oriente la hoja del bisturí verticalmente para que las dos nuevas caras expuestas de la sección de la mano sean paralelas. Luego use el bisturí para cortar secciones de un milímetro de grosor del grano de arroz.Para realizar la microscopía de luz reflejada, coloque las secciones transversales de arroz en un trozo de papel negro de calibre pesado. Obtenga imágenes de luz de las secciones transversales utilizando un microscopio estereoscópico con cuellos de cisne montados para una iluminación oblicua, utilizando al menos 10 veces el aumento. Las secciones de Nipponbare y ssg1 de tipo salvaje se examinaron bajo aumentos de 260 veces, 920 veces y 4, 200 veces.Cuando se prepararon adecuadamente, las secciones de arroz tenían aproximadamente 0,9 milímetros de grosor con una ruptura mínima del endospermo y capas intactas de pericarpio y aleurona. Esta técnica permite la preparación de secciones de calidad suficiente para observar toda la célula del endospermo, gránulos compuestos de almidón y subgránulos individuales. Los productores de granos translúcidos, como la línea híbrida de almidón resistente de tipo salvaje, Zhehui 7954 y el mutante RS111 generado por cobalto, produjeron gránulos de almidón poliédrico apretados, que es el fenotipo normal de endospermo de arroz.Las imágenes SEM de los productores de granos de tiza, la variedad comercial Ye Tang y RS4, mostraban gránulos de almidón que eran redondos y vagamente empaquetados. Xiushiu 11 de tipo salvaje y su mutante KMD1, que expresó el gen Cry1Ab para inhibir la depredación de insectos, tenían secciones y morfotipos de endospermo similares a las líneas de almidón resistente translúcido. Esta técnica se puede aplicar a semillas de otras especies.El modelo monocotiledónea, Brachypodium distachyon, produce semillas muy duras, pero aún así fue posible obtener una sección transversal intacta. Las secciones transversales intactas también se produjeron a partir de trigo de invierno suave y blanco. Este método de detección rápido y barato para mirar dentro de las estructuras biológicas se puede aplicar a patas de insectos, espigas de árboles de locus bean, espinos, espinas de peces o cualquier campo de microscopía forense que pueda beneficiarse de esta configuración de soporte de muestra.Después de realizar este protocolo, el recubrimiento por pulverización para electromicroscopía, la tinción con colorantes fluorescentes específicos y la aplicación de calcafluor para teñir un espesor de pared celular de beta glucano en líneas mutantes de avena y cebada son algunas formas rápidas de abordar el fitomejoramiento con detección rápida de fenotipos.

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