Método MEJORADO UPLC-UV para la Cuantificación de la Vitamina C en Variedades de Lechuga (Lactuca sativa L.) y Cultivo De Parientes Silvestres (Lactuca spp.)

La vitamina C es un indicador del valor nutricional de las frutas y verduras. Necesitamos un método fácil y fiable para cuantificarlo, especialmente en lechuga, la verdura de hoja más consumida en todo el mundo. Este método previene la degradación de la vitamina C, y proporciona una extracción mejorada y una cuantificación rápida y fiable de los ácidos ascórbicos y deshidroascórbicos, gracias a su precisión y sensibilidad.

Este método se puede utilizar en la tecnología alimentaria para crear etiquetas de hechos nutricionales, en la medicina para estudiar los efectos alimentarios en la salud y en la cría de plantas, para aumentar el contenido de vitamina C en diferentes especies. Demostrando el procedimiento con Inés Medina Lozano, estarán José Angel Aranjuelo y Arantzazu Castellanos, dos analistas de mi laboratorio. Para preparar las muestras de la planta, cosechar al menos una hoja externa y otra interna por planta y congelar inmediatamente las hojas en nitrógeno líquido, antes de colocarlas en un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados.

Para liofilizar las muestras de plantas congeladas, coloque los tubos de muestra sin acatar en las bandejas dentro de la cámara de secador de congelación del liofilizador, y programe el liofilizador como se indica. Mantenga la temperatura del condensador a menos 80,2 grados Centígrados, y la constante de vacío a 112 Cuando el material esté completamente seco, añada bolas de acero inoxidable de 10 milímetros de diámetro a las muestras liofilizadas, en tubos de polipropileno de 20 mililitros. Y utilice un Vortexer Multi-Tube, en el momento e intensidad apropiados, para moler las muestras en un polvo fino.

Para preparar el stock estándar de ácido ascórbico y las soluciones de dilución, pesar exactamente 10 miligramos de ácido ascórbico estándar en una balanza de precisión. Y a 90 mililitros de fase móvil a la muestra. Utilice un agitador magnético para disolver la muestra y un matraz volumétrico para medir con precisión 100 mililitros de la solución resultante.

Adición de agua ultrapura adicional, acidificada a pH dos con ácido fórmico, según sea necesario. A continuación, prepare cinco diluciones del stock, para obtener una curva de calibración. Trabajando bajo una intensidad lumínica baja, agregue una muestra de suelo liofilizado de 50 miligramos y cinco mililitros de disolvente de extracción, a un tubo centrífugo de polipropileno de 15 mililitros y vórtice la solución durante cinco segundos.

Después de agitar la muestra durante 10 minutos en un agitador orbital a 2000 revoluciones por minuto, transfiera el tubo a un baño ultrasónico durante 10 minutos, a temperatura ambiente y recoja la muestra por centrifugación. A continuación, colar el sobrenadante a través de un filtro de celulosa regenerada de 0,22 micras, en un vial de ámbar de cinco mililitros, para extraer los ácidos ascórbico y dehidrotórbico en el extracto uno. Para preparar la dilución para determinar la concentración de ácido ascórbico en las muestras de hoja, agregue 200 microlitros de extracto uno, y 800 microlitros de agua ultrapura en un vial de cromatografía líquida ámbar de dos mililitros, y cierre el vial con un tapón de PTFE/silicona.

Para la extracción total de ácido ascórbico, transfiera 200 microlitros del extracto uno, en un vial de cromatografía líquida ámbar de dos mililitros, y añada 200 microlitros de solución reductora al vial. Cierre el vial con un tapón y vórtice la solución durante cinco segundos. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz, utilice 200 microlitros de ácido sulfúrico molar 0,4 Molar, para detener la reacción y estabilizar el ácido ascórbico, a un pH ácido.

Para preparar la dilución para determinar la concentración total de ácido ascórbico en las muestras, añadir 400 microlitros de agua ultrapura, al extracto total de ácido ascórbico dos. Cierre el vial con un tapón. Al menos una hora antes de iniciar el experimento, confirme que todas las soluciones de trabajo se han cargado en el sistema UPLC y encienda los tres módulos UPLC.

Cuando el proceso de calibración interno haya terminado, abra el software y cargue el programa instrumental. Una vez cargado el software, haga clic en Quaternary Solvent Manager y haga clic en el botón derecho del ratón para seleccionar Launch Console, para acceder a la consola de administración de UPLC. Haga clic en Sistema, Control y puesta en marcha, para continuar con la preparación y estabilización del instrumento UPLC, y haga clic en Prime Solvents, QSM, check A, B, C, D, Seal Wash and Duration of Prime, mayor de cinco minutos, para purgar todas las líneas UPLC, durante al menos cinco minutos.

Haga clic en SM, compruebe Wash Solvent a más de 45 segundos. Compruebe Purgar disolvente y 35 ciclos para purgar y limpiar el inyector. Para equilibrar la UPLC a las condiciones del método, compruebe Equilibrio en Método y QSM, y establezca el flujo en 0,3 mililitros por minuto.

Disolvente A a 2%solvente B a 0%solvente C 98%y disolvente D a 0%Still en Equilibrio a Método y SM y establecer la muestra a 5 grados Celsius, y la columna a 30 grados Celsius. Todavía en Equilibrar a método y otro, seleccione Lámpara activada y haga clic en Iniciar. Deje que el equipo se estabilice durante al menos una hora.

Para verificar la estabilidad, haga clic en Iniciar sistema de consola y QSM y seleccione Presión del sistema QSM, solo para comprobar la presión en la columna. Si no hay tendencias identificables en los cambios de presión, y el valor delta es inferior a 10 libras por pulgada cuadrada de presión, en la pantalla de inicio rápido, llene la matriz con los nombres de los estándares y muestras a analizar. Para determinar la concentración de ácido ascórbico en las normas, inyectar cinco microlitros de cada dilución en el instrumento UPLC, y llevar a cabo la cromatografía, desde la más diluida, hasta la solución más concentrada como se indica en la tabla.

Para determinar el ácido ascórbico y la concentración total de ácido ascórbico en las muestras de hoja, inyecte cinco microlitros del extracto diluido uno y extraiga dos respectivamente, en el instrumento UPLC para el análisis cromatográfico. Para calcular las concentraciones de ácido ascórbico y ácido ascórbico total, en el software haga clic en Inicio rápido, Examinar proyecto, Canales, el nombre del estándar o la muestra y el canal PDA uno, 245 nanómetros a 1,2 nanómetros. Para abrir los cromatogramas estándar y de muestra, haga clic en el punto inicial del cromatograma y arrástrelo hasta el punto final, para integrar el pico correspondiente en las normas y muestras.

A continuación, utilice los datos de las diluciones estándar de ácido ascórbico, para construir una curva de calibración, para representar los valores de absorbancia determinados cromatográficamente e interpolar los valores de absorbancia de la muestra, para obtener el ácido ascórbico y la concentración total de ácido ascórbico, de acuerdo con la fórmula. La cuantificación de la vitamina C en matrices de Lactuca, requiere el desarrollo de un enfoque cromatográfico que pueda asegurar resultados confiables. Aquí, se puede observar un cromatograma resultante de un protocolo no optimizado que presenta un pico de ácido ascórbico, junto con un hombro minero no identificado.

Sin embargo, después de mejorar las condiciones de extracción y cromatográficas, se puede lograr un pico de ácido ascórbico resuelto sin interferencias de compuestos desconocidos. Además, el uso de equipos ultravioletas UPLC, en lugar de HPLC ultravioleta, reduce la retención y los tiempos de funcionamiento. Las interferencias en los picos de ácido ascórbico, dan lugar constantemente a la subestimación del contenido de vitamina C, debido a una separación insuficiente durante el proceso cromatográfico.

Como las áreas de pico superpuestas se integran por una caída vertical en el punto más profundo entre ellas. Además, el uso de un protocolo no optimizado impide la extracción de cualquier conclusión útil, de los resultados. Como todas las muestras parecen tener un contenido similar de vitamina C, en cualquiera de sus formas.

Por el contrario, el uso del protocolo optimizado permite la detección de diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes tipos de muestras. Asegúrese de recoger múltiples muestras, para conservar las muestras correctamente, para minimizar la exposición de la muestra a agentes oxidantes y para cuantificar ambas formas de vitamina C.El contenido total de vitamina C se puede cuantificar no sólo en cualquier especie vegetal, sino también, en cualquier fruta en cualquier fruta y verdura, o incluso alimentos procesados con pocas modificaciones técnicas.