Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

Conpokal combina la microscopía confocal con la microscopía de fuerza atómica utilizando una sonda para asomar la superficie de la muestra. Aunque ambas técnicas son efectivas individualmente, Conpokal facilita la co-localización de la fluorescencia con la caracterización mecánica. La principal ventaja de la técnica Conpokal, es la doble microscopía casi simultánea.

Confocal investiga los procesos citoesqueléticos y otros procesos celulares antes y después del sondeo AFM, que ofrece propiedades mecánicas específicas del área. Esta técnica es impactante dentro del campo de la mecanobiología, ya que, por ejemplo, las células cerebrales se pueden sondear en condiciones fisiológicas para examinar los impulsos eléctricos y forzar la transacción. Antes de comenzar el análisis, seleccione un voladizo AFM adecuado para la recopilación de datos deseada y utilice guantes, la etapa de montaje del chip AFM, pinzas y un pequeño destornillador para montar el chip en el bloque de vidrio.

Coloque cuidadosamente el chip AFM en el centro del bloque de vidrio. El voladizo más una porción muy pequeña del chip AFM debe estar en la porción visible, no opaca del bloque de vidrio. Utilice el destornillador para apretar el tornillo hasta que el chip se ajuste contra el bloque de vidrio, y utilice una lente para comprobar que el chip está orientado correctamente.

Cuando el chip haya sido correctamente orientado, coloque el bloque de vidrio en el cabezal AFM en la orientación adecuada y bloquee el bloque de vidrio en su lugar. Después de localizar la parte inferior de la antena de calibración mediante microscopía de campo brillante, utilice el panel de control del motor paso a paso Z del sistema AFM para mover el voladizo AFM 2000 micras por encima de la muestra. Usando la iluminación de campo brillante y el panel de control del motor paso a paso Z, baje lentamente el chip AFM a la parte inferior de la placa de vidrio en pasos de 100 a 200 micras para evitar estrellar la punta AFM en la placa Petri.

Localice los micrómetros manuales que controlan X Y o en movimiento simple de la cabeza AFM en la plataforma del instrumento. A medida que la sombra del voladizo AFM se vuelve más oscura, y la forma se vuelve más nítida, utilice los micrómetros manuales para corregir la cabeza AFM y ajustar la posición del voladizo AFM dentro del campo de visión. En este momento, es posible que sea necesario ajustar las tablas de búsqueda.

Esté atento a que aparezca una sombra en la vista de software del microscopio, lo que indica que la punta de AFM se está acercando a la parte inferior del plato. Continúe usando pequeños pasos para bajar la punta de AFM hasta que la punta esté principalmente enfocada. Cuando el láser esté en posición, utilice los diales de alineación láser para colocar el láser en la parte posterior de donde se encuentra la punta AFM en el voladizo.

El panel de alineación láser debe mostrar una señal de suma mayor que cero voltios. Mueva el láser, una pequeña distancia en todas las direcciones en el voladizo AFM, hasta que la señal de suma máxima se alcance mientras permanece en la punta AFM. Una vez ajustada la posición del láser, utilice los diales de desviación controlados manualmente para poner a cero la desviación vertical y lateral.

Utilice las perillas de desviación verticales y laterales para alinear el detector de modo que el objetivo esté centrado y no se observe ninguna desviación vertical o lateral en el panel de alineación láser. Abra la ventana Calibración e introduzca toda la información específica de los experimentos. Sustituya el filtro de luz láser.

Antes de calibrar, apague la fuente de luz del microscopio confocal y cierre la carcasa AFM para amortiguar cualquier ruido potencial proveniente de la luz o las vibraciones de la habitación. Pulse el botón Calibración para permitir automáticamente que el sistema calibra la punta. Una vez completada la calibración, la rigidez del voladizo y su sensibilidad se mostrarán en el panel Calibración.

A continuación, utilice el botón Comando de enfoque automatizado para bajar la punta a la parte inferior de la placa de muestra y establecer el tamaño del área de la piel, la resolución, el punto de ajuste, la longitud Z y el tiempo de píxel, antes de pulsar el botón de reproducción para comenzar a escanear. Para la toma de imágenes de microscopios confocales en el software del microscopio, habilite las capacidades confocales y seleccione las líneas láser adecuadas para los tintes que se utilizaron para manchar las muestras. Seleccione una o varias líneas láser para excitar e imaginar esas entidades en la muestra y establecer la ganancia en un valor que optimice la fluorescencia de la muestra, pero limite la cantidad de ruido.

Ajuste la potencia del láser para evitar píxeles saturados mientras maximiza el rango dinámico y establezca el tamaño del agujero en una unidad de área para maximizar la resolución para la sección óptica. Si es necesario, ajuste los valores en función del brillo de la muestra. Para establecer el tiempo de permanencia de píxeles, comience con aproximadamente un tiempo de permanencia de dos microsegundos y ajuste para reflejar el brillo de la muestra según sea necesario.

Para seleccionar el tamaño de píxel para el objetivo seleccionado, deje que el instrumento calcule el tamaño del píxel a través del botón de opción Nyquist y el número seleccionado de píxeles en la imagen. A continuación, seleccione la opción Escanear e inicie la recopilación de datos. Utilice el mando de enfoque para localizar el plano focal que representa las entidades de muestras en su forma más clara, el botón Escanear para comenzar la recopilación de datos y el botón Capturar para capturar una imagen bidimensional.

Con el panel que controla el tamaño de píxel a través de la opción Nyquist, reduzca el tamaño del área del escaneo para envolver solo una sola celda. Active la herramienta de recogida y utilizando una opción de abajo a arriba, con sólo la línea láser que ilumina una entidad en la muestra más claramente, establezca los planos de inicio y fin para el volumen que se medirá utilizando el espaciado sugerido entre los planos. Asigne un nombre al archivo y guárdelo en la carpeta asociada.

Alternativamente, si existe nuestro conocimiento priori del grosor de las muestras, seleccione el plano medio más brillante, nítido y nítido ajustando el enfoque para definir el volumen y establezca la parte superior para que tenga el grosor de la muestra por encima del plano medio, y la parte inferior para que tenga el grosor por debajo del plano medio, luego seleccione el tamaño de paso adecuado. Ejecute la adquisición pulsando el botón Ejecutar ahora. Cuando finalice la adquisición, guarde el archivo en la carpeta adecuada.

Al final del experimento, use guantes mientras retira el bloque de vidrio y colóquelo en la estación de montaje. Utilice pinzas con empuñaduras de goma para quitar cuidadosamente el chip AFM y vuelva a colocar la punta usada en la ubicación de la caja de almacenamiento orientada hacia fuera de acceso para indicar que se ha utilizado. Para futuras referencias, tenga en cuenta qué punta se utilizó en el experimento.

Aquí, se muestra un escaneo AFM representativo sobre una celda HEK viva. La altura de esta célula HEK en particular era de alrededor de 10 micras como lo demuestra el escaneo de línea. Aquí, se puede observar un ejemplo de un escaneo deficiente debido a una opción de punta AFM incorrecta.

En esta imagen, aparecieron píxeles negros en el vértice de la celda que indican que la zona AFM PA estaba fuera de rango debido a una gran altura de celda. El extremo del voladizo AFM también aparece en la imagen debido al desplazamiento de la punta combinado con una altura de punta insuficiente en comparación con la altura de la celda. Estos artefactos en la imagen AFM, indican que se debería haber elegido una punta AFM diferente para poner en imagen la celda.

Se pueden realizar tres imágenes confocales de color. Por ejemplo, para visualizar el núcleo celular, los micro túbulos y la membrana lipofílica. El análisis de las hendiduras de punta en combinación con el modelo nanomecánico, permite la generación de un mapa de módulo de la superficie.

Aquí, se muestra una proyección 3D correspondiente de la pila Z confocal láser. Las exploraciones de AFM y los mapas de módulos medidos también se pueden adquirir para microbios, como se observa en estos análisis representativos de la bacteria streptococcus mutans. Como se ha demostrado, se puede lograr una mejor resolución a esta escala con AFM, que con la microscopía confocal tradicional.

El mapeo de fuerza adhesiva es una técnica realizada a través de conpokal para visualizar las interacciones moleculares. Por ejemplo, estudiar la modulación de moléculas de superficie celular para observar la cinética de unión. Conpokal abre una nueva vía para explorar las relaciones de función de la estructura en microbiología médica.

Por ejemplo, los eventos físicos y químicos y la capa peptidoglicana, pueden estar relacionados con la resistencia a los antibióticos.