Name: Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a aislar microglía primaria de tejido cerebral humano adulto mediante digestión con tripsina-EDTA y centrifugación. Este método robusto y rentable reduce la pérdida celular y permite estudios de neuroinmunología.

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El laboratorio de SJ se estableció con subvenciones institucionales del IITJ y está financiado por subvenciones del Departamento de Biotecnología (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) y del Ministerio de Electrónica y Tecnología de la Información del Gobierno de la India (No 4(16)/2019-ITEA). Las secciones de tejido cerebral humano se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas de All India (AIIMS) Jodhpur después de la autorización del comité de ética institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, estudiante de B.Tech Student miembro de la Sociedad de Diseño y Artes IIT Jodhpur, por el apoyo a la videografía.

Todos los tejidos fueron adquiridos después de la autorización ética de los comités de ética del Instituto Indio de Tecnología Jodhpur y el Instituto de Ciencias Médicas de all India (AIIMS) Jodhpur.
1.Adquisición y procesamiento de tejidos (Día 0)
<ol><li>Recoger el tejido en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de líquido cefalorraquídeo artificial helado (aCSF) (2 mM CaCl2a 2H2O, 10 mM de glucosa, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2a6H 2O, 202 mM sacarosa)20. Asegúrese de que el tubo se mantiene en hielo si el tejido necesita ser transferido a un lugar diferente. NOTA: Prepare el aCSF en agua destilada autoclavada. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 m en la campana laminar. Esto se puede almacenar durante 1 mes a 4 oC.</li>
	<li>Limpie el tubo de recogida cuidadosamente con 70% de alcohol y transfiera a una cámara de flujo de aire laminar aséptica.</li>
	<li>Deseche el aCSF cuidadosamente y pese el tejido en una condición aséptica. El peso del tejido es esencial para calcular el volumen de tripsina-EDTA necesario para los pasos posteriores.</li>
	<li>Mantener el tejido en aCSF fresco y caliente a 37 oC durante 5 minutos. Este paso es fundamental para evitar la muerte celular.</li>
	<li>Deseche el aCSF y lave el tejido una vez con 1 PBS (solución salina tamponada de fosfato) a 37 oC. Asegúrese de que toda la sangre se lave con lavados repetidos de PBS (según sea necesario).</li>
	<li>Incubar el tejido en PBS caliente, a 37oC, durante 5 min.</li>
	<li>Deseche PBS cuidadosamente y transfiera el tejido a una placa Petri esterilizada. PBS se puede quitar con una pipeta. Esto evitará cualquier pérdida de tejido.</li>
	<li>En dados el tejido en trozos pequeños (al menos 1 mm3)utilizando un bisturí estéril. El tejido finamente cortado en cubos proporciona una mayor superficie tisular para la disociación de tejidos por trippsina-EDTA asegurando un mayor rendimiento.</li>
	<li>Transfiera el tejido cortado en cubos a un tubo de 50 ml que contenga 10 ml/g de tejido de 0,25% de trippsina-EDTA y mezcle pipeteando a través de una pipeta serológica de 10 ml. Agregue 2 ml de tripps/EDTA a un plato de Petri y lave bien la placa con la ayuda de la pipeta. Añade esta tripina al tubo de halcón. Esto minimiza la pérdida de tejido y células mientras se dicing.</li>
	<li>Incubar el tubo en una coctelera durante 30 minutos a 37 oC a 250 rpm. Este paso aumenta la disociación de las células del tejido.</li>
	<li>Al final de la incubación, añadir 10 mL de medio neutralizador (50% DMEM/50% F12 con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar la tripina. Mezclar con una pipeta serológica de 10 ml. La cantidad de medios neutralizantes añadidos debe ser igual a la cantidad de tripsina utilizada.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 2.000 x g a 4 oC durante 10 minutos.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y re-suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo (50% DMEM/50% F12 con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% sobrenadante L929, 10% FBS). NOTA: Las células L929 se cultivan en DMEM (DMEM con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). Se debe seguir el método de cultivo recomendado por ATCC para el cultivo celular. El sobrenadante debe recogerse del matraz de cultivo que sea al menos del 75% confluente. Se puede recoger a granel y almacenar a -80 oC para evitar la degradación de los factores de crecimiento. Se recomienda añadir L929 sobrenadante por separado en matraces en lugar de añadir al medio de cultivo de stock.</li>
	<li>Placar las células en un matraz T-25, adecuado para las células adherentes, y añadir 4 ml de medio de cultivo adicional. Incubar el matraz a 37oC con 5% de CO2. Agitar cuidadosamente el matraz para dispersar homogéneamente el tejido. Evite llevar el soporte al cuello del matraz, mientras agita, ya que esto puede aumentar las posibilidades de contaminación.</li>
</ol>2.Cultivo celular (Día 2)
<ol><li>Recoger los medios del matraz de cultivo T-25 preparado el día 0 en tres tubos centrífugos de 1,5 ml mediante la recogida del mismo volumen de medios en cada tubo. Lave el matraz una vez con 1 x PBS. Agitar el matraz suavemente para eliminar los fragmentos de tejido remanente que queden. Evite el temblor brusca del matraz, ya que los fragmentos remanentes no afectarán negativamente al cultivo. Añadir 5 ml de medios de cultivo frescos al matraz.</li>
	<li>Centrifugar los medios recogidos a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 oC durante 4 minutos.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante de cada tubo y agregue 1 ml de medio de cultivo a uno de los tubos. Mezclar bien con la pipeta. Agregue en serie los medios mixtos con las células a otros tubos. Mezclar bien con la pipeta y agrupar las células en un tubo.</li>
	<li>Placar las células en un matraz T-25 separado, adecuado para las células adherentes. Añadir 4 ml de medio de cultivo e incubar el matraz a 37oC con un 5% de CO2.</li>
</ol>3.Cultivo celular (Día 4)
<ol><li>Deseche el soporte de ambos matraces y añada 5 ml de medios de cultivo al matraz.</li>
	<li>Incubar el matraz a 37oC con 5% deCO2 durante 2 días.</li>
</ol>4. Cultivo celular (Día 6)
<ol><li>Las células estarán listas para más experimentos.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
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<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Microglia asegurar la homeostasis en el cerebro normal y desempeñar un papel central en la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas4. Las microglia son fundamentales para el neurodesarrollo y la formación de sinapsis2. Los estudios microgliales han demostrado ser fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades neurológicas4. La microglia de roedores es el modelo predominante de elección para los estudi...

El sistema nervioso central (SNC) está construido de una compleja red de neuronas y células gliales1. Entre las células gliales, la microglia funciona como las células inmunitarias innatas del SNC2,3. Microglia es responsable de mantener la homeostasis en el SNC sano4. Microglia también juega un papel importante en el neurodesarrollo, mediante la poda de sinapsis2. Las microglia son fundamentales para la fisiopatología de varias enfermedades neurológicas, incluyendo pero no limitado a; Enfermedad de Alzheimer5, Enfermedad de Parkinson6, accidente cerebrovascular7, esclerosis múltiple8, lesión cerebral traumática9, dolor neuropático10, lesión de la médula espinal11 y tumores cerebrales como gliomas12.
Los estudios relacionados con la homeostasis y las enfermedades del SNC utilizan microglia de roedores debido a una escasez de protocolos de aislamiento de microglia primaria humana rentables y eficientes en el tiempo13. La microglia de roedores se asemeja a la microglia humana primaria en la expresión de genes como iba-1, PU.1, DAP12 y receptor M-CSF y han sido eficaces en la comprensión de cerebros normales y enfermos13. Curiosamente, la expresión de varios genes inmunes relacionados como TLR4, MHC II, Siglec-11 y Siglec-3 varía entre la microglia humana y la microglia de roedores13. La expresión de varios genes también varía en la expresión temporal y en las enfermedades neurodegenerativas en ambas especies14,,15. Estas diferencias significativas hacen de la microglia humana un modelo esencial para estudiar la función de la microglia en la homeostasis y la enfermedad. La microglia humana primaria también puede ser una herramienta eficaz para el cribado preclínico de posibles candidatos a medicamentos16. Las razones antes mencionadas subrayan la creciente necesidad de protocolos rentables para el aislamiento de la microglia humana primaria.
Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de la microglia humana primaria a partir del tejido cerebral humano adulto recogido como resultado de la ventana quirúrgica creada para resección de tumores u otras resecciones quirúrgicas. El método aquí es considerablemente diferente de los métodos existentes. Pudimos aislar y cultivar microglia después de un tiempo de tránsito de unos 75 minutos desde el sitio de recolección de tejidos hasta iniciar el protocolo de aislamiento en el laboratorio. Hemos utilizado el sobrenadante de células de fibroblastos L929 para promover el crecimiento de microglia aislada. Este método se centra específicamente en la cultura y el desarrollo de sólo la microglia primaria. El cultivo resultante preparado es de aproximadamente 80% microglia. Mientras que otros protocolos proporcionan un cultivo enriquecido de microglia por centrifugación de gradiente de densidad, citometría de flujo y cuentas magnéticas, el protocolo es una forma rápida, simple, robusta y rentable de cultivar microglia humana primaria17,18,19,20. La capacidad de utilizar el tejido cerebral adulto vivo extirpado quirúrgicamente en lugar de los tejidos cerebrales fijos de los cadáveres demuestra una ventaja adicional de este método en contraste con los procedimientos existentes18,,21.

<table><tbody><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (4 & grados; C)</td> <td>Tubos</td> de centrífuga Sigma <td>146532</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 2</td><td>Nuevo Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio con glutamina</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de frasco (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína Ricinus communis aglutinina-1</td><td>Vector</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield con DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP anticuerpo</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador incubador</td><td>Nuevo Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 línea celular</td><td>ATCC</td><td>NCTC clon 929 [célula L, L-929, derivado de la cepa L] (ATCC&nbsp; CCL-1)</td><td></td></tr><tr><td>Flujo de aire laminar</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monosódico</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-12 Jamón</td><td>Medio Himedia</td><td>Al106S</td> Placa de <td></td></tr><tr><td>Petri</td><td>Duran Grupo</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Himedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Labware</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato sódico</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa (0,2&mu;, 25 mm de diámetro)</td><td>Matraces</td><td></td> de cultivo de tejidos Axiva SFPV25R <td></td></tr><tr><td>T-25 aptos para el cultivo de células adherentes.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

obtención de microglia humana del tejido cerebral humano adulto

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Las microglia son células inmunitarias innatas residentes del sistema nervioso central (SNC). La microglia desempeña un papel fundamental durante el desarrollo, en el mantenimiento de la homeostasis y durante la infección o lesión. Varios grupos de investigación independientes han puesto de relieve el papel central que desempeñan las microglia en las enfermedades autoinmunes, los síndromes autoinflamatorios y los cánceres. La activación de la microglia en algunas enfermedades neurológicas puede participar directamente en procesos patógenos. La microglia primaria es una herramienta poderosa para entender las respuestas inmunitarias en el cerebro, las interacciones celulares y celulares y los fenotipos de microglia desregulados en la enfermedad. La microglia primaria imita las propiedades microgliaales in vivo mejor que las líneas celulares microgliaales inmortalizadas. La microglia adulta humana exhibe propiedades distintas en comparación con la microglia fetal y de roedores humanos. Este protocolo proporciona un método eficiente para el aislamiento de la microglia primaria del cerebro humano adulto. El estudio de estas microglias puede proporcionar información crítica sobre las interacciones entre células celulares entre la microglia y otras poblaciones celulares residentes en el SNC, incluidos los oligodendrocitos, las neuronas y los astrocitos. Además, la microglia de diferentes cerebros humanos puede ser cultivada para la caracterización de respuestas inmunitarias únicas para la medicina personalizada y una miríada de aplicaciones terapéuticas.

Mediante el uso del protocolo antes mencionado (Figura 1), pudimos aislar la microglia humana primaria de los tejidos cerebrales resecados quirúrgicamente en vivo. Las células cultivadas se tiñeron con Ricinus communis agglutinina-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) y con proteína ácida fibrillaria Glial (GFAP) para astrocitos (rojo) (Figura 2) como se describió anteriormente22,<su...

Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

El objetivo general del protocolo es aislar las células primarias de microglia de los tejidos cerebrales humanos adultos vivos. En nuestro caso, esto se recogió como ventana quirúrgica durante la cirugía. Esto se logra mediante la recolección inicial de los tejidos cerebrales en pbS frío hielo, el tejido se corta en cubos de 1 mm piezas pequeñas, y acabo de hacerlo con la ayuda de la trippsina EDTA.Después de esto, las células se cosechan por centrifugación y se vajilla en un matraz adecuado para el cultivo de células de andrógenos durante 48 horas. Las células se cosechan una vez más del matraz y se cultivan hasta su uso posterior. Las células primarias de microglia humana ahora se pueden caracterizar mediante el uso de inmunocitoquímica y utilizarse para experimentos adicionales.La principal ventaja de nuestro protocolo para aislar las células de microglia de los tejidos cerebrales humanos adultos es que proporciona eficazmente células de microglia humanas adultas primarias de una manera muy rentable. El protocolo es robusto y reduce la pérdida de células al reducir el número de pasos que se utilizan en los protocolos existentes. Recoger el tejido en un tubo Falcon de 50 ml que contenga 10 ml de aCSF helado.Limpie el tubo de recogida cuidadosamente con 70% de alcohol y transfiera a una cámara de flujo de aire laminar aséptica. Deseche el aCSF cuidadosamente y pese el tejido en el tubo Falcon. Calcular el peso aproximado del tejido deduciendo el peso del tubo Falcon vacío.Caliente fresco aCSF a 37 grados centígrados. Mantenga el tejido en aCSF caliente durante cinco minutos. Este paso es fundamental para evitar la muerte celular.Deseche aCSF cuidadosamente. Y lave el tejido una vez con 1X PBS calentado a 37 grados centígrados. Asegúrese de que toda la sangre se lave con lavados repetidos de PBS según sea necesario.Incubar el tejido en PBS caliente durante 5 minutos. Deseche la mitad del PBS cuidadosamente. Transfiera el tejido junto con el PBS restante a un plato de Petri esterilizado.Retire el PBS restante cuidadosamente con una pipeta de 1 ml. Esto evitará la pérdida de tejido. Dados que se emiten en al menos 1 mm cubo trozos pequeños utilizando un bisturí estéril.Añadir 2 ml de 0.25%trypsin EDTA a la placa Petri y lavar la placa a fondo con la ayuda de la pipeta. Transfiera el tejido cortado en cubos a un tubo Falcon de 50 ml que contenga 10 ml por gramo de tejido de 0,25% de trippsina EDTA. Mezclar pipeteando a través de una pipeta serológica de 10 ml.Incubar el tubo en una coctelera durante 30 minutos a 37 grados centígrados y la velocidad de 250 rpm. Añadir 10 ml de medio neutralizante para neutralizar la trippsina. Mezclar bien con una pipeta serológica de 10 ml.Centrifugar el tubo a 2000G a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de medio de cultivo. Poner las células en un matraz T25 adecuado para células de andrógenos y añadir 4 ml de medio de cultivo adicional.Medio de cultivo contendrá 20%L929 sobrenadante y 1%estreptomicina. Se recomienda añadir L929 sobrenadante por separado en matraces en lugar de añadir al medio de cultivo de stock. Hemos terminado con el matraz para desechar homogéneamente el tejido.Evite llevar el soporte al cuello del matraz mientras agita, ya que esto puede aumentar las posibilidades de contaminación. Incubar el matraz a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 48 horas. Recoger los medios del matraz de cultivo T25 preparado el día 0 en tubos centrífugos.Centrifugar los medios recogidos a 1.466G a 4 grados centígrados durante 4 minutos. Mientras se centrifuga el medio recogido, lave el matraz del día 0 una vez con 1X PBS. Agitar el matraz suavemente para eliminar los fragmentos de tejido remanente que queden.Evite el temblor brusca del matraz, ya que los fragmentos remanentes no afectarán negativamente al cultivo. Añadir 5 ml de medios de cultivo frescos al matraz. Deseche el sobrenadante de los tubos centrifugados.Añadir 1 ml de medio de cultivo a uno de los tubos y mezclar bien con pipeta. Agregue en serie los medios mixtos con las células a otros tubos y mezcle bien. Poner las células en un matraz T25 separado adecuado para células de andrógenos.Añadir 4 ml de medios de cultivo frescos al matraz. Incubar ambos matraces a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 48 horas. Deseche el soporte de ambos matraces y añada medios de cultivo frescos de 5 ml.Incubar los matraces a 37 grados centígrados al 5% de CO2 durante 48 horas. En el sexto día, las células estarán listas para más experimentos. En las imágenes representadas aquí.Primer panel de la sección A astrocitos manchados con GFAP, de color verde. En el segundo panel, de la sección Una mancha de microglia con RCA, de color verde. En la sección B microglia teñida con RCA, que es de color verde, y los astrocitos se tiñen con GFAP, de color rojo.La superposición de las imágenes muestra microglia y astrocitos juntos. De las imágenes se desprende claramente que la mayoría de las células del cultivo preparados son microglia. Las imágenes fueron cuantificadas por control cegado y el resultado se representa en la sección C.Los resultados mostraron que alrededor del 80% de las células en el cultivo preparados son células de microglia.Esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora y media. Después de este procedimiento debe tener una buena comprensión de cómo selecciono la microglia de cebado de los tejidos cerebrales humanos adultos, que se puede utilizar más adelante para experimentos posteriores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales...

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

El video muestra una técnica para aislar la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto. En primer lugar, la corteza se somete a segmentación y homogeneización para eliminar las neuronas y otras células gliales, preservando la microglía. Después de eso, la suspensión celular se expone a microesferas magnéticas antimielina y a un campo magnético, separando efectivamente la microglía y las células mieloides de los restos de mielina y las células que contienen mielina.

Aislamiento de la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto

El video demostró el método de aislar y cultivar células del cerebro de un ratón neonatal. Implicó la disociación enzimática y mecánica del cerebro, seguida de cultivo en medios de crecimiento carentes de factor de crecimiento neuronal para obtener una población glial mixta.

Obtención de un cultivo de células gliales mixtas a partir de un cerebro de ratón neonatal

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.

Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva

Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Este estudio delinea un enfoque novedoso para el establecimiento de células similares a la microglía (iMG) derivadas de monocitos humanos que permiten la evaluación indirecta de la inflamación cerebral. Esto presenta un modelo celular que puede ser beneficioso para la investigación centrada en la posible inflamación del cerebro y los trastornos neuropsiquiátricos asociados.

Ingeniería de células similares a la microglía inducidas por sangre humana para la investigación traslacional inversa del cerebro

Aprenda a aislar microglía primaria de tejido cerebral humano adulto mediante digestión con tripsina-EDTA y centrifugación. Este método robusto y rentable reduce la pérdida celular y permite estudios de neuroinmunología.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

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