Evaluación De La Expresión Del Complejo De Histocompatibilidad Mayor Clase I En Las Neuronas Primarias Murinas Del Hipocampo Por Citometría De Flujo

Este protocolo utiliza la citometría de flujo para evaluar cuantitativamente la expresión extracelular de MHC clase 1 en neuronas primarias cultivadas a partir de ratones. La inmunotinción de NC2 para la expresión de MHC1 también se puede realizar para evitar una pérdida de señal debido a condiciones de proteína, terciarias, estructurales, permeabilización o desnaturalización. Además de dirigir las respuestas inmunitarias a las infecciones, el MHC de clase 1 modula las conexiones sinápticas neuronales.

Sin embargo, aún se desconocen los factores que regulan la expresión del MHC de clase 1. Los pasos de la disección del cerebro embrionario requieren práctica para dominarlos. Al aprender la técnica, ten cuidado de practicar la disección sin preocuparte por el tiempo o el proceso de cultivo posterior.

Para el aislamiento del hipocampo embrionario, coloque el primer cerebro embrionario de ratón extraído bajo un microscopio de disección estereoscópica. Y use dos pares de pinzas Dumont estériles número 5 para pellizcar los bulbos olfativos y separar completamente las meninges. Una vez que las meninges se han extirpado por completo, el lado superior de la corteza se abrirá lateralmente para exponer el hipocampo.

Use las pinzas para pellizcar el hipocampo lejos de la corteza adjunta y transfiera cuidadosamente el hipocampo aislado a un tubo cónico estéril de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de medio Hibernate-E en hielo. Cuando todos los hipocampos se hayan recogido en un solo tubo de 15 mililitros, sedimente el tejido cerebral por centrifugación. Sustituir el sobrenadante por 0,5 mililitros de papaína recién preparada disociación por embrión y mezclar el tubo varias veces por inversión.

Colocar el tejido a 37 grados centígrados durante 30 minutos, mezclando las muestras por inversión cada 10 minutos antes de volver a recoger el tejido por centrifugación. Sustituya el sobrenadante por un volumen igual de Hibernate-E Medium fresco y utilice una pipeta Pasteur pulida al fuego de vidrio completamente abierta para triturar el tejido 10 veces. Después de dejar que el tejido se asiente durante dos minutos, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.

Añada un volumen igual de Hibernate-E Medium al tejido y utilice una pipeta Pasteur de vidrio medio abierto pulido al fuego para triturar el tejido 10 veces. Después de dejar que el pañuelo se asiente durante otros dos minutos, agrupe el sobrenadante en el tubo de 50 mililitros. Añada un volumen igual de Hibernate-E Medium a los pañuelos y triture el tejido 10 veces con una pipeta Pasteur pulida a fuego de vidrio abierto de un cuarto de vidrio.

Después de dejar que el pañuelo se asiente durante dos minutos, enrolle el sobrenadante en el tubo de 50 mililitros. Recoger las células disociadas en el sobrenadante por centrifugación. Y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de crecimiento neuronal para contar: diluya las células hasta una densidad de siembra final de cinco veces 10 a la quinta célula viable por mililitro de medio de crecimiento neuronal y agregue un mililitro de células a cada pocillo de una placa recubierta de poli-D-lisina de 12 pocillos.

A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares, sustituyendo la mitad del medio por un volumen igual de medio fresco dos veces por semana durante la vida útil del cultivo. Para evaluar la capacidad de las neuronas cultivadas para expresar MHC1, en el día apropiado de cultivo, reemplace 0,5 mililitros de sobrenadante en cada pocillo con 0,5 mililitros de medio de crecimiento de neuronas fresco suplementado con 200 unidades por mililitro de interferón beta durante una incubación de seis a 72 horas en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, lavar cada pocillo una vez con Neurobasal Medium frío sin suplementos antes de añadir 0,5 mililitros de Neurobasal Media frío no suplementado con un microgramo por mililitro de bloque FC y un microgramo por mililitro de anticuerpo anti-MHC1 conjugado con fluorescencia a cada pocillo.

Después de una incubación de 45 minutos a cuatro grados centígrados, protégelo de la luz. Lave cada pocillo una vez con Dulbeccos PBS frío. A continuación, añada 0,5 mililitros de tampón de disociación celular sin enzimas a temperatura ambiente a cada pocillo y agite para desalojar las células.

Confirme la disociación bajo un microscopio de cultivo de tejidos invertido y agregue 0,5 mililitros de tampón FACS a cada pocillo. Triture las células para dispersar grupos y transfiera todo el volumen de cada pocillo a tubos de microcentrífuga individuales de 1,7 mililitros. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS fresco por tubo.

Transfiera cada suspensión a pocillos individuales de una placa inferior en U de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de reactivo fijador a cada pocillo. Triturar varias veces para evitar la aglomeración de células e incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, centrifugar para recoger las células en el fondo de los pocillos y resuspender los gránulos en 200 microlitros de tampón FACS fresco por pocillo.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de reactivo de permeabilización suplementado con anticuerpo anti-núcleos neuronales conjugados con fluorescencia por pocillo. Después de mezclar, incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente con un balanceo protegido de la luz. Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación tres veces, resuspendiendo los gránulos en 100 microlitros de tampón FACS fresco entre centrifugaciones.

Después del último lavado, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de formaldehído al 2% en tampón FACS con una mezcla completa. Las neuronas pueden ser identificadas a través de la activación secuencial de eventos totales para excluir los desechos celulares y dobletes y por la positividad de sus núcleos neuronales. A continuación, las células positivas para los núcleos neuronales pueden analizarse más a fondo para determinar su positividad para MHC1.

A partir de estos datos, se puede calcular el porcentaje de neuronas positivas para la tinción de MHC1 y la intensidad media de fluorescencia, revelando que, por ejemplo, el tratamiento con interferón beta regula significativamente el porcentaje y la intensidad de la expresión de las neuronas MHC1. Con ligeras modificaciones, estos métodos se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales como las neuronas corticales o para probar diferentes marcadores celulares, moléculas estimulantes o modificaciones genéticas.