Name: Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Aprende a cuantificar el virus de la rabia en estructuras cerebrales bovinas mediante qRT-PCR y transcripción in vitro. Este método permite detectar cargas virales bajas en muestras de ganado.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Forestales y Ganaderas (INIFAP). Agradecemos a Jerzayn Fraustro Esquivel su colaboración en el desarrollo del video asociado a este documento.

Este estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con las recomendaciones para el uso de animales proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Muestras
<ol><li>Utilice diferentes áreas del cerebro diseccionadas de 6 cerebros bovinos diferentes positivo para el análisis RT-PCR.</li>
</ol>2. Anticuerpos fluorescentes directos (ADF) para confirmar la rabia
NOTA: La detección del antígeno antirrábico por DFA es un método cualitativo para determinar la presencia de la nucleoproteína de la rabia utilizando anticuerpos etiquetados con fluoresceína. La prueba se realizó utilizando el protocolo proporcionado por Dean et al. (1966)20, como se describe a continuación.
<ol><li>Haga dos impresiones de cada tejido diseccionado de diferentes estructuras cerebrales en un deslizamiento estéril de aproximadamente 15 mm de diámetro. Utilice un aplicador de madera para untar una porción de aproximadamente 3 mm3 del tejido en el tobogán estéril. Para crear el frotis, presione suavemente el aplicador de madera contra el tobogán manualmente.</li>
	<li>Corrija las diapositivas de frotis de muestra sumergiendo las diapositivas en acetona 100% durante 1 h a -20 °C. Después de la incubación, seque los toboganes en un paño seco a 21 °C durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 50 μL del anticuerpo antinúcleoproteína etiquetado con fluoresceína a cada frotis cerebral a una dilución de 1:10 dispensando a través de una jeringa.</li>
	<li>Incubar los toboganes con el conjugado en una cámara húmeda a 37 °C durante 1 h.</li>
	<li>Después de la incubación, lave los toboganes dos veces con agua y con PBS para eliminar el exceso de conjugar. Deje que las diapositivas se sequen a 21 °C. Borre cuidadosamente para eliminar el exceso de líquido y luego seque brevemente al aire antes del montaje.</li>
	<li>Agregue una gota de 50% de glicerina de fosfato para cubrir la superficie de la sección, y luego cubra con un coverlip. Observe las secciones bajo un microscopio de epifluorescencia a una ampliación de 40x.<ol>
<li>Procesar y observar los controles positivos y negativos (control positivo: cerebros de ratón inoculados con RABV; controles negativos: cerebros bovinos negativos rabv) de la misma manera que las muestras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generar un control positivo para RT-PCR
<ol><li>Obtenga células BHK-21 del banco de germoplasma. Utilice celdas hasta el pasaje70 para replicar la cepa RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) usando el pasaje 2.</li>
	<li>Mantener y propagar células BHK-21 en botellas que contengan un medio esencial mínimo (MEM) complementado con un 10% de suero de becerro fetal (FCS) a 37 °C en presencia de CO2 (5%) y en condiciones húmedas. Cultivar las células en frascos de cultivo de 25 cm2 hasta que alcancen el 80% de confluencia y luego la subcultura.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las células y lave el frasco con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Inocular la cultura con 105 TCID/mL de cepa RABV ERA. Incubar el inoculum viral durante 2 h bajo agitación constante a 37 °C en presencia de CO2 (5%) y en condiciones húmedas.</li>
	<li>Retire el medio de infección y agregue mem suplementado con 5% (bovino fetal sérico) SFB. Incubar durante 72 h a 37 °C en presencia de CO2 (5%) en condiciones húmedas.</li>
	<li>Cosecha RABV 3 días después de la inoculación cuando las células exhiben efectos citopáticos. Congele las células infectadas y luego descongelarlas a 4 °C para lilas. Recoge el medio de la botella y luego coloca las células en un tubo centrífuga para una centrifugación a 1.050 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Almacene los sobrenadantes de RABV a -80 °C y prepare alícuotas de trabajo para almacenarlos a -70 °C.</li>
	<li>Intracerebrally inocula el virus obtenido en el paso anterior en ratones CD1 hembra de 21 días de edad. Utilice una jeringa de 1 ml para inocular 50 μL de soluciones que contengan 106 MICLD50 (dosis letal de cultivo infeccioso del ratón 50 %) dosis en ratones22.</li>
</ol>4. Extracción de ARN
NOTA: El ARN total se extrajo directamente de cerebros bovinos utilizando un método de extracción orgánica de acuerdo con el siguiente protocolo.
<ol><li>Utilice 100 mg de tejido cerebral de cada estructura anatómica para extraer ARN total utilizando un reactivo disponible comercialmente que contiene isoticianato de guanidium.</li>
	<li>Homogeneizar manualmente un total de 100 mg de tejido de cada estructura en 1 ml del reactivo de isotiocyanato de guanidium mediante vórtice utilizando un homogeneizador Dounce con un pequeño pestle dentro del microtubo durante 15 s a máxima velocidad.</li>
	<li>Incubar las muestras en hielo durante 5 min, y luego añadir 200 μL de cloroformo. Mezcle las muestras vigorosamente durante 15 s, incubar en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera la fase acuosa a un tubo limpio y agregue 500 μL de alcohol isopropílico. Incubar las muestras durante 15 min a 21 °C.</li>
	<li>Centrífuga las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante acuoso por pipeteo. El ARN aislado estará presente como pellet en el tubo.</li>
	<li>A continuación, lave el pellet de ARN con 1 ml de etanol al 75% por pipeteo y centrífuga a 7500 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN a temperatura ambiente (21 °C). A continuación, diluya el pellet en 50 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Determine la concentración y la calidad del ARN a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Almacene el ARN a -80 °C hasta su uso.</li>
	<li>Retire el ADN de las muestras de ARN por digestión con DNase I. Añadir 2 U de DNase I por 1 μg de ARN extraído en el paso anterior. A continuación, agregue 5 μL de búfer de reacción de 10x y luego incuba a 37 °C durante 30 min. Inactivar la DNase I añadiendo 1 μL de EDTA a la mezcla seguida de incubación durante 10 min a 65 °C.</li>
</ol>5. síntesis de cDNA y PCR
<ol><li>Sintetizar cDNA de primera fila usando oligo dT y transcriptasa inversa. Por cada 1 μg de ARN, agregue 1 μL de oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mezcla dNTP de 10 mM y agua destilada sin nucleasa a un volumen final de 12 μL. Incubar la mezcla a 65 °C durante 5 min.</li>
	<li>Enfríe la mezcla de reacción a 4 °C. Centrífuga el tubo durante 30 s a 1.050 x g,y luego agregue 4 μL de amortiguador de reacción, 2 μL 0,1 M TDT y 1 μL de inhibidor de la ribonucleasa (40 U/μL).</li>
	<li>Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 min, y luego añadir 1 μL de transcriptasa inversa (200 U). A continuación, incubar la mezcla de reacción durante 50 min a 37 °C, y luego inactivar la reacción a 70 °C durante 15 min.</li>
	<li>Almacene el cDNA a -20 °C antes de su uso. NOTA: Para verificar la calidad del cDNA sintetizado, realice la amplificación de un fragmento de 761 bp del gen RABV N antes de realizar la síntesis in vitro. Utilice el protocolo descrito por Loza-Rubio et al.11 como se describe en el paso 5.5 a continuación.</li>
	<li>Realice PCR utilizando taq DNA polymerasa en las siguientes condiciones. Realice la reacción configurada de la siguiente manera: 10x tampón Taq que contiene 20 mM MgCl2,0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polimerasa, 10 μM de cada imprimación (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ y SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, y agua ultrapura a un volumen final de 50 μL.</li>
	<li>Realice la amplificación en un termociclo utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de 95 ° C para 30 s, 60 ° C para 30 s, y 72 ° C durante 1 min; un ciclo de 72 °C durante 7 min.</li>
	<li>Evaluar la presencia de los productos PCR de 761 bp utilizando un gel de agarose del 1%.</li>
</ol>6. Transcripción in vitro
NOTA: La transcripción in vitro genera ARNM de un gen objetivo. Utilice un par de imprimación que amplíe el gen COMPLETO RABV N y uno que se utilice como control positivo para el ensayo qRT-PCR. Estas imprimaciones están diseñadas para amplificar el gen RABV N completo y para añadir un promotor que reconozca la polimerasa T7 (TAATACGACTCACTATAG).
<ol><li>Para amplificar todo el gen N RABV, utilice las imprimaciones Trans-Nrab forward (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) y reversa (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) y un kit de PCR de alta fidelidad.<ol>
<li>Para cada reacción, prepare una mezcla maestra de PCR añadiendo a un búfer de reacción de tubo PCR limpio 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2,10 mM dNTPs, 10 μM de cada imprimación, 0,5 U de polimerasa de alta fidelidad, 1,5 μL de cDNA (preparado en el paso 5) y agua ultrapura a un volumen final de 50 μL.</li>
		<li>Utilice un termociclo establecido en las siguientes condiciones de amplificación: 94 °C durante 1 min; 4 ciclos de 94 °C durante 1 min, 40 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min; 35 ciclos de 94 °C durante 1 min, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min; extensión final de 72 °C durante 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para utilizar el producto PCR como plantilla para la síntesis in vitro y eliminar componentes de la reacción enzimática del paso 6.1.2, purifique el producto PCR utilizando un kit concentrador basado en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y, a continuación, cuantifique utilizando un espectrofotómetro.</li>
	<li>Para la síntesis de ARN, utilice un kit de transcripción in vitro con la siguiente mezcla de reacción: 5 μL T7 Transcripción 5x buffer, 1.9 μL de cada nucleótido de trifosfato, 10 μg de ADN purificado rabv N DNA VP2, y 2.5 μL de la mezcla enzimática. A continuación, incubar la mezcla a 37 °C durante 4 h. A continuación, añadir 1 μL de 1 U/μg RNase-Free DNase a la mezcla de reacción e incubar durante 15 min a 37 °C para eliminar la contaminación del ADN.</li>
	<li>Purifique el ARN transcrito in vitro y concentre el arne y luego concéntrelo usando fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1).</li>
	<li>Resuspend el pellet de ARN purificado en 70 μL de Tampón TE, y luego almacenar a -80 °C hasta su uso.</li>
	<li>Repita el protocolo PCR desde el paso 6.1 hasta obtener aproximadamente 5 μg de producto PCR. Después de la purificación y concentración, el ARNM del gen N transcrito in vitro estará presente a una concentración de 4.711 μg/μL.</li>
	<li>Confirme que el ARNm transcrito in vitro corresponde al gen N siguiendo el paso 5 de este protocolo y utilícelo como un control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR).</li>
</ol>7. Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR)
<ol><li>Para qRT-PCR, utilice una transcripción de ARNm in vitro que codifica el gen N completo como un control positivo junto con un kit comercial qRT-PCR de un solo paso utilizando sondas de hibridación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice la sonda y las imprimaciones descritas por Carneiro et al. (2010)23 para detectar una región conservada del gen RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, y BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).</li>
	<li>Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmico: 1 ciclo de 50 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min; 40 ciclos de 95 °C para 15 s y 50 °C durante 30 s.</li>
</ol>8. Curva de calibración o curva estándar
<ol><li>Realice diluciones en serie del ARNm transcrito in vitro canalizando en serie 1 μg/μL de ARNm en tubos hasta que se obtengan seis diluciones de decuple. Prepare tubos a un volumen de 100 μL en triplicato para su uso en la creación de la curva estándar. Realice qRT-PCR como se describe en el paso 7.</li>
	<li>Realice qRT-PCR en un termociclo con un rotor procesando las diversas muestras cerebrales simultáneamente con las reacciones en ejecución para crear la curva estándar y utilizar controles positivos, controles negativos y sobrenautas aislados del cultivo celular.</li>
	<li>Para evaluar el límite de detección, eficacia de la prueba y sensibilidad de la prueba, utilice una curva estándar en triplicado en las mismas condiciones.</li>
</ol>9. qRT-PCR de muestras biológicas
<ol><li>Para la detección del gen RABV N, utilice el ARN a partir de muestras de campo, controles positivos, controles negativos y sobrenatantes de cultivo celular para realizar qRT-PCR utilizando el kit de PCR descrito en el paso 7.</li>
	<li>Para determinar el número de copias del genoma rabv presentes en las muestras cerebrales bovinas, obtenga datos de Tc de la curva estándar y muestras biológicas y de las interpoladas desde la ecuación de la curva de calibración.</li>
</ol>

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<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Estudios anteriores han demostrado que DFA sólo puede detectar RABV dentro de los siete días posteriores a la lectura de la muestra a temperatura ambiente (21 °C)14. Por el contrario, este trabajo demostró que la sensibilidad de RT-PCR comienza a disminuir después de que las muestras han estado expuestas a la temperatura ambiente durante 12 días. Por lo tanto, el genoma rabv puede ser detectado por qRT-PCR en muestras expuestas a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta 23 días. Esto demues...

La rabia puede ser confirmada ante mortem y post mortem por diversas técnicas que permiten la detección de ácidos nucleicos virales en el cerebro, la piel, la orina o la saliva1. La detección del gen de la nucleoproteína del virus de la rabia(N)se utiliza principalmente para el diagnóstico de rabia mediante pruebas moleculares. Este gen también se utiliza para el genotipado viral. La rabia se puede diagnosticar en animales utilizando cualquier porción del cerebro afectado; sin embargo, para excluir la posibilidad de rabia, tejido de al menos dos regiones en el cerebro debe ser probado2. Existen varios métodos de diagnóstico para la detección de la rabia en animales; sin embargo, la prueba directa de inmunofluorescencia sigue siendo la técnica de referencia estándar3. Otras pruebas incluyen pruebas biológicas que incorporan inoculación del ratón, infección en el cultivo de tejidos y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)4. Todas estas técnicas son recomendadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) para el diagnóstico de rabia en humanos y animales, respectivamente5.
Las técnicas de detección y amplificación de ácidos nucleicos han revolucionado el diagnóstico de la rabia en los últimos años6 y estas técnicas desempeñan un papel importante en el diagnóstico ante mortem de la rabia humana. Se han evaluado varias pruebas basadas en PCR para complementar las pruebas convencionales para diagnósticos de rabia ante mortem y post mortem 7,8,9,10. La mayoría de los ensayos apuntan al gen de la nucleoproteína viral de la rabia para la amplificación, que es la región más conservada en el genoma viral1,11. En los últimos 20 años, se han desarrollado varios ensayos moleculares para diagnosticar rabv, y algunos de estos ensayos se han utilizado para la caracterización del virus. La mayoría de los ensayos tienen como objetivo detectar genes conservados dentro del genoma viral, más comúnmente mediante el uso de ensayos convencionales o cuantitativos de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)12,13.
La PCR es una técnica diagnóstica altamente sensible que puede detectar el genoma de un patógeno dado dentro de los tejidos, incluso cuando estos tejidos están descompuestos. Utilizando enfoques basados en PCR, se pueden detectar cantidades mínimas de un agente infeccioso en una muestra clínica a través de la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de ADN14. qRT-PCR que incorpora sondas fluorescentes (por ejemplo, TaqMan) o tintes de unión al ADN (por ejemplo, SYBR Green) se ha utilizado en ensayos para diagnosticar RABV tanto ante- como post- mortem con alta sensibilidad; sin embargo, este enfoque requiere equipo especializado. Para superar esta limitación, se ha sugerido la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), basada en su bajo costo, simplicidad y características deseables para la detección de RABV. Este ensayo es particularmente importante, ya que puede utilizarse en los países en desarrollo15.
qRT-PCR se basa en la detección y cuantificación de una molécula, donde los aumentos de señal fluorescente son en proporción directa a la cantidad de producto PCR en una sola reacción. A medida que aumenta el número de copias del objetivo de ácido nucleico, también lo hace la fluorescencia. Los tintes intercalantes no específicos, como el tinte de unión al ADN verde SYBR o las sondas de oligonucleótido específicas de la secuencia que transportan un fluoróforo y un quencher, se utilizan comúnmente para proporcionar la lectura fluorescente en qRT-PCR. Este ensayo ofrece ventajas sobre rt-PCR convencionales que incluyen un tiempo de prueba más corto (2-4 h), menor riesgo de contaminación debido al sistema de tubo cerrado (falta de manipulación post-PCR de productos amplificados), y la capacidad de detectar diferentes objetivos simultáneamente16. qRT-PCR se puede utilizar para diagnosticar la rabia ante mortem a partir de saliva y otras muestras. Este ensayo también se puede utilizar como una prueba universal en tiempo real para la detección de diferentes especies de Lyssavirus o linajes de RABV15. En este enfoque rt-pcr combinado, se utilizan dos reacciones. El primero detecta diferentes linajes genéticos de RABV, y el segundo detecta la especie Lyssavirus. Ambos pasos implican ensayos qRT-PCR, donde el primero utiliza sondas de hibridación y el segundo utiliza tintes15. Debido al gran número de pruebas que han demostrado una detección molecular exitosa de RABV utilizando esta técnica, el actual Manual Terrestre de la OIE (2018) recomienda el uso de PCR para la detección molecular de RABV17.
México es un país con un considerable potencial ganadero. Los estados con mayor producción ganadera contienen regiones tropicales húmedas y regiones secas que están en riesgo de brotes de rabia debido a la presencia del murciélago vampiro Desmodus rotundus, el principal transmisor de la rabia. Por lo tanto, es esencial desarrollar más herramientas para la prevención y control de la rabia paralítica bovina (BPR) en México. Basándose en esto, el objetivo de este estudio era utilizar qRT-PCR cuantitativo para determinar el número de partículas virales en diferentes estructuras anatómicas de cerebros bovinos después de la muerte debido a la infección por rabia.
Seis cerebros obtenidos de bovinos positivos de RABV fueron donados por un laboratorio externo para su uso en el desarrollo del protocolo qRT-PCR descrito a continuación. Las muestras de estructura cerebral bovina fueron transportadas en cadena fría a la instalación BSL-2 del laboratorio CENID-MA del INIFAP y almacenadas a -80 °C hasta su uso. Los cerebros fueron obtenidos de animales de los estados de Campeche, Yucatán y Querétaro. Antes del recibo, varias estructuras fueron diseccionadas del cerebro. Estas estructuras incluían el cuerno del Ammón, cerebelo, corteza, medulla, pons y tálamo18,19. El material genético fue extraído como se describe a continuación. Se confirmó el diagnóstico de RABV utilizando anticuerpos fluorescentes directos (DFA)20. Como control positivo, se utilizaron cerebros de ratón que fueron inoculados con RABV21. Además, se utilizaron cuatro cerebros de ganado negativos de RABV (según lo determinado por DFA) como controles negativos.

<table><tbody><tr><td>Cloroformo</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Facilita la recuperación de la fase acuosa de las PCR que han sido recubiertas con aceite mineral.</td></tr><tr><td>ADN Limpio & Concentrador-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>El ADN Limpio & El concentrador-500 (DCC-500) está diseñado para la purificación rápida y de gran formato y la concentración de hasta 500 & g de ADN de alta calidad procedente de muestras que incluyen digestiones de endonucleasas de restricción a gran escala y preparaciones de ADN impuro.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Purificación de ácidos nucleicos Kit de sistema de</td></tr><tr><td>PCR de alta fidelidad FastStart, dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>Enzima de alta fidelidad para la amplificación de productos de PCR evitando cambios aleatorios de base</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>Analiza geles de proteínas y ADN de mayor tamaño</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Se trata de una nueva generación de tinciones en gel de ácidos nucleicos, que poseen nuevas características químicas diseñadas para minimizar la posibilidad de que los tintes interactúen con los ácidos nucleicos de las células vivas.</td></tr><tr><td>Gradiente del termociclador iCycler</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>La temperatura se puede monitorear y controlar mediante el algoritmo del instrumento, la sonda en la muestra o los modos de bloque de muestra</td></tr><tr><td>Sondas universales iTaq Kit de un solo paso</td><td>BioRad</td><td>1725141</td><td>Mezcla de reacción para realizar reacciones de PCR en tiempo real utilizando sondas de hibridación tipo TaqMan</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Precipitación de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Los kits QIAquick contienen un conjunto de membrana de sílice para la unión del ADN en tampón con alto contenido de sal y elución con tampón con bajo contenido de sal o agua. El procedimiento de purificación elimina cebadores, nucleótidos, enzimas, aceite mineral, sales, agarosa, bromuro de etidio y otras impurezas de las muestras de ADN</td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>La transcriptasa inversa del virus de >la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT) utiliza ARN o ADN monocatenario en presencia de un cebador para sintetizar una cadena < ADN complementaria.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microvolumen</td> <td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td></tr><tr><td>cebador Oligo(dT)18</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>El cebador oligo (dT)18 es un oligonucleótido sintético monocatenario de 18 meros con extremos 5' y 3'-hidroxilo.</td></tr><tr><td>Kit de sistemas de producción de ARN a gran escala RiboMAX SP6 y T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td> Las <td>reacciones de transcripción in vitro se utilizan para sintetizar cantidades de microgramos de sondas de ARN a partir de plantillas de ADN recombinante. La mayoría de las reacciones de transcripción diseñadas para generar sondas de ARN están optimizadas para maximizar la incorporación de ribonucleótidos radiomarcados en lugar de producir grandes cantidades de ARN</td></tr><tr><td>ADN polimerasa Taq</td><td>Invitrogen</td><td>#EP0402</td><td>La ADN polimerasa Taq es una ADN polimerasa altamente termoestable de la bacteria termófila Thermus aquaticus. La enzima cataliza 5' y 3' síntesis de ADN &nbsp;</td></tr><tr><td>15596026</td> <td>El reactivo TRIzol</td><td>es</td><td>un reactivo completo, listo para usar, diseñado para el aislamiento de ARN total de alta calidad o el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas de una variedad de muestras biológicas.</td></tr></tbody></table>

cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

La rabia paralítica bovina (BPR) es una forma de encefalitis viral que tiene una importancia económica sustancial en toda América Latina, donde representa un riesgo zoonótico importante. Aquí, nuestro objetivo era utilizar un protocolo de laboratorio para determinar el número de copia relativa del genoma del virus de la rabia (RABV) en diferentes estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando la reacción cuantitativa en cadena de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR). qRT-PCR cuantifica el número específico de copias genéticas presentes en una muestra basada en la fluorescencia emitida después de la amplificación que es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico objetivo presente en la muestra. Este método es ventajoso debido a su corta duración, menor riesgo de contaminación y potencial para detectar ácidos nucleicos virales en diferentes muestras más fácilmente en comparación con otras técnicas. Los cerebros de seis animales rabiosos se dividieron en seis estructuras anatómicas, a saber, el cuerno, el cerebelo, la corteza, la medulla, los pons y el tálamo del Ammón. Todos los cerebros fueron identificados como positivos para los antígenos RABV basados en una prueba directa de inmunofluorescencia. También se evaluaron las mismas estructuras anatómicas del cerebro de cuatro bovinos negativos de RABV. El ARN se extrajo de cada estructura y se utilizó para qRT-PCR. Se realizó un ensayo para determinar el número de copias de genes RABV utilizando un gen de nucleoproteína transcrita in vitro. La curva estándar utilizada para cuantificar el ARN viral mostró una eficiencia del 100% y linealidad de 0,99. El análisis reveló que la corteza, la medulla y el tálamo eran las porciones ideales del SNC para su uso en la detección rabv, basándose en la observación de que estas estructuras poseían los niveles más altos de RABV. La especificidad de la prueba fue del 100%. Todas las muestras fueron positivas, no se detectaron falsos positivos. Este método se puede utilizar para detectar RABV en muestras que contienen bajos niveles de RABV durante el diagnóstico de BPR.

Los resultados de DFA mostraron positividad del 100%, 100%, 83,3%, 66% y positividad del 50% para RABV en la corteza, tálamo, medulla, pons y cuerno, respectivamente. Estos resultados confirmaron los resultados anteriores, y al menos tres de las estructuras diseccionadas de cada cerebro fueron positivas para RABV. En la Figura 1se muestra una tinción DAF positiva representativa.
La Figura 2 muestra la amplificación de un fragmento del...

Este protocolo presenta un enfoque basado en qRT-PCR para determinar el número de copia genética de nucleoproteína (N) del virus de la rabia dentro de varias estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando transcripción in vitro.

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas. México es un país con un considerable potencial ganadero. Los estados con mayor producción ganadera contienen regiones tropicales húmedas y regiones secas que están en riesgo de brotes de rabia debido a la presencia del murciélago vampiro, Desmodus rotundus, el principal transmisor de la rabia.La detección del gen de la nucleoproteína N del virus de la rabia se utiliza principalmente para el diagnóstico de rabia mediante pruebas moleculares. Utilizando enfoques basados en PCR, se pueden detectar cantidades mínimas de un agente infeccioso en una muestra clínica a través de la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de ADN. qRT-PCR se basa en la detección y cuantificación de una molécula donde los aumentos de la señal de fluorescencia son en proporción directa a la cantidad de producto PCR en una sola reacción.A medida que aumenta el número de copias del objetivo de ácido nucleico, también lo hace la fluorescencia. Basándose en esto, el objetivo del estudio era utilizar qRT-PCR cuantitativo para determinar el número de partículas virales en diferentes estructuras anatómicas de cerebros bovinos, después de la muerte, debido a la infección por rabia. El ARN total se extrajo directamente de cerebros bovinos utilizando un método de extracción orgánica de acuerdo con el siguiente protocolo.Utilice 100 miligramos de tejido cerebral de cada estructura anatómica para extraer ARN total utilizando un reactivo disponible comercialmente que contiene isoticianato de guanidinio. Homogeneizar manualmente un total de 100 miligramos de tejido de cada estructura en un mililitro del reactivo de isoticianato de guanidinio mediante vórtice utilizando un homogeneizador Dounce con un pequeño pestle dentro del microtubo durante 15 segundos a máxima velocidad. Incubar las muestras en hielo durante cinco minutos, y luego añadir 200 microlitros de cloroformo.Mezcle las muestras vigorosamente durante 15 segundos. Incubar en hielo durante dos o tres minutos, y luego centrifugar a 12.000 x g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa a un tubo limpio y agregue 500 microlitros de alcohol isopropílico.Incubar las muestras durante 15 minutos a 21 grados centígrados. Centrífuga las muestras a 12.000 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante acuoso por pipeteo.El ARN aislado estará presente como pellet en el tubo. A continuación, lave el pellet de ARN con un mililitro de 75% de etanol pipeteando y centrífuga a 7.500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN a temperatura ambiente, 21 grados centígrados.A continuación, diluya el pellet en 50 microlitros de agua libre de nucleasa. Determine la concentración y calidad del ARN en 260 nanómetros mediante un espectrofotómetro. La transcripción in vitro genera ARNM de un gen objetivo.Utilice un par de imprimación que amplíe el gen COMPLETO RABV N y uno que se utilice como control positivo para el ensayo qRT-PCR. Estas imprimaciones están diseñadas para amplificar el gen COMPLETO RABV N, y para añadir un promotor que reconozca la polimerasa T7. Para amplificar todo el gen N RABV, utilice las imprimaciones trans y RAB hacia adelante y hacia atrás, y un kit de PCR de alta fidelidad.Para cada reacción, prepare una mezcla maestra de PCR añadiendo a un búfer de reacción de tubo PCR limpio con 10 micromolares de cada imprimación y 0,5 unidades de polimerasa de alta fidelidad. Para utilizar el producto PCR como plantilla para la síntesis in vitro y eliminar componentes de la reacción enzimática, purifique el producto PCR utilizando un kit concentrador basado en columnas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y luego cuantificar usando un espectrofotómetro.Para la síntesis de ARN, utilice un kit de transcripción in vitro con la siguiente mezcla de reacción: cinco microlitros T7 transcripción 5X buffer, 1.9 microlitros de cada nucleótido de trifosfato, 10 microgramos de ADN RABV N purificado, y 2.5 microlitros de la mezcla enzimática. A continuación, incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, añadir un microlitro de una unidad por microgramos Rnase-Free DNase a la mezcla de reacción e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados para eliminar la contaminación del ADN.Purificar el ARN transcrito in vitro y luego concentrarlo usando fenol:cloroformo:alcohol isoamilo a una proporción de 25:24:1. Resuspend el pellet de ARN purificado en 70 microlitros de tampón TE, y luego almacenarlo a 80 grados centígrados hasta su uso. Repita el protocolo PCR hasta obtener aproximadamente cinco microgramos de producto PCR.Después de la purificación y concentración, el ARNM del gen N transcrito in vitro estará presente a una concentración de 4.711 microgramos por microlitro. Confirme que el ARNm transcrito in vitro corresponde al gen N siguiendo el paso cinco de este protocolo, y utilícelo como un control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real, qRT-PCR. Para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real, utilice una transcripción de ARNm in vitro para codificar el gen N completo como un control positivo.Junto con un kit comercial qRT-PCR de un solo paso, utilizando sondas de hibridación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice la sonda en las imprimaciones descritas por Coronado y su compañero de trabajo en 2010 para detectar una región conservada de la RABV utilizando las siguientes condiciones de ciclismo térmico. Realice diluciones en serie del ARNm transcrito in vitro canalizando en serie un microgramos por microlitro de ARNM en tubos hasta que se obtengan seis diluciones desacopladas.Prepare tubos a un volumen de 100 microlitros en triplicado para su uso en la creación de la curva estándar. Realice qRT-PCR como se describió anteriormente. Realice qRT-PCR en un ciclor térmico con un rotor procesando las diversas muestras cerebrales simultáneamente con las reacciones en ejecución para crear una curva estándar y utilizar controles positivos, controles negativos y sobrenautas aislados del cultivo celular.Para evaluar el límite de detección, eficacia de la prueba y sensibilidad de la prueba, utilice una curva estándar en triplicado en las mismas condiciones. Para la detección del gen RABV N, utilice el ARN a partir de muestras de campo, controles positivos, controles negativos y sobrenautas de cultivo celular para realizar qRT-PCR utilizando el kit pcr descrito anteriormente. Para determinar el número de copias del genoma rabv presentes en las muestras cerebrales bovinas, obtener datos de TC de la curva estándar y muestras biológicas, y de los interpolados desde la ecuación de la curva de calibración Esta cifra muestra tejidos cerebrales bovinos que exhiben tinción positiva de acuerdo con la inmunofluorescencia directa.Los resultados muestran 100%100%83.3%66% y 50% positividad para RABV en la corteza, tálamo, medulla, pons y cuerno respectivamente. Estos resultados confirman los resultados anteriores, y al menos tres de las estructuras diseccionadas de cada cerebro fueron positivas para RABV. Por otro lado, la ecuación de la curva estándar muestra la relación entre la cantidad de contenido genético rabv en la muestra y el tamaño del fragmento amplificado pcr.La cantidad de contenido genético rabv en nanogramos se dedujo mediante la interpolación de los valores de TC en la curva de calibración utilizando la ecuación presentada en esta figura. Usando esta ecuación, se encontró que el límite de detección de una por vez de 10 a los quintos microgramos por microlitro de ARN viral correspondía a 36 copias del genoma de RABV. Estos resultados demuestran que el ensayo es sensible y se puede utilizar para detectar el virus en muestras que contienen un bajo número de copias del gen RABV N.La eficiencia del ensayo se calculó utilizando la pendiente de la curva estándar, que era de 3,28. Las muestras utilizadas para qRT-PCR mostraron amplificación del gen RABV N. Para determinar el número de copias virales presentes, los valores de TC de cada muestra se interpolaron utilizando la ecuación de curva de calibración.Los resultados obtenidos en nanogramos se sustituyeron por la fórmula descrita aquí. Esta tabla muestra los resultados comparativos entre qRT-PCR y DFA. Los resultados de los ensayos qRT-PCR fueron consistentes con los obtenidos utilizando DFA.Según los resultados obtenidos en la prueba qRT-PCR en los casos C y D, el tálamo es la estructura que posee el mayor número de copias del gen RABV N. Esto sugiere que la infección temprana de neuronas hipotalámicas y talámicas es importante en el desarrollo de la enfermedad, dado que estas neuronas controlan las funciones vegetativas de un animal. Los números de copia del gen RABV N que se detectaron en cada estructura de cada muestra son: la sensibilidad y especificidad de la prueba qRT-PCR estamos 100% ya que todas las muestras fueron positivas.Este resultado es consistente con los diagnósticos iniciales de las muestras. qRT-PCR es una técnica altamente sensible. Algunos de los pasos son críticos para obtener los mejores resultados.Uno de ellos es el manejo adecuado de muestras para la extracción de ARN. Este paso es crucial ya que el ARN se degrada fácilmente y, por lo tanto, los resultados podrían verse afectados. Considere mantener la muestra en condiciones frías, aproximadamente cuatro grados centígrados durante el proceso.Además, considere que se llevan a cabo varias rondas de aplicación de ITP como se menciona en la transcripción in vitro. El ensayo qRT-PCR realizado en este estudio podría detectar tan solo 36,3 copias del gen RABV N por miligramo de tejido. Las estructuras cerebrales más adecuadas para qRT-PCR incluían la corteza y el tálamo.Esto se basa en las observaciones de que se detectaron concentraciones más altas del gen RABV N en estas estructuras, y que también se encontró que eran positivas utilizando la prueba de referencia rabv. La prueba fue capaz de detectar concentraciones muy bajas, 0.00023 por 10 a la novena copia del virus en varias muestras. Además de cuantificar las partículas virales en la muestra, la prueba parece proporcionar una buena herramienta alternativa de diagnóstico e investigación para la detección de RABV presentada aquí.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El virus infecta las neuronas piramidales en la corteza cerebral, y las proteínas virales expresadas se localizan dentro de estructuras granulares intracitoplasmáticas conocidas como cuerpos de inclusión.

Detección de proteínas virales en tejido cerebral de ratón infectado por el virus de la rabia

Este video muestra la tinción inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia en tejido cerebral de ratón infectado. El proceso incluye la desparafinación y el tratamiento con alcohol, seguidos de un tratamiento proteolítico para mejorar la accesibilidad al antígeno. La tinción inmunohistoquímica revela precipitados rojos, lo que confirma la presencia de antígenos de rabia en la sección de tejido.

Tinción inmunohistoquímica para la detección de antígenos del virus de la rabia

Fuente: Zaeck, L., L. , et al. Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en tejido cerebral aclarado con solvente. J. Vis. Exp. (2019).  Este video muestra el proceso de preparación y obtención de imágenes de tejido cerebral de ratón infectado con el virus de la rabia (RABV) para evaluar la progresión de la infección. Describe los pasos clave, incluida la tinción de tejidos con marcadores fluorescentes, la deshidratación, el aclarado y el montaje para la...

Visualización tridimensional de una infección por el virus de la rabia en tejido cerebral de ratón

Las nuevas técnicas de limpieza de tejidos compatibles con la inmunomancha, como la imagen 3D definitiva de órganos con disolventes, permiten la visualización 3D de la infección cerebral del virus de la rabia y su complejo entorno celular. Las rebanadas gruesas de tejido cerebral con etiqueta de anticuerpos se hacen ópticamente transparentes para aumentar la profundidad de la imagen y permitir el análisis 3D mediante microscopía de escaneo láser confocal.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

La prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) ofrece una alternativa reconocida de la Organización Mundial de Sanidad Animal y la Organización Mundial de la Salud (OIE/OMS) a la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) para el diagnóstico de la rabia. Esta prueba permite aplicaciones basadas en el campo que se pueden realizar en aproximadamente 1 h sobre impresiones cerebrales utilizando microscopía de luz.

Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

El objetivo de este protocolo es demostrar técnicas de necropsia seguras en animales pequeños y grandes para obtener muestras de tejido satisfactorias para pruebas de rabia.

Técnicas de Necropsia de Rabia en Animales Grandes y Pequeños

Presentamos un protocolo completo para el diagnóstico postmortem de la rabia animal en condiciones de campo utilizando una prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido (RIDT), desde el muestreo de biopsia cerebral hasta la interpretación final. También describimos otras aplicaciones que utilizan el dispositivo para el análisis molecular y el genotipado viral.

Prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido postmortem de campo para la configuración de recursos limitados con otras aplicaciones moleculares

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y rentable para caracterizar los genomas del virus de la rabia (RABV) utilizando tecnología de nanoporos. El flujo de trabajo está destinado a apoyar la vigilancia genómica a nivel local, proporcionando información sobre los linajes circulantes del RABV y su ubicación dentro de las filogenias regionales para guiar las medidas de control de la rabia.

Secuenciación del genoma completo para la caracterización rápida del virus de la rabia mediante tecnología de nanoporos

Este protocolo demuestra el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 en tiempo real desde la recolección de tejidos hasta la interpretación de los resultados, incluidas las actualizaciones de las secuencias de cebadores y formulaciones para mejorar el rendimiento del ensayo para algunos lyssavirus y lagomorfos no antirrábicos. También demostramos la configuración del ensayo para un formato multiplexado LN34 de un solo pocillo (LN34M).

Diagnóstico postmortem de la rabia en animales mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa LN34 en tiempo real multiplexado actualizado

Aprende a cuantificar el virus de la rabia en estructuras cerebrales bovinas mediante qRT-PCR y transcripción in vitro. Este método permite detectar cargas virales bajas en muestras de ganado.

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

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