Name: En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende a registrar intracelularmente motoneuronas espinales de rata Wistar en vivo durante estimulación transespinal de corriente directa. Este método evalúa propiedades de membrana y patrones de disparo para estudios de neurorehabilitación.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención No 2017/25/B/NZ7/00373 del Centro Nacional de Ciencias. A los autores les gustaría reconocer el trabajo de Hanna Drzyma-a-Celichowska y W-odzimierz Mrówczy-ski, quienes contribuyeron a la recopilación de datos y al análisis de los resultados presentados en este documento.

Todos los procedimientos relacionados con este protocolo han sido aceptados por las autoridades competentes (por ejemplo, el Comité Local de ética) y siguen las normas nacionales e internacionales sobre bienestar y gestión de los animales.
NOTA: Cada participante involucrado en el procedimiento tiene que estar debidamente capacitado en procedimientos quirúrgicos básicos y tiene que tener una licencia válida para realizar experimentos con animales.
1. Anestesia y premedicación
<ol><li>Anestesiar a una rata con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (una dosis inicial de 60 mg-kg-1 para ratas Wistar macho de 6 meses de edad que pesan 400-u2012550g). NOTA: Este protocolo no se limita a la cepa indicada, el sexo o la edad de las ratas. Además, la anestesia alternativa como la mezcla de ketamina-xilazina, alfa-cloralosa o fentanilo+midazolam+medetomidina se puede utilizar si es más adecuado para diferentes objetivos de investigación o cuando sea requerido por el comité de ética.</li>
	<li>Después de aproximadamente 5 minutos, compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del frente de la rata con fórceps rommosos. Continúe con los siguientes pasos del protocolo solo cuando no se observe ninguna acción reflex.</li>
	<li>Inyectar 0,05 ml de atropina por vía subcutánea para reducir la producción de moco después de la intubación.</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea 5 ml de tampón de fosfato que contenga 4% de solución de glucosa, NaHCO3 (1 %) y gelatina (14%). Este tampón será absorbido por los vasos cutáneos a lo largo de un experimento y ayudará a mantener el equilibrio de fluidos.</li>
	<li>A lo largo de la cirugía, revise periódicamente al animal en busca de acciones reflejos y complemente la anestesia si es necesario (10 mg-kg-1-h-1de pentobarbital sódico).</li>
</ol>2. Cirugía
<ol><li>Preparar al animal para el tratamiento quirúrgico afeitando el pelaje sobre la parte dorsal de la extremidad posterior izquierda, desde el tobillo hasta la cadera, la parte posterior, desde la cola hasta los segmentos torácicos altos, el lado izquierdo del pecho y el lado ventral de la zona del cuello por encima del esternón por encima del esternón por encima del esternón por encima del esternón</li>
	<li>Colocación de la vía intravenosa<ol>
<li>Coloque la rata sobre su espalda en una almohadilla de calentamiento de bucle cerrado (y fíjela con fijaciones de extremidades).</li>
		<li>Usando una hoja 21, haz un corte longitudinal a través de la piel desde un esternón hasta una barbilla.</li>
		<li>Sostenga la piel con fórceps y sepárela del tejido subyacente.</li>
		<li>El uso de técnicas de disección contundentes expone la vena yugular derecha. Diseccionar cuidadosamente la vena de los tejidos circundantes.</li>
		<li>Localice la parte de la vena sin puntos de ramificación, deslice dos ligaduras 4-0 debajo de ella.</li>
		<li>Haga un nudo suelto en el extremo proximal del segmento no ramificado previamente identificado de la vena y un nudo suelto en el extremo distal de este segmento de la vena. Sujeta la vena proximal al corazón y luego liga la parte distal de la vena.</li>
		<li>Usando tijeras de iris, haga una incisión entre la abrazadera y la ligadura distante. Sostenga una solapa de la vena e introduzca un catéter precargado hasta el punto donde está bloqueado por la abrazadera.</li>
		<li>Mientras sostiene la vena y el catéter junto con fórceps, retire la abrazadera y empuje el catéter varios milímetros en la vena. Asegure ambos extremos del catéter a la vena y agregue un punto de fijación adicional a la piel.</li>
	</ol></li>
	<li>Introducción del tubo traqueal<ol>
<li>El uso de fórceps contundentes separa las dos glándulas mandibulares que cubren los músculos esternohoides. Separe los músculos esternohoides en la línea media para exponer la tráquea.</li>
		<li>Deslice tres ligaduras 4-0 debajo de la tráquea, luego haga dos nudos por debajo del punto de inserción del tubo traqueal y un nudo por encima.</li>
		<li>Localice el cartílago cricoide de la laringe y haga una incisión debajo del tercer cartílago traqueal.</li>
		<li>Inserte un tubo traqueal por la tráquea y fije el tubo en su lugar con ligaduras pre-preparadas, luego agregue una ligadura adicional a la piel.</li>
		<li>Coloque un pequeño trozo de lana de algodón por encima de los músculos separados y sutura la piel sobre el área operada.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección de los nervios de las extremidades posteriores<ol>
<li>Usando 21 cuchillas, haz un corte longitudinal en el lado posterior de la extremidad posterior izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.</li>
		<li>Agarre la piel con fórceps, y el uso de técnicas de disección contundente separan la piel de los músculos subyacentes en ambos lados de la incisión.</li>
		<li>Localice la fosa popliteal en la parte posterior de la articulación de la rodilla, que está cubierta por el músculo femoris del bíceps, y usando tijeras hacen un corte entre la parte anterior y posterior de este músculo.</li>
		<li>Moverse hacia arriba corta dos cabezas del bíceps femoris hasta la cadera para exponer el nervio ciático. Cauterizar según sea necesario para prevenir el sangrado.</li>
		<li>Identificar las ramas sural, tibial y peroneal común del nervio ciático.</li>
		<li>Usando tijeras, separe el lateral de la cabeza medial del músculo gastrocnemius para exponer el nervio tibial y sus ramas.</li>
		<li>Usando 55 fórceps agarrar el extremo distal del nervio sural, cortarlo distalmente y diseccionar en la medida de lo posible.</li>
		<li>Repita el procedimiento con el nervio peroneo común.</li>
		<li>Usando una varilla de vidrio contundente separar el nervio tibial de los tejidos circundantes, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos, y cortarlo distalmente.</li>
		<li>Identificar los nervios gastrocnemius medial (MG) y los nervios laterales gastrocnemius y soleus (LGS).</li>
		<li>Usando 55 fórceps, disecciona cuidadosamente los nervios MG y LGS, desconectándolos de los tejidos circundantes, pero manteniendo su conexión con los músculos respectivos.</li>
		<li>Coloque un trozo de lana de algodón empapado en solución salina debajo de los nervios expuestos.</li>
		<li>Cierre la piel sobre el área operada.</li>
	</ol></li>
	<li>Laminectomy<ol>
<li>Usando 21 cuchillas hacer una incisión longitudinal desde el sacro hasta las vértebras torácicas.</li>
		<li>Separe la piel de los músculos subyacentes.</li>
		<li>Corte el músculo longissimus a ambos lados de los procesos torácicos y lumbares espinosos.</li>
		<li>El uso de bisturí de bordes rommosos retrae los músculos de la columna vertebral para exponer los procesos transversales de cada vértebra.</li>
		<li>El uso de tijeras de punta contundentes cortar los tendones de los músculos conectados a los procesos transversales a lo largo de la columna vertebral expuesta. Aplicar agentes hemostáticos si es necesario.</li>
		<li>Identifique la vértebra Th13 como el segmento torácico más bajo con inserción de costillas y el uso de rongeurs finos elimina los procesos espinosos y las láminas de las vértebras Th13 a L2 para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal. Recuerde no dañar el proceso espinoso L3 que se utilizará como punto de fijación para la estabilización de la columna vertebral.</li>
		<li>Retire el proceso espinoso Th12 y alisa la superficie dorsal de la vértebra tanto como sea posible.</li>
		<li>El uso de técnicas de disección contundente separa los músculos de la vértebra Th11 para crear puntos de inserción del soporte.</li>
		<li>Coloque lana de algodón fina empapada en solución salina sobre los segmentos expuestos de la médula espinal.</li>
		<li>Mueva la rata al marco de metal hecho a medida con dos barras paralelas y dos brazos ajustables con abrazaderas para apoyar y estabilizar la columna vertebral.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación para la grabación y estimulación
<ol><li>Fijación de la columna vertebral y disposición nerviosa<ol>
<li>Coloque la rata en el marco a medida sobre una almohadilla de calentamiento, conectada al sistema de calentamiento de bucle cerrado para mantener la temperatura corporal del animal a 37 oC a 1oC.</li>
		<li>Inserte electrodos ECG debajo de la piel y conéctelo a un amplificador para la monitorización de la frecuencia cardíaca.</li>
		<li>Usando los colgajos de la piel, forme una piscina profunda sobre la médula espinal expuesta.</li>
		<li>Usando abrazaderas metálicas, fije la columna vertebral colocando abrazaderas por debajo de los procesos transversales Th12 y en el proceso espinoso L3.</li>
		<li>Asegúrese de que la columna vertebral esté asegurada y dispuesta horizontalmente, y luego aplique presión dorso-ventral en ambos lados de la columna para retraer los músculos.</li>
		<li>Llenar la piscina con aceite mineral caliente (37 oC) y mantenerla a esta temperatura.</li>
		<li>Enhebrar una ligadura 4-0 a través del tendón de Aquiles, levantar y estirar la extremidad posterior izquierda operada para que el tobillo se nivele con la cadera.</li>
		<li>El uso de las solapas de la piel hace una piscina profunda sobre los nervios tibial, MG y LGS expuestos.</li>
		<li>Llenar la piscina con aceite mineral caliente (37 oC).</li>
		<li>Coloque los nervios MG y LGS en electrodos estimulantes bipolares de alambre de plata y conéctelos a un estimulador de pulso cuadrado. Utilice canales de estimulación separados para cada nervio.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocación de electrodos superficiales<ol>
<li>Coloque un electrodo de bola de plata en el lado caudal izquierdo de la médula espinal expuesta, con un electrodo de referencia insertado en los músculos de la espalda, y conecte ambos electrodos al amplificador diferencial de CC. El electrodo de bola de superficie se utilizará para registrar voleas aferentes de los nervios.</li>
		<li>Usando un estimulador de corriente constante, estimular los nervios MG y LGS con pulsos cuadrados de 0,1 ms de duración, repetidos a una frecuencia de 3 Hz, y observar voleas aferentes.</li>
		<li>Determinar el umbral (T) para la activación del nervio, estimular cada nervio a aproximadamente 3o Intensidad T, y registrar la amplitud de la volea aferente para cada nervio.</li>
		<li>Mueva el electrodo de superficie rostral y repita el procedimiento para identificar los segmentos espinales en los que las amplitudes de las voleas son las más altas para cada nervio. Después de determinar la ubicación máxima de la volea, mueva el electrodo de superficie a una distancia segura de la médula espinal.</li>
	</ol></li>
	<li>Parálisis muscular y formación de neumotórax para reducir los movimientos respiratorios<ol>
<li>Paralice la rata por vía intravenosa con un bloqueador neuromuscular y conecte el tubo traqueal a un respirador externo en línea con un capnómetro compatible con roedores (bromuro de pancuronio, a una dosis inicial de 0,4 mg-kg-1, complementado cada 30 min en dosis de 0,2 mg-kg-1)</li>
		<li>Supervise la concentración deCO2 de marea final y mantenla en aproximadamente 3-u20124% ajustando los parámetros de ventilación (frecuencia, presión de aire y volúmenes de flujo).</li>
		<li>Haga una incisión longitudinal en la piel entre la 5a y la 6a costilla en un lado de la grabación.</li>
		<li>El uso de tijeras de punta contundentes cortar los músculos superables para visualizar el espacio intercostal entre las costillas.</li>
		<li>Usando tijeras afiladas pequeñas, haz una pequeña incisión en los músculos intercostales y en la pleura, luego inserta una punta de un borde romo fórceps en la abertura, teniendo cuidado de no presionar los pulmones.</li>
		<li>Permita que los fórceps se expandan o inserte un tubo pequeño para mantener el neumotórax abierto durante todo el experimento.</li>
		<li>Después del bloqueo neuromuscular, controlar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la frecuencia del ECG, y complementar el agente anestésico si la frecuencia cardíaca supera los 400 ppm. Parálisis muscular y formación de neumotórax con el fin de reducir los movimientos respiratorios, lo que mejorará la estabilidad de grabación</li>
	</ol></li>
	<li>Abrir la dura y la pia mater<ol>
<li>Usando fórceps #55, levante suavemente el dura mater, y córtelo caudalmente desde el segmento L5, rostralmente hasta el segmento L4.</li>
		<li>Usando un par de fórceps 5SF ultradelgadas hacen un pequeño parche en la pia que cubre la columna dorsal, entre los vasos sanguíneos, exactamente al nivel de la volea aferente máxima del MG o el nervio LGS.</li>
		<li>Utilice pequeños trozos de espuma de gel seca y empapada de solución salina para bloquear el sangrado si es necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>colocación de electrodos tsDCS<ol>
<li>Hacer una pequeña incisión en la piel en el lado ventral de un abdomen de rata a nivel de rostro-caudal correspondiente a la ubicación de los segmentos de la columna vertebral L4-L5.</li>
		<li>Agarre la solapa de la piel expuesta con un clip de metal que servirá como electrodo de referencia.</li>
		<li>Coloque una esponja empapada en solución salina en el lado dorsal de la vértebra Th12. Asegúrese de que el tamaño de la esponja sea igual al de un electrodo tsDCS activo (placa de acero inoxidable en forma de círculo de 5 mm de diámetro).</li>
		<li>Usando un manipulador fino, presione la esponja con un electrodo tsDCS activo en el hueso y asegúrese de que toda la superficie del electrodo esté presionada por igual.</li>
		<li>Conecte los electrodos tsDCS de referencia y activos a una unidad estimuladora de corriente constante, capaz de proporcionar un flujo continuo de corriente directa.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de micropipetas<ol>
<li>Con un tirador de microelectrodo, prepare un microelectrodo. NOTA: Tanto los electrodos de filamento como los no filamentos se pueden utilizar, sin embargo, recuerde que el vástago del electrodo debe ser lo suficientemente largo como para alcanzar el cuerno ventral mientras es lo suficientemente delgado como para no comprimir la médula espinal mientras desciende.<ol>
<li>Ajuste el ajuste del tirador de modo que el vástago que entra en la médula espinal sea de aproximadamente 3 mm de largo, mientras que la punta del electrodo no es más de 1 u20122 m de diámetro y la resistencia a los microelectromos está entre 10 y 20 M.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Llene los microelectrodos con electrolito de potasio-citrato 2M.</li>
		<li>Monte el microelectrodo preparado en el micromaniprulador, lo que permite un movimiento escalonado de 1-u20122 y una calibración estereotaxia.</li>
		<li>Conecte el microelectrodo al amplificador intracelular con el electrodo de referencia colocado en los músculos de la espalda.</li>
	</ol></li>
	<li>Después del bloqueo neuromuscular, controlar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la frecuencia del ECG, y complementar el agente anestésico para que la frecuencia cardíaca de la rata no exceda 400 bpm.</li>
</ol>4. Seguimiento y penetración de Motoneuron
<ol><li>Coloque el electrodo de grabación de volea aferente de nuevo en la superficie dorsal de la médula espinal, caudalmente a la ubicación del sitio de grabación, a nivel del segmento L6.</li>
	<li>Estimular los nervios MG y LGS con pulsos eléctricos de 0,1 ms a una frecuencia de 3 Hz, e intensidad 3T, para activar todos los axones de alfa-motoneurons dentro de un nervio seleccionado.</li>
	<li>Conduzca la micropipeta en un parche seleccionado en la pia con un ángulo medio-lateral de 15o u201220o (con una punta dirigida lateralmente).</li>
	<li>Después de descender por debajo de la superficie, calibrar el microelectrodo y compensar su capacitancia y compensación de voltaje, y continuar la penetración de la médula espinal cuando todos los parámetros son estables. Un potencial de campo antidrómico de la piscina de motoneuron será visible en la traza de voltaje de microelectrodo mientras se acerca a un núcleo motor dedicado durante la estimulación del nervio respectivo.</li>
	<li>Proceda a la penetración con el microelectrodo a pasos de 1-u20122 m, y utilice periódicamente la función de zumbido del amplificador intracelular para eliminar la punta del electrodo de cualquier residuo.</li>
	<li>Observe la penetración de motoneuron que se caracterizará por una hiperpolarización repentina de la traza de voltaje registrada y la aparición de un potencial de pico antidrómico.</li>
</ol>5. Grabación de la membrana del motoneurón y propiedades de disparo
<ol><li>En un modo puente del amplificador intracelular, identifique el motoneuron sobre la base de la apariencia de "todo o nada" del potencial de acción antidrómica estimulando las respectivas ramas nerviosas. Registre 20 seguimientos posteriores para promediación posterior.</li>
	<li>Implementar un criterio de inclusión estricto para garantizar datos de alta calidad: potencial de membrana en reposo de al menos -50 mV de amplitud; amplitudes potenciales de acción superiores a 50 mV, con un exceso positivo; potencial de membrana estable durante al menos 5 minutos antes de la grabación.</li>
	<li>En un modo de abrazadera de corriente discontinua (modo de velocidad de conmutación de corriente 4-8 kHz) del amplificador intracelular, evocan un potencial de acción ortodrómica en una motoneuron utilizando pulsos de corriente despolarizante intracelular de 0,5 ms. Repita al menos 20 veces para el promediado sin conexión.</li>
	<li>Estimular un motoneuron con 40 pulsos cortos (100 ms) de corriente hiperpolarizante (1 nA) con el fin de calcular la resistencia de entrada de la célula.</li>
	<li>Estimular una motoneuron con pulsos de onda cuadrada de 50 ms en amplitudes crecientes para determinar el valor de la reobase como la amplitud mínima de corriente despolarizante necesaria para provocar un solo pico.</li>
	<li>Inyectar pulsos de onda cuadrada de 500 ms de corriente despolarizante, a amplitudes crecientes en pasos de 0.1–2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneurones.</li>
</ol>6. Estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS)
<ol><li>Mientras mantiene una penetración estable del motoneuron, inicie el procedimiento de polarización mediante la aplicación trans-espinal de corriente directa. Ajuste la intensidad actual y el tiempo de aplicación al diseño del experimento (por ejemplo, 0,1 mA durante 15 min).</li>
	<li>Inmediatamente después de encender el CC, observe el potencial de la membrana de la motoneurón. La polarización anodal (el electrodo activo como ánodo) debe dar lugar a la despolarización del potencial de la membrana, mientras que la polarización catodal (el electrodo activo como cátodo) debe evocar un efecto opuesto. Observe si un cambio en el potencial de la membrana en reposo en respuesta a la estimulación de CC es constante, lo que garantiza que la intensidad del campo eléctrico no se vea afectada.</li>
	<li>Durante la aplicación de corriente continua, repita los pasos 5.3-u20125.6 en intervalos de 5 min.</li>
	<li>Apague el controlador de dominio y continúe repitiendo los pasos 5.3-u20125.6 en intervalos de 5 minutos hasta que las grabaciones se vuelvan inestables o los criterios de inclusión se vean comprometidos.</li>
	<li>Terminar el experimento y eutanasiar al animal mediante la administración intravenosa de una dosis letal de pentobarbital sódico (180 mg-kg-1).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflicto de intereses que revelar.

Si se realiza correctamente, la parte quirúrgica del protocolo descrito debe completarse en un plazo aproximado de tres horas. Uno debe tener especial cuidado en mantener condiciones fisiológicas estables de un animal durante la cirugía, en particular la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia. Aparte de consideraciones éticas obvias, la falta de anestesia adecuada puede resultar en movimientos excesivos de las extremidades durante la disección nerviosa o laminectomía y conducir a daños en la preparación o ...

La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) está ganando reconocimiento como un método potente para modificar la excitabilidad del circuito espinal en la salud y la enfermedad1,2,3. En esta técnica, se pasa una corriente constante entre un electrodo activo situado por encima de los segmentos espinales seleccionados, con un electrodo de referencia situado ventralmente o más rostralmente4. Varios estudios ya han confirmado que el tsDCS se puede utilizar en el manejo de ciertas condiciones patológicas, como el dolor neuropático5,la espasticidad6,la lesión de la médula espinal7 o para facilitar la rehabilitación8. Los investigadores sugieren que tsDCS evoca alteraciones en la distribución iónica entre el espacio intracelular y el espacio extracelular a través de la membrana celular, y esto puede facilitar o inhibir la actividad neuronal dependiendo de la orientación actual9,10,11. Sin embargo, hasta hace poco, faltaba una confirmación directa de esta influencia en las motoneurones.
Aquí, describimos un protocolo detallado para llevar a cabo el registro intracelular in vivo de potenciales eléctricos de motoneurones espinales lumbares en la rata anestesiada con aplicación simultánea de tsDCS, con el fin de observar cambios en la membrana de motoneuron y propiedades de disparo en respuesta a la polarización anodal o cathodal de la red neuronal espinal. Las grabaciones intracelulares abren varias áreas de investigación de las propiedades de las neuronas, no disponibles para las técnicas extracelulares utilizadas anteriormente9,,12. Por ejemplo, es posible medir con precisión la respuesta de voltaje de membrana de motoneuron al flujo de corriente directa inducido por tsDCS, indicar el umbral de voltaje para la generación de picos, o analizar los parámetros potenciales de acción. Además, esta técnica nos permite determinar las propiedades de la membrana pasiva del motoneurón, como la resistencia a la entrada, y observar la relación entre la corriente de estimulación intracelular y la frecuencia de cocción rítmica de motoneurones. La identificación antidrómica del motoneurón registrado, basada en la estimulación de los nervios identificados funcionalmente (es decir, los nervios que proporcionan aferentes a flexores o extensores) nos permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápidas frente a lentas), lo que da la oportunidad de probar si la polarización influye de manera diferente en los elementos individuales del sistema neuronal espinal maduro. Debido a la extensa cirugía anterior al registro y a los altos requisitos de estabilidad y fiabilidad de las grabaciones, esta técnica es muy difícil, pero permite una evaluación directa y a largo plazo de las características electrofisiológicas de un motoneuron: antes, durante y después de la aplicación de tsDCS, lo que es crucial para determinar tanto sus acciones agudas como los efectos persistentes13. Como un motoneuron activa directamente las fibras musculares extrafusales14 y participa en el control de retroalimentación de una contracción muscular y fuerza desarrollada15,16 cualquier influencia observada de tsDCS en la unidad motora o propiedades contráctiles musculares pueden estar vinculadas a modulaciones de excitabilidad de motoneuron o características de disparo.

<table><tbody><tr><td><fuertes>Durgs y soluciones</fuertes></td><td>-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>346351-NaHCO3</td><td>Merck</td><td></td> <td>106329-Pancuronio</td></tr> <tr><td>Jelfa</td><td>PharmaSwiss/Valeant-Bloqueador</td><td></td> <td>neuromuscular</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodio</td><td>Biowet Pu?awy Sp. z o.o-Agente</td><td></td> <td>anestésico principal</td></tr><tr><td>Citrato de potasio</td><td>Chempur</td><td>6100-05-06-Tetraspan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Braun-HES</td><td></td> <td>solución</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo quirúrgico</fuerte></td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>21 Cuchilla</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>Hoja de</td></tr> <tr><td>bisturíCauterizador</td><td>FST</td><td>18010-00-Tubos</td><td></td></tr> <tr><td>torácicos</td><td>Mila</td><td>CT1215-Dumont</td><td></td></tr> <tr><td>#4 Pinzas</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>Pinzas</td></tr><tr><td>musculares Dumont #5 Pinzas</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Pinzas</td>duracionales</tr><tr><td>Dumont Pinzas #5F</td><td>Dumont FST</td><td>11255-20</td><td>Pinzas</td></tr><tr><td>nerviosas Dumont Pinzas #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Pinzas Pia</td></tr><tr><td>Pinza</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>Pinza roma</td></tr><tr><td>Pinza</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>Pinza cutánea</td></tr><tr><td>Hemostático</td><td>FST</td><td>13013-14-Rongeur</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>Para laminectomía</td></tr><tr><td>Tijeras FST</td><td></td><td>15000-08</td><td>Tijeras para venas</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>Tijeras Dura</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>Para corte de tráquea</td></tr><tr><td>Tijeras FST</td><td></td><td>104075-11</td><td>Tijeras</td></tr><tr><td>musculares Tijeras FST</td><td></td><td>14002-13</td><td>Tijeras de piel</td></tr><tr><td>Tubo traqueal</td><td>-</td><td>-</td><td>Catéter de vena hecho a medida</td></tr><tr><td></td><td>Vygon</td><td>1261.201-Pinza</td><td></td></tr> <tr>de <td>canulación de vasos</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>- </td></tr><tr><td>Pinza para recipientes</td><td>FST</td><td>18320-11</td><td>Para el pinzamiento de venas</td></tr><tr><td>Sonda de dilatación de vasos</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>Para la disección</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de venas<tr><td><fuertes>Materiales sugrgicos</fuertes></td><td>-</td><td></td><td>--Espuma de</td></tr> <tr><td>gel</td><td>Pfizer</td><td>GTIN 00300090315085</td><td>Agente hemostático</td></tr><tr><td>Sutura de seda 4.0</td><td>FST</td><td>18020-40-Sutura de</td><td></td></tr> <tr><td>seda 6.0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Axoclamp 2B</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>descatalogados</td><td>Amplificador intracelular/ nuevo modelo Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 Monitor de CO2 al final de la espiración</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>Gas analizador</td></tr><tr><td>Grass S-88</td><td>A-M Systems</td><td>descatalogado</td><td>Estimulador de corriente constante</td></tr><tr><td>Sistemas de manta homeotérmica con sonda flexible</td><td>Aparato Harvard</td><td>507222F</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>de calefacción ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>Amplificador extracelular</td></tr><tr><td>Microdrive</td><td>-</td><td>-</td><td>Hecho a medida/reemplazo IVM/Scientifica</td></tr><tr><td>P-1000 Microelectrodo tirador</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Extractor de microelectrodos</td></tr><tr><td>SAR-830/AP Ventilador para animales pequeños</td><td>CWE</td><td>12-02100 Marco de</td> soporte del <td>respirador</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Hecho a medida / reemplazo base estándar de laboratorio 51601 / Stoelting</td></tr><tr><td>Pinzas espinales</td><td>-</td><td>-</td><td>Hecho a medida / reemplazo Adaptador de columna de rata 51695 / Stoelting</td></tr><tr><td>TP-1 Estimulador de CC</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>Estimulador</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tsDCS<fuerte>Varios</fuerte></td><td>-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>1B150-4 capilares de vidrio</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>Para la producción de microelectrodos</td></tr><tr><td>Algodón</td><td>-</td><td>-</td><td>-tubo</td></tr> <tr><td>flexible</td><td>-</td><td>-Para</td> <td>la conexión</td></tr> <tr><td>del respirador y del analizador de CO2MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>para el llenado de micropipetas Alambre</td>de</tr><tr><td>plata</td><td>-</td><td>-Para</td> <td>electrodos nerviosos</td></tr></tbody></table>

en vivo registro intracelular de motoneurones espinales de rata tipo identificados durante estimulación de corriente directa trans-espinal

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

El registro intracelular de motoneurones espinales in vivo proporciona un "estándar de oro" para determinar las características electrofisiológicas de las células en la red espinal intacta y posee ventajas significativas en relación con las técnicas clásicas de registro in vitro o extracelular. Una ventaja de las grabaciones intracelulares in vivo es que este método se puede realizar en animales adultos con un sistema nervioso completamente maduro, y por lo tanto muchos mecanismos fisiológicos observados se pueden traducir a aplicaciones prácticas. En este documento metodológico, describimos este procedimiento combinado con la estimulación de corriente constante aplicada externamente, que imita los procesos de polarización que ocurren dentro de las redes neuronales espinales. La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) es un método innovador cada vez más utilizado como una intervención neuromoduladora en la rehabilitación después de diversas lesiones neurológicas, así como en deportes. La influencia de tsDCS en el sistema nervioso sigue siendo mal entendida y los mecanismos fisiológicos detrás de sus acciones son en gran parte desconocidos. La aplicación del tsDCS simultáneamente con grabaciones intracelulares nos permite observar directamente los cambios de las propiedades de la membrana del motoneurón y las características de la cocción rítmica en respuesta a la polarización de la red neuronal espinal, que es crucial para la comprensión de las acciones tsDCS. Por otra parte, cuando el protocolo presentado incluye la identificación del motoneuron con respecto a un músculo inervado y su función (flexor versus extensor) así como el tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona una oportunidad para investigar selectivamente la influencia de tsDCS en los componentes identificados del circuito espinal, que parecen verse afectados de manera diferente por la polarización. El procedimiento presentado se centra en la preparación quirúrgica para grabaciones intracelulares y estimulación con énfasis en los pasos que son necesarios para lograr la estabilidad de la preparación y la reproducibilidad de los resultados. Los detalles de la metodología de la aplicación anodal o cathodal tsDCS se discuten mientras se presta atención a cuestiones prácticas y de seguridad.

Los parámetros de los potenciales de acción y varias propiedades de membrana se pueden calcular sobre la base de grabaciones intracelulares cuando se aseguran condiciones estables de penetración celular. La Figura 1A presenta un potencial de acción ortodrómica típico evocado por la estimulación intracelular, que cumple con todos los criterios de inclusión de datos (el potencial de membrana en reposo de al menos -50 mV, y la amplitud del pico superior a 50 mV, con un exceso positivo). Se pued...

Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Este protocolo utiliza grabaciones intracelulares de motoneurones espinales, para investigar directamente la influencia de la estimulación de corriente directa trans-espinal en la función de las redes espinales. La principal ventaja de esta técnica es que permite realizar grabaciones intracelulares en sistemas nerviosos completamente maduros. Facilitar la traducción de las observaciones experimentales a aplicaciones prácticas.Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, una rata Wistar macho anestesada de seis meses de edad, utilice un microscopio diseccionante y una hoja número 21, para hacer una incisión longitudinal de la piel desde el esternón hasta la barbilla. Y usa la disección contundente para exponer la vena yugular derecha. Coloque dos ligaduras de 4-0 debajo de la sección de la vena sin puntos de ramificación.Y haz un nudo suelto en el extremo proximal del segmento de la vena. Y un nudo suelto en el extremo distal del segmento. Sujeta la vena proximal al corazón y liga el extremo distal de la vena.Utilice tijeras de iris para hacer una incisión entre la abrazadera y la ligadura distal. Y, sosteniendo una solapa de la vena, introduzca un catéter precargado hasta el punto donde la vena está bloqueada por la abrazadera. A continuación, retire la abrazadera y empuje el catéter varios milímetros en la vena.Para una colocación de tubo traqueal, utilice fórceps contundentes para separar las dos glándulas mandibulares que cubren los músculos esternoideos. Y separar los músculos esternohoides en la línea media, para exponer la tráquea. Coloque tres ligaduras de 4-0 debajo de la tráquea y haga dos nudos por debajo del punto de inserción del tubo traqueal y un nudo arriba.A continuación, inserte un tubo tráqueo en la tráquea por debajo del tercer cartílago traqueal. Y fije el tubo en su lugar con las ligaduras pre-preparadas. Para diseccionar los nervios de las extremidades posteriores, utilice una hoja número 21 para hacer un corte longitudinal en el lado posterior de la extremidad posterior izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.Y usa tijeras para hacer un corte entre las regiones anterior y posterior de la fosa popliteal, en la parte posterior de la articulación de la rodilla. Corta dos cabezas del bíceps femoris, para exponer el nervio ciático. Y separar la cabeza lateral de la cabeza medial del músculo gastrocnemius, para exponer el nervio tibial y sus ramas.A continuación, utilice el número 55 fórceps, para diseccionar cuidadosamente el gastrocnemius medial y el gastrocnemius lateral y los nervios del soleo. Desconectarlos de los tejidos circundantes manteniendo su conexión con los respectivos músculos. Para realizar la laminectomía, utilice una hoja número 21 para hacer una incisión longitudinal desde el sacro hasta las vértebras torácicas.E identificar la vértebra Th13, como un segmento torácico más bajo con una inserción de costilla. Luego usa rongeurs finos para eliminar los procesos espinosos y las láminas de la Th13 a las vértebras L2, para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal. Para fijar la columna vertebral, coloque la rata en un marco hecho a medida en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius, conectada a un sistema de calefacción de bucle cerrado.Y usa los colgajos de la piel para formar una piscina profunda sobre la médula espinal expuesta. Coloque abrazaderas metálicas por debajo de los procesos transversales Th12, y en los procesos espinosos L3, y llene la piscina con 37 grados Centígrados de aceite mineral. Usa las aletas de la piel para hacer una piscina profunda de aceite mineral sobre los nervios tibial, gastrocnemius medial y gastrocnemius lateral y soleus expuestos.Y coloque los nervios en electrodos estimulantes de alambre de plata bipolar. A continuación, conecte los electrodos a un estimulador de pulso cuadrado utilizando canales de estimulación separados para cada nervio. Para una colocación de electrodos de superficie, bajo el microscopio de disección, coloque un electrodo de bola de plata en el lado caudal izquierdo de la médula espinal expuesta.Con un electrodo de referencia insertado en los músculos de la espalda. Y conecte ambos electrodos al amplificador diferencial de CC. Utilice un estimulador de corriente constante para estimular el gastrocnemius medial y los nervios de gastrocnemius lateral y soleo, con pulsos cuadrados de una duración de 0,1 milisegundos repetidos a una frecuencia de tres hercios y observar las voleas aferentes.Al final de la simulación, mueva el electrodo de superficie rostralmente y repita la estimulación para identificar los segmentos espinales en los que las amplitudes de las voleas son las más altas para cada nervio. Después de determinar la ubicación de la volea máxima, entregue un bloqueador neuromuscular por vía intravenosa para paralizar la rata. Mientras que un asistente conecta el tubo traqueal a un respirador externo en línea con un nominador de tapa compatible con roedores.Para abrir la dura y la pia mater, utilice el número 55 fórceps para levantar suavemente la dura mater, y corte el tejido caudalmente desde el segmento L5, rostralmente hasta el segmento L4. Luego usa un par de fórceps 5SF ultra delgados, para hacer un pequeño parche en la pia, cubriendo la columna dorsal entre los vasos sanguíneos. Exactamente a nivel de la volea aferente máxima del gastrocnemius medial y el gastrocnemius lateral y el nervio soleus.Para colocar los electrodos de estimulación de corriente directa trans-espinal, coloque una esponja empapada de solución salina en el lado dorsal de las vértebras Th12. Y utilice la manipulación fina para presionar la esponja con un electrodo de estimulación de corriente directa trans-espinal activo. A continuación, monte un microelectrodo agrupado personalizado, en el micro manipulador, lo que permite un movimiento de paso de una a dos micras y calibración estereotaxia.Y conducir una punta de micropipeta en un parche seleccionado en la pia, en un ángulo lateral medial de 15 a 20 grados. Para registrar la membrana del motoneuron y las propiedades de disparo, en el modo puente del amplificador intracelular, estimular las respectivas ramas nerviosas para identificar la motoneuron sobre la base de la apariencia de todo o nada, del potencial de acción antidrómica. En el modo de abrazadera de corriente discontinua del amplificador intracelular con un modo de velocidad de conmutación de corriente de cuatro a ocho kilohercios, utilice un pulso de corriente despolarizante intracelular de 0,5 milisegundos, para evocar un potencial de acción de ortodoncia, en el motoneuron.Para calcular la resistencia de entrada celular, estimule un motoneuron, con 40 pulsos cortos de 100 milisegundos de hiperpolarización de una corriente de nanogramos. Para determinar el valor base real como la amplitud mínima de la corriente despolarizante necesaria para provocar un solo pico, estimule una motoneuron con pulsos de onda cuadrada de 50 milisegundos en amplitudes crecientes. A continuación, inyecte pulsos de onda cuadrada de 500 milisegundos de corriente despolarizante, a amplitudes crecientes.En 0.1 a dos pasos de nano amplificadores, para evocar descargas rítmicas de motoneurones. Para una estimulación de corriente directa trans-espinal, iniciar los procedimientos de polarización mediante la aplicación trans-espinal de corriente directa, manteniendo una penetración estable de la motoneuron. Aquí, se muestra un potencial de acción ortotrópico típico, evocado por la estimulación intracelular que cumple con todos los criterios para la inclusión de datos.En este análisis, una respuesta celular a un pulso de corriente hiperpolarizante de 100 milisegundos de un nanograma. A partir de la cual se puede observar tanto la resistencia de entrada de pico como de meseta de un motoneuron a partir de la desviación de voltaje. Esta traza de voltaje ampliada de un pico básico real, exhibe un umbral de voltaje claramente marcado del pico.Indicando el nivel de despolarización de membrana en el que se activan los canales de sodio cerrados de tensión para iniciar el potencial de acción. Estos gráficos proporcionan ejemplos de trazas de voltaje intracelular. A partir de dos motoneurones, estimulado intracelularmente con pulsos cuadrados de 500 milisegundos de corriente despolarizante.Antes, durante y después de una aplicación de estimulación de corriente directa trans-espinal. Se encontró que la estimulación de corriente directa trans-espinal anodal actúa hacia un aumento de la excitabilidad de motoneuron y frecuencias más altas de disparo rítmico. Mientras que la estimulación de corriente directa trans-espinal cathodal, actuó para evitar la inhibición de la cocción.Además, los efectos de ambos tipos de estimulación de corriente directa trans-espinal, duraron más que el período de polarización. Los datos inexactos pueden ser adquiridos, si los criterios de inclusión de datos se ven comprometidos debido a la penetración celular imperfecta. Un fracaso para compensar la resistencia y capacitancia del microelectrodo o una inestabilidad de la médula espinal.Es imperativo que no se dañe la médula espinal durante la disección, ya que la lesión puede resultar en shock espinal, haciendo que las grabaciones adicionales sean imposibles. Es posible recolectar muestras de tejido para un análisis químico histológico o inmunocito. Por ejemplo, la medición de la expresión c-fos se puede utilizar como proxy de actividad neuronal.

in-vivo-intracellular-recording-type-identified-rat-spinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este nuevo método permite la grabación simultánea intracelular de una motoneuron adulto solo ratón y la medición de la fuerza producida por sus fibras musculares. La investigación combinada de las propiedades eléctricas y mecánicas de las unidades motoras en los animales normales y genéticamente modificadas es un gran avance para el estudio del sistema neuromuscular.

Grabación simultánea intracelular de una motoneurona lumbar y la Fuerza producida por su unidad motora en el ratón adulto<em&gt; En vivo</em

Este video muestra la grabación de señales eléctricas de neuronas cerebrales individuales utilizando una micropipeta de vidrio de punta fina y una configuración especializada. La micropipeta se inserta cuidadosamente en el cerebro de la rata y se hace zumbar para penetrar en la neurona y registrar las señales eléctricas neuronales internas.

Registro in vivo de señales intracelulares de una sola neurona

Este video describe el registro intracelular in vivo de motoneuronas de rata bajo estimulación transespinal de corriente continua. El protocolo describe cómo medir las propiedades de la membrana y registrar la activación rítmica de las motoneuronas antes, durante y después de la polarización anódica o catódica de la médula espinal.

Estimulación transespinal de corriente directa de la motoneurona espinal de una rata

Este video muestra el procedimiento para registrar el potencial de acción muscular compuesto (CMAP) en ratas mediante la aplicación de estímulos eléctricos al nervio cubital, el ajuste de electrodos para una señal óptima y el aumento de la estimulación para evaluar la funcionalidad del nervio. Este método permite la investigación in vivo de las funciones de los nervios periféricos en los trastornos neurológicos.

Medición in vivo del potencial de acción muscular compuesto en una rata

Este video muestra una grabación de una sola fibra de la conducción nerviosa de la fibra C en ratas. Se incide una incisión en una rata anestesiada para exponer el nervio ciático, que proporciona suministro sensorial y motor a las extremidades inferiores. A continuación, se exponen las fibras C individuales. La estimulación eléctrica se proporciona mediante electrodos de estímulo implantados en el pie, y se registra una respuesta a partir de una sola fibra nerviosa.

Registro in vivo de fibras C del nervio ciático en ratas

Inhibición presináptica GABAérgicas es un poderoso mecanismo inhibitorio en la médula espinal importante para el motor y la integración de la señal sensorial en las redes de la médula espinal. Subyacente despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de la raíz dorsal (DRP). Aquí se demuestra un método de grabación en vivo de DRP en ratones.

Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em&gt; En Vivo</em

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Este método permite el registro de la fuerza de contracciones de contracción y tetánicas y potencial de acción en tres tipos de unidades motoras en el músculo gastrocnemius medial de rata. El aislamiento funcional de una sola unidad de motor es inducido por la estimulación eléctrica del axón.

Aislamiento funcional de unidades de motor único de Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Describimos un protocolo para el registro extracelular multicanal espinal junto con el registro de la función cardíaca y el análisis de las neuronas del asta dorsal espinal bloqueadas por el corazón. Este método ofrece un marco sincronizado temporalmente para estudiar los mecanismos de la columna vertebral que subyacen a los cambios funcionales viscerales torácicos inducidos por la acupuntura.

Estudio de los perfiles codificantes de la estimulación somática en las respuestas neuronales bloqueadas por el corazón en el asta dorsal espinal de la rata

Aprende a registrar intracelularmente motoneuronas espinales de rata Wistar en vivo durante estimulación transespinal de corriente directa. Este método evalúa propiedades de membrana y patrones de disparo para estudios de neurorehabilitación.

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal (Video) | JoVE Journal

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal

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