Name: Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a estudiar el ensamblaje de segmentos iniciales axonales en neuronas del hipocampo cultivadas primariamente. Este protocolo cuantitativo utiliza transfección e imágenes para analizar la estructura AIS y su función neuronal.

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Agradecemos al Dr. Gary Banker por su sugerencia sobre el protocolo de cultivo neuronal. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes, una subvención de los NIH y una cátedra (V.B.

NOTA: Este método de cultivo de neuronas del hipocampo de ratones postnatales de 0 días ANK3-E22/23f/f está adaptado del sistema de co-cultivo de glía/neurona de Gary Banker. Por lo tanto, es fundamental realizar todos los pasos después de la disección en una campana limpia utilizando herramientas esterilizadas. Este protocolo tarda hasta 1 mes. El flujo de trabajo se muestra en la figura 3. El protocolo sigue las pautas animales de la Universidad de Duke.
1. Preparación de cubrebocas y platos de chapado neuronal
<ol><li>Al menos una semana antes del día de cultivo, cargue los cubrebocas en el estante de cubrebocas y remoje en ácido nítrico (70% P /W) durante la noche (podría extenderse por días).</li>
	<li>Lave las tapas tratadas con ácido nítrico con agua destilada en una coctelera de baja velocidad en un frasco de vidrio 2 veces, 1 hora cada una.</li>
	<li>Incubar cubrebocas en KOH saturado disuelto en etanol 100% durante la noche. Agregue KOH en etanol hasta que ya no se disuelva.</li>
	<li>Repita el paso de lavado con agua destilada. Enjuague las tapas con etanol al 100% una vez durante 10 minutos.</li>
	<li>Transfiera los cubrebocas del estante a un vaso de precipitados de vidrio. Cubra el casto con papel de aluminio. Hornear las cubrebocas en un horno de 225 °C durante la noche para esterilizar las cubrebocas. (Los cubrebocas podrían almacenarse en el casto durante semanas).</li>
	<li>Coloque los cubrebocas en una placa de Petri y luego aplique 3-4 puntos de cera en el cubrebocas para servir como pies. Use una pipeta Pasteur para sumergir en cera hervida en una botella de vidrio. A continuación, toque rápidamente el cubrebocas para crear un punto. Una placa de Petri de 60 mm puede contener 4 cubrebocas. Una placa de Petri de 10 mm puede contener ~ 10 cubrebocas.</li>
	<li>2 días antes del día de cultivo, cubre los cubrebocas (el lado con los puntos de cera) con filtro esterilizado 1 mg/mL de poli-L-lisina en ácido bórico 0.1 M (pH 8.5) durante un mínimo de 6 horas y enjuague con agua 2 veces, 1 hora cada vez. Los cubrebocas permanecen en la misma placa de Petri.</li>
	<li>Añadir el medio de chapado (MEM suplementado con glucosa al 0,6% (peso/vol) y 10% (vol/vol) suero de caballo) a las placas lentamente sin molestar los cubrebocas. Coloque placas en la incubadora hasta el día de cultivo para sembrar neuronas.</li>
</ol>2. Preparación de platos de alimentación celular de glía (2 semanas antes del día de cultivo)
<ol><li>Diseccione la corteza de un cerebro postnatal de ratones de 1 día de edad y desprenda las meninges.</li>
	<li>Picar el tejido de la corteza tan finamente como sea posible con unas tijeras limpias en una placa de Petri limpia en un banco limpio.</li>
	<li>Transfiera el tejido picado a 12 mL de HBSS y agregue 1,5 mL de tripsina al 2,5% y DNasa al 1% (peso/vol). Incubar en un baño de agua de 37 °C durante 15 min, columpiarse cada 5 min. El tejido bien digerido se vuelve pegajoso y forma un gran grupo. Triturar 10-15 veces con una pipeta de 10 mL para descomponer el tejido y obtener una mejor digestión.</li>
	<li>Triturar el tejido bien digerido 10-15 veces con una pipeta de 5 mL hasta que la mayoría de los trozos desaparezcan y el medio se vuelva nublado. Pase a través de un colador celular para eliminar los trozos restantes y agregue 15 mL de medio de glía (Medio esencial mínimo (MEM) suplementado con glucosa (0.6% wt / vol), 10% (vol / vol) suero de caballo y Penicilina-Estreptomicina (1x) para detener la digestión.</li>
	<li>Centrifugar las células a 120 x g durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Resuspend el pellet celular con medio de glía fresca y semilla en platos de cultivo celular (aproximadamente 105 células/cm2).</li>
	<li>Reemplace el medio con un medio de glía fresca al día siguiente para eliminar las células no unidas.</li>
	<li>Alimente los platos de la glía cada 3-4 días con el medio fresco de la glía. Abofetee el matraz 5-10 veces con una mano para desalojar las células sueltamente unidas antes de cambiar de medio.</li>
	<li>Después de 10 días de cultivo, las células de la glía deben ser casi confluentes. Desprenda las células de la glía con la tripsina-EDTA del 0,25% y separe cerca de 105 células en un nuevo plato del cultivo celular de 60 milímetros. Las células restantes podrían congelarse para su uso futuro.</li>
	<li>3 días antes del día de cultivo, cambiar el medio de glía a medio de cultivo neuronal (Neurobasal-A Medium con 1x GlutaMAX-I y 1x suplemento B27).</li>
</ol>3. Cultivar neuronas del hipocampo
NOTA: Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente.
<ol><li>Diseccione 6-8 hipocampos de cachorros postnatales de 1 día de ratones ANK3-E22/23f/f con medio HBSS en una placa de Petri en la habitación templada. Picar el hipocampo con tijeras de disección a trozos más pequeños. Transfiera los hipocampos de la placa de Petri a un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Lavar los hipocampos 2x con 5 mL de HBSS en el tubo. Deje el hipocampo en 4.5 mL de 1x HBSS después del lavado.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de tripsina al 2,5% en 4,5 mL de HBSS e incubar en un baño de agua de 37 °C durante 15 minutos. Invierta el tubo cada 5 minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un grupo. Si es necesario, extienda la digestión durante 5 minutos más.</li>
	<li>Lavar los hipocampos con HBSS 3 veces durante 5 minutos cada una. No utilice una aspiradora para extraer el HBSS. Es muy fácil eliminar el hipocampo.</li>
	<li>Añadir 2 mL de HBSS después del lavado y pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces.</li>
	<li>Triturar el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego (el diámetro del abierto se reduce a la mitad) 10 veces. No vaya más allá de 10 veces, incluso si todavía quedan trozos. La sobreabosía mata a las neuronas.</li>
	<li>Descanse el tubo durante 5 minutos hasta que todos los trozos se establezcan en la parte inferior. Utilice suavemente una punta de pipeta de 1 mL para transferir el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a los platos de chapado (105 células/ plato de 60 mm). Añádalo directamente al medio de chapado preincubado y agite la placa suavemente.</li>
	<li>Repita el paso 3.6-3.7 con los fragmentos restantes hasta que la mayoría de los fragmentos hayan desaparecido.</li>
	<li>2-4 horas después de la siembra, revise los platos de chapado con un microscopio de luz. La mayoría de las neuronas deberían haberse unido al cubrebocas. Las celdas unidas son redondas y brillantes. Flip coverslips usando un fórceps de punta fina a los platos de alimentación de células de la glía con medio de cultivo neuronal precondicionado con los puntos de cera laterales mirando hacia abajo.</li>
	<li>Las neuronas pueden crecer en los platos de alimentación de células de la glía hasta por 1 mes. Alimentar a las neuronas cada 7 días con 1 mL de medio de cultivo neuronal fresco.</li>
	<li>Paso opcional: 1 semana después de la siembra, añadir arabinósido de citosina (1-β-D-arabinofuranosilcitosina) a una concentración final de 5 μM para frenar la proliferación glial.</li>
</ol>4. Interrupción de AIS por knockout de Ankyrin-G en la etapa anterior del desarrollo de la neurona
<ol><li>En 3 div (día in vitro),voltear las cubiertas con puntos de cera lado mirando hacia arriba a un plato alimentador de células de glía con medio de cultivo neuronal acondicionado.</li>
	<li>Mezcle 0,25 μg de ADN Cre-BFP con 0,5 μg de ADN ankyrin-G-GFP (WT/mutante) en un tubo de 1,7 mL para transfectar 4 cubrebocas (~ 2:1 proporción del número de copias de ADN). Agregue 100 μL de medio de cultivo (por ejemplo, Opti-MEM), mezcle y descanse en un rack. Si sólo se transfecta Cre-BFP, la columna vertebral del plásmido GFP se utiliza para igualar la cantidad total de ADN.</li>
	<li>Mezcle 3 μL de reactivo de transfección (por ejemplo, Lipofectamina 2000) (~ 3 veces de ADN) con un medio de cultivo de 100 μL en un nuevo tubo de 1,7 mL. Incubar durante 5 minutos en RT.</li>
	<li>Mezclar 100 μL de solución de ADN de la etapa 4.2 con 100 μL de reactivo de transfección de la etapa 4.3. Descanse durante 5-10 minutos en un estante.</li>
	<li>Agregue 50 μL de mezcla de ADN del paso 4.4 justo en la parte superior de cada cubrebocas insertando la punta justo debajo del medio sin tocar los cubrebocas. Pipetee lentamente para evitar la propagación de la mezcla de ADN.</li>
	<li>Lleve lentamente el plato de vuelta a la incubadora e incube durante 30-45 minutos.</li>
	<li>Voltee las cubiertas de nuevo al plato alimentador de glía casera con puntos de cera hacia abajo y vuelva a colocar el plato en la incubadora.</li>
</ol>5. Cuantificación del segmento inicial del axón
<ol><li>Fijar las neuronas en 7-10 div y manchar con marcador AIS siguiendo el protocolo de inmunocitoquímica estándar para la proteína de interesante.</li>
	<li>Recoger imágenes fluorescentes con microscopía deseada.<ol>
<li>Tome las secciones de la serie Z para recoger la señal de todo el AIS. Mantenga la misma profundidad Z para todas las imágenes.</li>
		<li>Ajuste la intensidad del láser para alcanzar el mejor rango dinámico de intensidad de píxeles.</li>
		<li>Asegúrese de que todas las imágenes AIS se toman en la misma configuración del microscopio.</li>
		<li>Compruebe siempre la señal de Cre-BFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación de AIS<ol>
<li>Imagen abierta con Fiji (https://fiji.sc).</li>
		<li>Generar la máxima proyección de imágenes de la serie Z.</li>
		<li>Reste la señal de fondo de coverslip vacía de la imagen.</li>
		<li>Dibuje una línea a lo largo del AIS. El ancho de la línea debe cubrir completamente el AIS. Comience la línea antes de que la señal AIS se eleve sobre el fondo y pare después de que caiga al fondo.</li>
		<li>Mida la intensidad media de píxeles solo la línea y exporte a una hoja de cálculo (se necesitan ~ 10-15 AISs).</li>
		<li>Genere la curva de intensidad media de AIS utilizando el script MATLAB adaptado de Berger et al.15.</li>
		<li>Para cada experimento, incluya Cre solamente y Cre más las neuronas transfectadas de ankyrin-G del tipo salvaje 480 kDa como controles negativos y positivos para asegurarse de que el knockout de AIS sea la eficacia y el rescate sea acertado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El montaje de AIS está organizado por 480 kDa ankyrin-G. Sin embargo, la anquirona-G tiene isoformas más cortas que pueden apuntar al AIS de las neuronas de tipo salvaje, lo que puede conducir a la dificultad en la interpretación de los análisis de estructura-función del ensamblaje de AIS. Aquí presentamos un método utilizando neuronas de ratones ANK3-E22/23-flox que permite el estudio del ensamblaje de novo del AIS. Al transfectar con Cre-BFP a 3 div, eliminamos todas las isoformas endógenas de la anq...

El segmento inicial del axón se encuentra en el axón proximal en la mayoría de las neuronas vertebradas. Funcionalmente, AIS es donde se inician los potenciales de acción debido a la alta densidad de canales de sodio bloqueados por voltaje en esta región. Los AIS de algunas neuronas excitatorias también son atacados por interneuronas inhibitorias a través de la formación de sinapsis GABAérgicas1,2,3. Por lo tanto, AIS es un sitio crítico para integrar la señalización celular y modular la excitabilidad de las neuronas. AIS es normalmente 20-60 μm de longitud y situado dentro de 20 μm del cuerpo celular. La longitud y posición de AIS varía en las neuronas a través de las regiones del cerebro, así como en diferentes etapas de desarrollo de la misma neurona4,5. La evidencia acumulada sugiere que la composición y la posición del SIA son dinámicas en respuesta al cambio de la actividad neuronal4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G es el organizador maestro de AIS. 480 kDa ankyrin-G es una proteína adaptadora asociada a la membrana que se une directamente a los canales de sodio bloqueados por voltaje, así como a otras proteínas AIS importantes, incluidos los canales beta4-spectrin, KCNQ2/3 que modulan la actividad del canal de sodio8,9,y 186 kDa neurofascin, un L1CAM que dirige las sinapsis GABAérgicas al AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G comparte dominios canónicos de ankyrin encontrados en la isoforma corta de ankyrin-G de 190 kDa (repeticiones DE ANK, dominio de unión a spectrin, dominio regulador), pero se distinguen por un exón gigante que se encuentra solo en vertebrados y se expresa específicamente en neuronas(Figura 1A)11,12. El dominio específico de la neurona ankyrin-G de 480 kDa (NSD) se requiere para la formación de AIS12. La ankyrin-G de 190 kDa no promueve el ensamblaje de AIS ni se dirige a AIS en neuronas ankyrin-G-null12. Sin embargo, 190 kDa ankyrin-G se concentra en el AIS que contiene 480 kDa ankyrin-G12. Esta capacidad de la anquirina-G de 190 kDa para apuntar a AIS premontado de neuronas de tipo salvaje ha sido una fuente de confusión en la literatura y ha ralentizado la apreciación de las funciones especializadas críticas de la anquirina-G de 480 kDa en el ensamblaje de AIS. Por lo tanto, es fundamental estudiar el ensamblaje de AIS en neuronas ankyrin-G-null que carecen de un AIS preensamblado.
Aquí, presentamos un método para estudiar el ensamblaje y la estructura del AIS utilizando neuronas hippocampales cultivadas de ratones ANK3-E22/23-flox que elimina todas las isoformas de ankyrin-G13 (Figura 1B). Transfectando neuronas con una construcción Cre-BFP antes de que se ensase el AIS, generamos neuronas deficientes en anquirina-G que carecían completamente de un AIS(Figura 1B, Figura 2). El ensamblaje de AIS se rescata completamente después de la co-transfección del plásmido de anquirina-G-GFP de 480 kDa con un plásmido Cre-BFP. Este método proporciona una manera de estudiar el ensamblado AIS en un entorno AIS no premontado. También modificamos el sistema de co-cultivo de glía-neurona de Gary Banker sin usar antibióticos, previamente diseñado para neuronas embrionarias de día 18, para su aplicación a neuronas de ratón postnatales y adaptamos un método de cuantificación AIS a las mediciones promedio de AIS de múltiples neuronas para normalizar la variación de AIS14,15.

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18mm cubreobjetos (1.5D)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa ankyrin-G-GFP</td><td>Addgene</td><td>#31059</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsina sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa ankyrin-G-GFP</td><td>hecho en laboratorio</td><td>Proporcionar a pedido</td><td></td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/f ratones</td><td>JAX</td><td>Nº de inventario: 029797</td><td>B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;</td></tr><tr><td>B27 Complemento alimenticio sin sérum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células con malla de 70 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos cerámicos</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgene</td><td>#128174</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>MEM con Earle' Sales de S y L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nítrico 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de las neuronas del hipocampo cultivadas primarias para estudiar el ensamblaje de los segmentos iniciales axón

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Los segmentos iniciales de axones neuronales (AIS) son sitios de iniciación de potenciales de acción y han sido ampliamente estudiados por su estructura molecular, ensamblaje y plasticidad dependiente de la actividad. Ankyrin-G gigante, el organizador principal de AIS, asocia directamente con el voltaje membrana-que atraviesa el sodio bloqueado (VSVG) y los canales del potasio (KCNQ2/3), así como el neurofascin 186 del kDa, una molécula de la adherencia de célula de L1CAM. Ankyrin-G gigante también ata a y recluta las moléculas citoplásmicas de AIS incluyendo beta-4-spectrin, y las proteínas microtubule-obligatoria, EB1/EB3 y Ndel1. Ankyrin-G gigante es suficiente rescatar la formación de AIS en neuronas deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G también incluye una isoforma más pequeña de 190 kDa situada en las espinas dendríticas en vez del AIS, que es incapaz de apuntar al AIS o de rescatar el AIS en neuronas ankyrin-G-deficientes. Aquí, se describe un protocolo utilizando neuronas del hipocampo cultivadas de ANK3-E22/23-flox ratones, que, cuando se transfecta con Cre-BFP exhiben la pérdida de toda la isoforma de la anquirina-G y deteriorar la formación de AIS. Combinado un sistema modificado de glía de Banker / neurona co-cultivo, hemos desarrollado un método para transfectar ankyrin-G neuronas nulas con un 480 kDa ankyrin-G-GFP plásmido, que es suficiente para rescatar la formación de AIS. Además, empleamos un método de cuantificación, desarrollado por Salzer y sus colegas para hacer frente a la variación en la distancia AIS de los cuerpos celulares neuronales que se produce en los cultivos de neuronas del hipocampo. Este protocolo permite realizar estudios cuantitativos del ensamblaje de novo y del comportamiento dinámico del AIS.

Un conjunto completo de experimentos debe incluir la transfección de Cre-BFP solamente como control negativo, Cre-BFP más la co-transfección de ankyrin-G de 480 kDa como control positivo y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control sólo de Cre-BFP, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores AIS, incluyendo anquirina-G (ankG), beta4-espectrina (β4), neurofascina (Nf) y canales de sodio bloqueados por voltaje (VSVG) (Figura 4A)<sup class="xr...

Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Este protocolo se utiliza para estudiar cuantitativamente el ensamblaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS preensamblado debido a la ausencia de una anquilona-G gigante. Para empezar, diseccione de seis a ocho hipocampos de postnatal, cachorros de un día de edad con medio HBSS en una placa de Petri. Picar los hipocampos con tijeras de disección en trozos más pequeños, y transferirlos desde el plato a un tubo de 15 mililitros.Lave el hipocampo dos veces con cinco mililitros de HBSS y déjelos en 4.5 mililitros de HBSS después del lavado. Agregue 0.5 mililitros de tripsina al 2.5% en 4.5 mililitros de HBSS e incube en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada cinco minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un grupo.Si es necesario, extienda la digestión durante cinco minutos más. Lave los hipocampos con HBSS tres veces durante cinco minutos por lavado. Después del lavado, añadir dos mililitros de HBSS y pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces.Triturar el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego 10 veces, y descansar el tubo durante cinco minutos hasta que todos los trozos se establecen en el fondo. Repita la trituración con los trozos restantes hasta que la mayoría de ellos hayan desaparecido. Luego, use una punta de pipeta de un mililitro para transferir suavemente el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a los platos de chapado.Añadirlo directamente al medio de chapado preincubado y agitar la placa suavemente. Dos a cuatro horas después de la siembra, revise los platos de chapado con un microscopio de luz. La mayoría de las neuronas deben haber unido a la resbalón de la cubierta.Usando un fórceps de punta fina, voltee los resbalones de la cubierta a los platos del alimentador de células gliales que contienen un medio de cultivo neuronal precondicionado con los puntos de cera hacia el lado hacia abajo. Las neuronas pueden crecer en los platos de alimentación de células gliales hasta por un mes. Alimentar a las neuronas cada siete días con un mililitro de medio de cultivo neuronal fresco.En el tercer día in vitro, voltear la cubierta se desliza con el lado del punto de cera hacia arriba en un plato alimentador de células gliales con medio de cultivo neuronal acondicionado. Mezcle 0,25 microgramos de ADN CRE BFP con 0,5 microgramos de ADN ankyrin-G GFP en un tubo de 1,7 mililitros para transfectar cuatro resbalones de cubierta. Añadir 100 microlitros óptimos.A continuación, mezclar el tubo y descansado en un bastidor. Si sólo se transfecta cre BFP, la columna vertebral plásmica GFP se utiliza para que coincida con la cantidad total de ADN. Mezcle tres microlitros de reactivo de transfección con 100 microlitros de óptimo en un nuevo tubo de 1,7 mililitros e incube el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, mezcle 100 microlitros del ADN previamente mezclado con 100 microlitros de mezcla de reactivos de transfección y déjelo durante cinco a 10 minutos en un estante. Agregue 50 microlitros de la mezcla de ADN en la parte superior de cada resbalón de la cubierta insertando la punta justo debajo del medio sin tocar los resbalones de la cubierta. Pipetee lentamente para evitar la propagación de la mezcla de ADN.Lleve lentamente el plato de vuelta a la incubadora y déjelo allí durante 30 a 45 minutos. Voltear la cubierta se desliza de nuevo al plato de alimentación glial de casa con el lado del punto de cera hacia abajo y poner el plato de nuevo en la incubadora. Para la cuantificación de AIS, abra las imágenes de la serie Z en Fiji y genere una proyección máxima de imágenes.Después de restar la señal de fondo de deslizamiento de la cubierta vacía de la imagen, dibuje una línea a lo largo del AIS, asegurándose de que el ancho de la línea cubra completamente el AIS. Comience la línea antes de que la señal AIS se eleve sobre el fondo y pare después de que caiga al fondo. Mida la intensidad media de píxeles a lo largo de la línea y expórtela a una hoja de cálculo.A continuación, ejecute un script MATLAB para generar la figura final. El experimento debe incluir cre-BFP sólo transfección como control negativo, Cre-BFP más 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection como control positivo, y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control de Cre-BFP solamente, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores de AIS, incluyendo ankyrin-G, beta 4 spectrin, neurofascin, y canales de sodio bloqueados voltaje.En contraste, Cre y 480 kilodalton ankyrin-G co-transfected neuronas han montado completamente AIS, que se demuestra por la presencia de marcadores AIS. Es importante confirmar la calidad del cultivo a través de la comparación con los platos no transfectados. Las neuronas no saludables tienden a mostrar una estructura anormal de AIS, como AIS descontinuado o ectópico.Para evaluar cómo una mutación humana del desorden del neurodevelopmental del ankyrin-G afecta a la asamblea del AIS, la intensidad media del AIS fue trazada del soma al axón distal. Las proteínas enriquecidas con AIS normalmente muestran un rápido aumento de la señal del axón proximal y una disminución lenta de la señal al axón distal. Cuando se alinea con el AIS no transfectado, la curva mutante es más ancha y el pico de la curva es menor, lo que sugiere un cambio de estructura de AIS.El tipo salvaje ankyrin-G ensambló AIS alineado estrechamente con el no transfectado.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

La disección y el crecimiento de las células de un área del cerebro individuales facilita la investigación de los parámetros celulares y fisiológicos. Se describe un método para el cultivo de células primarias que produce neuronas enriquecido las culturas en un ambiente libre de suero.

Cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratas recién nacidas P0

Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

El video muestra un método para cultivar neuronas de hipocampos murinos. Inicialmente, los hipocampos se someten a una digestión enzimática para descomponer la matriz de tejido extracelular. Posteriormente, el tejido digerido se interrumpe mecánicamente para aislar las neuronas individuales. Finalmente, estas neuronas se cultivan en células alimentadoras gliales.

Una técnica para cultivar neuronas del hipocampo de ratón

Este video ilustra un método para establecer un cocultivo indirecto neurona-astrocito utilizando un enfoque compartimentado. En esta configuración, las neuronas y los astrocitos están separados espacialmente, pero comparten un medio condicionado. Los factores neurotróficos liberados por los astrocitos promueven la diferenciación neuronal y la formación de conexiones sinápticas, lo que sugiere interacciones neurona-glía.

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Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Los cultivos de baja densidad de neuronas primarias del hipocampo generalmente requieren una capa alimentadora de glía para suministrar factores neurotróficos y mantener la longevidad. Describimos aquí un método simplificado para cultivar neuronas de ultra baja densidad en cubreobjetos de vidrio en presencia de una capa alimentadora de neuronas de alta densidad, lo que facilita la investigación de mecanismos neuronal-autónomos específicos.

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

Aquí se presenta un protocolo para la generación espontánea de neuroesferas enriquecidas en células progenitoras neuronales a partir de neuronas chapadas de alta densidad. Durante el mismo experimento, cuando las neuronas se platean a una densidad más baja, el protocolo también resulta en cultivos prolongados de neuronas de rata primaria.

Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.

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Un stock congelado de neuronas listo para usar es una herramienta poderosa para evaluar las funciones sinápticas. Aquí, introducimos un cultivo primario fácil de baja densidad a partir de material congelado utilizando una placa de 96 pocillos.

Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando existencias congeladas de neuronas embrionarias del hipocampo

Aprenda a estudiar el ensamblaje de segmentos iniciales axonales en neuronas del hipocampo cultivadas primariamente. Este protocolo cuantitativo utiliza transfección e imágenes para analizar la estructura AIS y su función neuronal.

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

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