Name: Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Aprende a utilizar microscopía de superresolución SIM para estudiar la co-localización de proteínas en neuronas primarias de hipocampo de ratón. Este protocolo permite visualizar interacciones sinápticas con resolución de ~100 nanómetros.

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Los autores quieren agradecer a Edoardo Micotti por la crítica constructiva del manuscrito. Este estudio fue apoyado por BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), por la Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) y por la Red de Formación Innovadora Marie Sk-odowska-Curie (JK).

1. Culturas primarias
<ol><li>Neuronas primarias de hipocampo de ratón de cultivo en cubreobjetos con cámara (como Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que coinciden con el requisito objetivo para el espesor de la cubierta de #1,5 (0,17 mm).</li>
	<li>Cubiertas con cámara de abrigo con 100 ml de poli-L-lisina (100 g/ml).</li>
	<li>Al día siguiente, lave los cubreobjetos a cámara dos veces con solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS).</li>
	<li>Para obtener neuronas primarias de ratón, aislar hipocampos de cachorros P1-P423.</li>
	<li>Coloque el hipocampo diseccionado en 10 ml de medios de disección (Tabla 1) y déjelos depositar en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Con una pipeta estéril, retire cuidadosamente el soporte de disección, dejando el hipocampo inalterado en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Añadir 10 ml de Media 1 (Tabla 1) al hipocampo e incubar durante 30 minutos a 37oC.</li>
	<li>Con una pipeta estéril, retire cuidadosamente el Media 1, dejando el hipocampo inalterado en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Añadir 10 ml de Media 2 (Tabla 1) y dejar el tubo centrífugo (tapado) debajo del capó horizontalmente durante 45 minutos.</li>
	<li>Deje reposar el tubo de centrífuga verticalmente para permitir que el tejido se asiente en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Con una pipeta estéril, retire cuidadosamente media 2, dejando el hipocampo inalterado en la parte inferior del tubo centrífugo.</li>
	<li>Añadir 2 mL de Medios 3 (Tabla 1).</li>
	<li>Usando una pipeta p1000 con una punta filtrada, disocia mecánicamente las células del tejido.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante, en el que se encuentran las neuronas aisladas, a un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular durante 2 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Después de la centrifugación, las células se encuentran en la parte inferior del tubo centrífugo. Con una pipeta estéril, deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Células resuspendidas en 1 ml de Medios 4.</li>
	<li>Utilice un filtro de 70 m para eliminar las celdas no disociadas.</li>
	<li>Contar las células viables en una cámara de B-rker añadiendo 1 l de 0,4 % de solución azul de Trippan a 19 l de la suspensión celular.</li>
	<li>Células de placa a 70.000 células/pozo en un volumen de 200 l por pocócil.</li>
	<li>Dejar que las células se adhieran durante 2 h en una incubadora humidificada a 37oC y 5% co2.</li>
	<li>Saque los cubreobjetos con cámara de la incubadora y sustituya cuidadosamente el medio por 200 l de medios de cultivo.</li>
	<li>Dejar los cubreobjetos con cámara en una incubadora humidificada a 37oC y 5% de CO2.</li>
	<li>Sustituya un tercio del medio por medios de cultivo frescos cada 5-7 días.</li>
	<li>Espere hasta que las neuronas primarias del hipocampo estén completamente maduradas (12-14 días después del enchapado) para realizar estudios de co-localización.</li>
</ol>2. Tinción de inmunofluorescencia
<ol><li>Tome los cubreobjetos con cámara de la incubadora.</li>
	<li>Retire el medio.</li>
	<li>Lave rápidamente los pozos con 200 ml de PBS.</li>
	<li>Añadir 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS (200 l/pozo) a las neuronas para fijarlas rápidamente.</li>
	<li>Incubar las células durante 15 minutos en RT.</li>
	<li>Retire la solución PFA.</li>
	<li>Permeabilizar las células mediante la adición de PBS con 0.2% Tritón X-100 (200 l/pozo).</li>
	<li>Incubar durante 1 min en RT.</li>
	<li>Retirar la solución e incubar las muestras con albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (200 l/pozo) durante 1 h en RT para cubrir pasivamente todas las superficies de unión libres de la placa con una proteína irrelevante para el análisis. Un búfer de bloqueo basado en BSA sin Triton X-100 reduce el fondo de anticuerpos de manera más eficiente que el mismo búfer con 0,2% Triton X-100.</li>
	<li>Retire la solución.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo primario de elección diluido en una solución de PBS que contenga 1% de BSA y 0,2% Tritón X-100 (120-200 l/pozo, dependiendo de la dilución y disponibilidad del anticuerpo). Incubar las muestras durante 2 h.<ol>
<li>Como control negativo, no agregue ningún anticuerpo primario a uno de los pozos. Múltiples anticuerpos de diferentes especies contra diferentes objetivos se pueden utilizar al mismo tiempo. Utilice un anticuerpo contra el MAP2 (un marcador neuronal) criado en el pollo, un anticuerpo contra el PSD95 o la sinaptofisina levantado en el ratón y un anticuerpo contra una proteína diana criada en el conejo. Esto permite análisis SIM de tres colores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave rápidamente los pozos tres veces con PBS (200 l/pozo).</li>
	<li>Añadir anticuerpos secundarios (se pueden utilizar anticuerpos secundarios dyLight y Alexa) diluidos en una solución de PBS que contenga 1% de BSA y 0,2% tritón X-100 (200 l/pozo). Incubar las muestras durante 1 h en RT.</li>
	<li>Lave rápidamente los pozos tres veces con PBS (200 l/pozo).</li>
	<li>Añadir el tinte Hoechst a una concentración de 1 g/ml diluido en PBS (200 l/pozo) a los núcleos de tinción. Incubar las muestras durante 10 minutos en RT.</li>
	<li>Lave rápidamente los pozos dos veces con PBS.</li>
	<li>Monte las celdas con un montura compatible con SIM. Utilice 10 l/pozo de soporte antifada de vidrio ProLong.</li>
	<li>Cubra y proteja las celdas con una cubierta (por ejemplo, una cubierta redonda con un diámetro de 8 mm). También se pueden utilizar plazas.</li>
	<li>Guarde los cubreobjetos con cámara en RT y espere al menos 48 horas antes de adquirir imágenes. Diamond Glass requiere al menos dos días de curado antes de las adquisiciones de superresor resolución.</li>
</ol>3. Control de especificidad de anticuerpos
NOTA: Utilice dos estrategias para asegurar la especificidad de los anticuerpos. La primera estrategia es utilizar al menos dos anticuerpos diferentes dirigidos al mismo sustrato. La segunda estrategia es la neutralización de anticuerpos por incubación con el objetivo de proteína purificada o el epítopo utilizado para aumentar el anticuerpo.
<ol><li>Incubar el anticuerpo de elección con cinco veces el exceso del objetivo recombinante o epítopo durante 1 h en RT en 1% de BSA en PBS.</li>
	<li>Después de la incubación, utilice el anticuerpo neutralizado a la concentración habitual para la tinción como se describió anteriormente a partir de 2.11.</li>
</ol>4. Calibración del microscopio
NOTA: Utilizamos rutinariamente un sistema de microscopio de superconorción N-SIM fabricado por Nikon para los estudios de super resolución. Sin embargo, varias otras empresas también ofrecen microscopios de superrescresía en sus catálogos. Aunque se describen indicaciones específicas para el sistema N-SIM de Nikon, las instrucciones siguientes se pueden generalizar en otros sistemas. Antes de la adquisición de imágenes SIM, el sistema requiere una calibración adecuada con perlas fluorescentes de tamaño de subrescresación específicas. Un ejemplo son las microesferas TetraSpeck. Estas perlas están teñidas con diferentes tintes fluorescentes para permitir la calibración de diferentes láseres con una sola muestra.
<ol><li>En un baño de agua sonicar alrededor de 1.8 x 108 microesferas fluorescentes durante 10 minutos. El sistema N-SIM de Nikon requiere una muestra de perlas multicolores escasamente pobladas para la calibración. Esto podría diferir para otros sistemas que requieren una capa única densa de perlas fluorescentes de tamaño de subresión. Ajuste el número de partículas fluorescentes en consecuencia.</li>
	<li>Diluir las microesferas fluorescentes 1:500 en agua destilada doble.</li>
	<li>Sonicar una segunda vez durante 10 minutos adicionales.</li>
	<li>Pipetear 15 l de las perlas diluidas en un pozo de un cubreobjetos con cámara.</li>
	<li>Deje secar la solución durante 5 minutos en RT.</li>
	<li>Añada 10 l de la solución de montaje y coloque un cubreobjetos de 8 mm en la parte superior.</li>
	<li>Espere al menos 48 horas para permitir el curado adecuado.</li>
	<li>Encienda el microscopio y los láseres.</li>
	<li>Deje que el sistema se caliente para alcanzar el equilibrio térmico de todos los componentes del microscopio. El sistema de microscopio de superconorción N-SIM requiere al menos 3 horas.</li>
	<li>Seleccione el objetivo 100x.</li>
	<li>Inicie la calibración alineando los láseres con el centro del bloque de rejilla de difracción. En el sistema N-SIM, una perilla de micrómetros y una cámara dedicada permiten centrar los haces de luz al objetivo.</li>
	<li>Inserte el cubreobjetos con cámara en el microscopio para su visualización. Ajuste el sistema al espesor de la cubierta con cámara ajustando el collar de corrección objetiva. El software NIS, el software propietario proporcionado con los sistemas de microscopio de superresorción N-SIM, tiene una función automática para regular los collares de corrección.</li>
	<li>Ajuste el enfoque del bloque de rejilla para cada canal para garantizar una iluminación de patrón estructurado enfocada en la muestra. El software NIS proporciona una función automática para esta tarea.</li>
	<li>A continuación, adquiera imágenes 3D-SIM en bruto de las microesferas multicolores. Reconstruya las imágenes en bruto para obtener una imagen superconsuelta utilizando el software del microscopio o la plataforma de software de código abierto para el análisis de imágenes biológicas ImageJ24 y el plugin fairSIM25.</li>
	<li>Calcular, para cada longitud de onda separada, la transformación de Fourier de la imagen superconsuelta obtenida en 4.14. Si la imagen transformada no puede obtener un patrón correcto de flores, reinicie la calibración desde 4.11 ya que no se ha logrado la super-resolución.</li>
	<li>En la imagen superconsútil, seleccione una sola microesfera y calcule su perfil de intensidad para cada canal para medir la resolución alcanzada. Ahora debe estar cerca de 100 nm lateralmente.</li>
	<li>A continuación, realice el registro de canales superponiendo una adquisición multicanal de las microesferas. El objetivo es colisionar todas las señales de canal de forma lateral y axial. Esto eliminará las aberraciones cromáticas debido a la desalineación de los diferentes canales y ayudará al análisis de la co-localización.</li>
	<li>Confirme la calidad de la calibración utilizando las funciones "Illumination Phase Steps" y "Illumination Pattern Focus" de SIMcheck26, un conjunto de plugins para la aplicación de código abierto ImageJ. Con este fin, prepare un cubreobjetos con cámara para obtener una sola capa densa de microesferas TetraSpeck y adquiera una imagen 3D-SIM de la muestra. Analice la imagen en ImageJ y, si se detectan aberraciones, reinicie la calibración del microscopio desde el paso 4.11.</li>
</ol>5. Adquisición
<ol><li>Comience a analizar la muestra utilizando un objetivo 40x en modo confocal o de campo ancho. Esto permite la navegación a la muestra, manteniendo buenos detalles y un gran campo de visión.</li>
	<li>Utilice la señal de anticuerpos MAP2 para identificar un área que represente procesos neuronales.</li>
	<li>Adquiera imágenes de la muestra en modo confocal para determinar la calidad de la tinción. La mala calidad confocal se reflejará en la mala calidad de la SIM, por lo que se requiere que las muestras se desechan.</li>
	<li>Si el área y la calidad de las imágenes son satisfactorias, cambie el objetivo a 100x.</li>
	<li>Aplique aceite al objetivo 100x.</li>
	<li>Adquirir una imagen de campo ancho o confocal que se utilizará más adelante para evaluar la calidad de la imagen superconstionada (Figura 1A,B).</li>
	<li>Cambie al modo 3D-SIM.</li>
	<li>Mediante las ventanas de diálogo para establecer parámetros para la adquisición, seleccione la configuración de profundidad de bits más alta disponible para maximizar la información de color. Normalmente, 16 bits es la opción estándar. Además, para mejorar la relación señal-ruido, seleccione un valor de baja frecuencia para la adquisición, como 1 MHz.</li>
	<li>Usando ventanas de histograma, ajuste la potencia de los láseres para obtener una respuesta lineal de la señal. Para evitar la pérdida de información, limite los píxeles saturados en las imágenes. El sistema N-SIM utiliza una cámara Andor iXon3. Cuando trabaje a 16 bits, elija una intensidad objetivo de 16.000 para garantizar la respuesta lineal de la cámara. Alternativamente, elija un rango entre 30,000-45,000 para maximizar el rango dinámico de la adquisición.</li>
	<li>Establezca la potencia del láser entre 0,1% y 50% al tomar imágenes de las muestras y los tiempos de exposición entre 50 ms y 2 s. Las potencias láser superiores al 50% pueden causar un fotoblanqueo rápido de los fluoróforos en uso.</li>
	<li>Comience a adquirir las imágenes en modo 3D-SIM.</li>
	<li>Utilice SIMcheck, un conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para evaluar la calidad de adquisición de las imágenes sin procesar.</li>
	<li>Si SIMCheck no detecta artefactos ni problemas de calidad, adquiera un mínimo de 10 imágenes de 4 réplicas técnicas para permitir el análisis estadístico.</li>
</ol>6. Postproducción: reconstrucción de imágenes
NOTA: Las imágenes adquiridas en 3D-SIM son imágenes sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes superconsueltas reconstruidas. La reconstrucción incorrecta de imágenes sin procesar puede dar lugar a artefactos que afectarían al análisis de las muestras. Por lo tanto, se debe prestar una gran atención a la elección adecuada de los parámetros de reconstrucción.
<ol><li>Procesar las imágenes sin procesar utilizando el software de análisis de reconstrucción del microscopio para obtener una imagen superconsuel(Figura 1C). Alternativamente, utilice el plugin gratuito ImageJ fairSIM para reconstruir imágenes sin procesar.</li>
	<li>Calcule la transformación de Fourier de las imágenes superconsueltas utilizando el software de reconstrucción del microscopio o el plugin ImageJ SIMCheck. Una buena imagen reconstruida debe devolver, para cada canal, una imagen similar a una flor. Si las imágenes reconstruidas no pueden recrear una forma similar a una flor, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruya modificando los parámetros de reconstrucción como el filtrado De Wiener, la apodización y la supresión de orden cero27. En el software NIS, utilizando la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique los parámetros i) Contraste de modulación de iluminación, ii) Supresión de ruido de alta resolución y iii) Supresión de de enfoque.</li>
	<li>A continuación, analiza la imagen reconstruida para detectar de forma imparcial artefactos mediante NanoJ-SQUIRREL28, un plugin basado en ImageJ para evaluar la calidad de las imágenes superconsúcedas.</li>
	<li>Si NanoJ-SQUIRREL detecta artefactos, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruyalos modificando los parámetros de reconstrucción, como el filtrado Wiener, la apodización y la supresión de orden cero. En el software NIS, utilizando la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique los parámetros Contraste de modulación de iluminación, Supresión de ruido de alta resolución y Supresión de desenfoque.</li>
	<li>Utilice las imágenes superconsueltos para calcular el perfil de co-localización y/o los coeficientes de Pearson y Mander.</li>
</ol>7. Co-localización con análisis de perfil
NOTA: Como primer paso para estudiar la co-localización entre marcadores sinápticos y una proteína de interés, tome una imagen superconsuelta y analice un solo locus para determinar la superposición de la señal.
<ol><li>Identifique un solo locus en la imagen superconsuel.</li>
	<li>Obtener los perfiles de intensidad de las señales fluorescentes del locus de interés.</li>
	<li>Exporte los datos.</li>
	<li>Utilice GraphPad Prism, o un software de análisis similar, para normalizar todos los picos de señal y obtener intensidades de señal comparables para cada canal con el objetivo final de determinar la co-localización específica del locus.</li>
</ol>8. Cuantificación de los coeficientes de Pearson y Mander
NOTA: Si el análisis de perfil ha sugerido una sola co-localización de locus, se puede realizar un análisis más general de toda la imagen calculando los coeficientes29,,30de Pearson y Mander.
<ol><li>Utilice JACoP31, un plug-in ImageJ, para determinar los dos parámetros de la co-localización: Pearson's y Mander's.</li>
</ol>9. Análisis estadístico
<ol><li>Utilice GraphPad Prism, o un software de análisis y gráficos similar, para procesar los datos recopilados con JACoP.</li>
	<li>Utilice al menos 40 imágenes SIM para cada condición analizada para obtener gráficos y para la relevancia estadística.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para entender los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal, las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también subyacen a trastornos neurológicos complejos como la enfermedad de Alzheimer32. El protocolo descrito aquí sirve para estudiar la co-localización de proteínas neuronales con una técnica de microscopía de superresor resolución llamada SIM. Usand...

La comprensión y la visión de la sinapsis ha cambiado enormemente desde su primera descripción por Foster y Sherrington en 18971. Desde entonces, nuestro conocimiento de la comunicación neuronal y los procesos moleculares detrás de ella ha crecido exponencialmente2. Ha quedado claro que las sinapsis pueden considerarse como un sistema de dos compartimentos: un compartimento presináptico que contiene vesículas para la liberación de neurotransmisores y un compartimento postsináptico con receptores3. Esta visión simplista, en los últimos veinte años, se ha convertido en una compleja red de proteínas necesarias para transducir la unión del transmisor a la señalización4.
Las ganancias en el entendimiento se deben en parte a las técnicas de superrescencia que superaron el límite de difracción de la microscopía de luz convencional para adaptarse a la dimensión de las sinapsis mejores5,6,7,8,9,10. Debido al límite de difracción, un microscopio óptico no puede alcanzar una resolución superior a 200 nm lateralmente11,12. Para eludir este límite, se crearon técnicas de superrescencia, utilizando diferentes enfoques y alcanzando diferentes resoluciones de límite de subdifacción: SIM, STED (Microscopía de Agotamiento de Emisiones Estimuladas), PALM (Microscopía de Localización Fotoactiva) y STORM (Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica)13,,14. SIM duplica la resolución espacial de los sistemas de microscopía de campo ancho basados en láser mediante la inserción de una rejilla de difracción en la trayectoria del haz de excitación15. La rejilla móvil difracta los rayos láser para crear un patrón de iluminación conocido, generalmente rayas. Este patrón de luz estructurado específicamente se superpone a la distribución espacial desconocida del tinte fluorescente (de la muestra). Los flecos de interferencia formados por los dos patrones codifican para detalles finos indistinguibles con microscopía de campo ancho normal. La imagen superconsfectada final se obtiene combinando y decodificando con métodos matemáticos varias imágenes crudas de la misma muestra obtenidas por las traducciones y rotaciones de la rejilla de difracción. La resolución de las imágenes superconsueltas alcanza los 100 nm en las direcciones lateral y 500 nm en las direcciones axiales para 2D-SIM15 o 100 nm en las direcciones lateral y 250 nm en las direcciones axiales para 3D-SIM16.
La nueva comprensión de la sinapsis es aún más importante a la luz de los muchos trastornos neurológicos donde la disfunción sináptica juega un papel importante en la aparición y progresión17,,18. Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Down, Enfermedad de Parkinson, enfermedades priónicas, epilepsia, trastornos del espectro autista y síndrome X frágil entre otros se han relacionado con anomalías en la composición sináptica, morfología y función19,,20,,21,,22.
Recientemente, utilizando un conjunto de anticuerpos específicos de SUMO, utilizamos SIM para mostrar la co-localización en las neuronas primarias del hipocampo de las proteínas SUMO con los marcadores pre y postsinápticos sinaptofisina y PSD95 en el nivel de superrescresía23. Esto nos permitió confirmar la evidencia de microscopía bioquímica y confocal de la localización SUMO en las neuronas.
Aquí, describimos un protocolo para estudiar la localización de proteínas en las neuronas primarias del hipocampo de ratón. Al mismo tiempo, este protocolo puede adaptarse a diferentes tipos de cultivos neuronales primarios.

<table><tbody><tr><td>Solución de azul de tripano al 0,4%...</td><td>Thermo Fisher Scientific 15250061</td><td></td><td>Chemical</td></tr><tr><td>70 y micro; Filtro M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>Scientific-Antibody</td></tr><tr><td>Antibody SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td> químicos <td>con cámara Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher Scientific-Antibody</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FBS (Hyclone)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres, 0,1 &mu; m, amarillo&ndash; verde fluorescente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck Life Science</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Chemical HEPES Merck</td><td>Life Science</td><td>H3537</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>L-Cystein&nbsp;</td><td>Merck Ciencias de la Vida&nbsp;</td><td>C6852-25g</td><td>Químico</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21575022</td><td>Medio</td></tr><tr><td>MgCl Merck</td><td>Life Science</td><td>M8266</td><td>Químico</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>1.091.371.000</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td>Medio</td></tr><tr><td>N-SIM Microscopio de superresolución</td> <td>Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Life Science& nbsp;</td><td>P-3125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído químico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Pen/Strep 10x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>solución</td></tr><tr><td>salina tamponada con fosfato químico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Poly-L lisine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PSD95&nbsp;</td><td>NeuroMab</td><td>K28/43</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondo</td><td>Thermo</td><td></td><td>12052712 Equiment</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Sinaptofisina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S5768&nbsp;</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Tritón X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td>Inhibidor químico</td></tr> de <tr><td>tripsina&nbsp;</td><td>Merck Ciencias de la Vida&nbsp;</td><td>T9003-500MG</td><td>Químico</td></tr></tbody></table>

imágenes de superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución. En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada (SIM). SIM es una técnica de iluminación de luz estanco que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nm. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.

Aquí presentamos el flujo de trabajo estándar para estudiar la co-localización de proteínas neuronales. Primero calibramos el microscopio y luego realizamos el análisis SIM de las muestras. Para calibrar el sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 m de diámetro. Al obtener imágenes 3D-SIM superconsúcesas de los cordones, los datos de imagen subyacentes se transforman en Fourier para volver a convertirlas en una representación de frecuencia espacial. En la Figura 2A,el patrón de ...

Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución.En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a un nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada. SIM es una técnica de iluminación de luz con patrón que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nanómetros. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.La clave para permitir el análisis a nivel de superrescencia es, sin embargo, los reactivos utilizados durante la adquisición, tales como cubiertas con cámara y soluciones de montaje compatibles con el índice de difracción del objetivo. Para obtener una neurona primaria hipocampal de ratón, aísle los hipocampos de P1 a P4 cachorros. Células de placa a 70.000 células por pozo en un volumen de 200 microlitros por pozo.Espere hasta que las neuronas primarias del hipocampo maduren completamente de 12 a 14 días después del enchapado para realizar estudios de co-localización. Añadir 4%paraformaldehído, PFA, en PBS 200 microlitros por pozo a las neuronas para fijarlas rápidamente. Retire la solución e incubar las muestras con 1%albúmina sérica bovina, BSA, en PBS a 200 microlitros por pozo durante una hora a temperatura ambiente para cubrir pasivamente todas las superficies de unión libre de la placa con una proteína irrelevante para el análisis.Un búfer de bloqueo basado en BSA sin Triton X-100 reduce el fondo de anticuerpos de manera más eficiente que el mismo búfer con 0.2%Triton X-100. Agregue el anticuerpo primario. Como control negativo, no agregue ningún anticuerpo primario a uno de los pozos.Monte las células con un montura compatible con SIM, por ejemplo, ProLong Glass Antifade Mountant. Cubra y proteja las celdas con una cubierta, por ejemplo, una cubierta redonda con un diámetro de ocho milímetros.También se pueden utilizar plazas. Guarde los cubreobjetos con cámara a temperatura ambiente y espere al menos 48 horas antes de adquirir imágenes. El vidrio de diamante requiere al menos dos días de curado antes de las adquisiciones de superresor resolución.Utilice dos estrategias para asegurar la especificidad de los anticuerpos. El primero es el uso de al menos dos anticuerpos diferentes dirigidos al mismo sustrato. La segunda estrategia es la neutralización de anticuerpos por incubación con el objetivo de proteína purificada, o la utilizada para aumentar el anticuerpo.Utilizamos rutinariamente un microscopio de superconorción N-SIM fabricado por Nikon para nuestro análisis. Las instrucciones siguientes deben estar destinadas a la adquisición de imágenes SIM independientemente del microscopio de uso. También es importante maximizar el rendimiento del microscopio para realizar una calibración precisa de los instrumentos, incluyendo anillo de corrección, alineación láser y enfoque de bloque de rejilla.Antes de la adquisición de imágenes SIM, el sistema requiere una calibración adecuada con perlas fluorescentes de tamaño de subrescresación específicas. Un ejemplo son las microesferas TetraSpeck. Estas perlas están teñidas con diferentes tintes fluorescentes para permitir la calibración de diferentes láseres con una sola muestra.En un baño de agua, sonicar alrededor de 1.8 veces 10 a la 8a microesferas fluorescentes durante 10 minutos. Diluir las microesferas fluorescentes una de cada 500 en agua doble destilada. Sonicar una segunda vez durante 10 minutos adicionales.Pipeta 15 microlitros de las perlas diluidas en un pozo de un cubreobjetos con cámara. Deje secar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir 10 microlitros de la solución de montaje, p. ej.ProLong Glass, y coloque un cubreobjetos de ocho milímetros en la parte superior. Espere al menos 48 horas para permitir un curado adecuado. Encienda el microscopio y los láseres.Deje que el sistema se caliente para alcanzar el equilibrio térmico de todos los componentes del microscopio y el sistema de microscopio de superconorción SIM requiere al menos tres horas. Seleccione el objetivo 100X. Inicie la calibración alineando los láseres con el centro del bloque de rejilla de difracción.En el sistema N-SIM, una perilla de micrómetros y una cámara dedicada permiten centrar los haces de luz al objetivo. Inserte la cubierta con cámara del microscopio para su visualización. Ajuste el sistema al espesor de la cubierta con cámara ajustando la cubierta de corrección objetiva.NIS Software, el software propietario proporcionado con sistemas de microscopio de superresor resolución N-SIM, tiene una función automática para regular la corrección de colores. Ajuste el enfoque del bloque de rejilla para cada canal para garantizar una iluminación de patrón estructurado enfocada en la muestra. El software proporciona una función automática para esta tarea.Adquiera imágenes SIM 3D en bruto de las microesferas multicolores. Calcula para cada longitud de onda separada la transformación de Fourier de la imagen superconsuel. Si la imagen transformada no puede obtener un patrón correcto similar a una flor, reinicie la calibración ya que no se ha logrado la superrtención.En la imagen superconsútil, seleccione una sola microesfera y calcule su perfil de intensidad para cada canal para medir la resolución alcanzada. Ahora debería estar cerca de 100 nanómetros lateralmente. Realice el registro de canales superponiendo una adquisición multicanal de las microesferas.El objetivo es colisionar todas las señales de canal de forma lateral y axial. Esto eliminará las aberraciones cromáticas debido a la desalineación de los diferentes canales y ayudará al análisis de la co-localización. Confirme la calidad de la calibración utilizando el paso de fase de iluminación de funciones y el enfoque con patrón de iluminación de SIMcheck, un conjunto de plugins para la aplicación de código abierto ImageJ.Comience a analizar la muestra utilizando un objetivo 40X en modo confocal o de campo ancho. Esto permite la navegación de la muestra, manteniendo un buen detalle y un gran campo de visión. Utilice la señal de anticuerpos MAP2 para detectar un área que represente procesos neuronales.Adquiera imágenes de la muestra en modo confocal para determinar la calidad de la tinción. Cambie al objetivo 100X. Aplique aceite al objetivo 100X.Adquiera una imagen de campo ancho o confocal que se utilizará más adelante para evaluar la calidad de la imagen superconstionada. Cambie al modo SIM 3D. Mediante las ventanas de diálogo para establecer los parámetros para la adquisición, seleccione la configuración de profundidad de bits más alta disponible para maximizar la información de color.Típicamente, 16 bits es la opción estándar. Además, para mejorar la relación señal-ruido, seleccione un valor de baja frecuencia para la adquisición, como un megahercios. Usando ventanas de histograma, ajuste la potencia del láser para obtener una respuesta lineal de la señal para evitar la pérdida de información, limite los píxeles saturados en las imágenes.El sistema N-SIM utiliza una cámara Andor iXon3. Cuando trabaje a 16 bits, elija una intensidad objetivo de 16.000 para garantizar la respuesta lineal de la cámara. Alternativamente, elija un rango entre 30.000 y 45.000 para maximizar el rango dinámico de las adquisiciones.Establezca la potencia del láser entre 0,1% y 50% al tomar imágenes de las muestras y los tiempos de exposición entre 50 milisegundos y dos segundos. Las potencias láser superiores al 50% pueden causar un fotoblanqueo rápido de los fluoróforos en uso. Comience a adquirir las imágenes en modo 3D SIM.Utilice SIMcheck, un conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para evaluar la calidad de las adquisiciones de las imágenes en bruto. Si SIMcheck no detecta artefactos ni problemas de calidad, adquiera un mínimo de 10 imágenes de réplicas técnicas completas para permitir el análisis estadístico. Las imágenes adquiridas son datos sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes SIM reconstruidas que se utilizarán para su posterior análisis.En el protocolo, sugerimos utilizar sinaptofisina y PSD-95 como marcadores sinápticos previos y posteriores. Sin embargo, se pueden utilizar marcadores adicionales. Un enorme cuerpo de literatura apoya el uso de otras proteínas, como la drebrin y el fabanón como marcadores sinápticos.Las imágenes adquiridas por 3D SIM son imágenes sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes superconsueltas reconstruidas. La reconstrucción incorrecta de imágenes sin procesar puede dar lugar a artefactos que afectarían al análisis de las muestras. Por lo tanto, se debe prestar una gran atención a la elección adecuada de los parámetros de reconstrucción.Procesar las imágenes sin procesar utilizando el software de análisis de reconstrucción del microscopio para obtener una imagen superconsuel. Alternativamente, utilice un plugin ImageJ freely fairSIM para reconstruir las imágenes sin procesar. Calcule la transformación de Fourier de las imágenes superconsuelven utilizando el software de reconstrucción del microscopio o el plugin ImageJ SIMcheck.Una buena imagen reconstruida debe devolver, para cada canal, una imagen similar a una flor. Si las imágenes reconstruidas no pueden volver a crear una forma similar a una flor, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruya modificando los parámetros de reconstrucción, como el filtrado lineal, la apodización y la supresión de orden cero. En el software NIS que utiliza la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique el contraste de modulación de iluminación del parámetro, la supresión de ruido de alta resolución y la supresión fuera de foco.Analice la imagen reconstruida para detectar artefactos de forma imparcial mediante NanoJ-SQUIRREL, un complemento basado en ImageJ, para evaluar la calidad de las imágenes superconsúcedas. En nuestro análisis de la co-localización, utilizamos dos enfoques. El primero es un enfoque visual basado en el análisis de perfil que muestra eventos individuales de co-localización y que identifica la contribución de cada canal.Como primer paso para estudiar la co-localización entre marcadores sinápticos y una proteína de interés, tome una imagen superconsuelta y analice un solo locus para determinar la superposición de la señal. Identifique un solo locus en la imagen superconsuel. Obtener los perfiles de intensidad de las señales fluorescentes al locus de interés.Si el análisis de perfil ha sugerido una sola co-localización de locus, se puede llevar a cabo un análisis más general de toda la imagen calculando los coeficientes de Pearson y Mander. Utilice JACoP, un plugin de ImageJ, para determinar dos parámetros de co-localización, Pearson y Mander. Después de haber calibrado el sistema y evaluado la calidad de las imágenes reconstruidas, comenzamos a analizar los cultivos neuronales primarios manchados con un anticuerpo contra MAP2, un marcador neuronal, PSD-95, un marcador postsináptico, y nuestra proteína objetivo SUMO1.Primero analizamos la muestra realizando microscopía confocal de cuatro canales con un objetivo 40X. Al seleccionar un área que representa los procesos neuronales, cambiamos a un objetivo 100X. Adquirimos imágenes confocales y SIM de la misma zona para evaluar la calidad de la reconstrucción con NanoJ-SQUIRREL y realizar análisis de co-localización.Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para la comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también están en la base de trastornos neurológicos complejos, como una de las formas más comunes de demencia enfermedad de Alzheimer. El protocolo descrito aquí permite el estudio de la composición proteica de las sinapsis con una técnica de microscopía de superrescidad llamada microscopía de iluminación estructurada.

super-resolution-imaging-to-study-co-localization-proteins-synaptic

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Se describe cómo implementar la localización microscopía fotoactivado (PALM) basado en estudios de vesículas en las neuronas cultivadas, fijos. Los componentes clave de nuestro protocolo de etiquetado incluyen vesículas con quimeras fotoconvertible, recogiendo imágenes crudas escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de super-resolución.

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Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Aprende a utilizar microscopía de superresolución SIM para estudiar la co-localización de proteínas en neuronas primarias de hipocampo de ratón. Este protocolo permite visualizar interacciones sinápticas con resolución de ~100 nanómetros.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

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