Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

Además del protocolo para la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en células neuronales, también mostramos un conjunto de experimentos que pueden analizar de forma exhaustiva el proceso de diferenciación. Estas técnicas son pertinentes para el desarrollo embrionario ectodérmico temprano, proporcionando a los investigadores opciones para analizar la diferenciación de las células neuronales. A la hora de intentar este procedimiento, es fundamental empezar con células madre en óptimas condiciones.

Por lo tanto, es importante que las EB, MPC y neuronas se cultiven en medios frescos y óptimos. La demostración visual de este protocolo es importante, ya que contiene detalles minuciosos que pueden afectar su éxito y efectividad, especialmente la parte de diferenciación. Comience por establecer un cultivo de células colgantes.

Para una placa de cultivo celular de 10 centímetros, ajuste la concentración a 500 células por 20 microlitros de medio de diferenciación. Prepare suficiente suspensión celular para 50 gotas de 20 microlitros. Utilice una micropipeta o una pipeta repetidora para colocar gotas de 20 microlitros de suspensión celular en la tapa de una placa de cultivo de tejidos, asegurándose de que las gotas no estén demasiado juntas para evitar que se fusionen.

Llene el plato con cinco a 10 mililitros de PBS y vuelva a colocar la tapa con cuidado en el plato. Incubar el cultivo en la incubadora a 37 grados centígrados. Después de dos días, recoja las gotas de la tapa y colóquelas en una placa de suspensión de cultivo celular de 10 centímetros llena de 10 mililitros de medio de diferenciación, luego coloque la placa en un agitador orbital configurado a baja velocidad en la incubadora.

Después de otros dos días, centrifugue las células a 200 veces G durante tres minutos y retire el sobrenadante. Para inducir la diferenciación del cuerpo embrioide en células progenitoras neurales, vuelva a suspender las células en medio de diferenciación con ácido retinoico de cinco micromolares. Incube la placa durante dos días, luego reemplace la mitad mínima del medio con medio fresco, inclinando la placa y pipeteándola.

Recoja las células dos días después centrifugarlas a 200 veces G durante tres minutos y retire el sobrenadante. Fije los cuerpos embrioides y las células progenitoras neurales con 4% de PFA en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el PFA y lave las células en PBS durante cinco minutos.

Incubar las células en serie en soluciones de PBS 10, 20 y 30% de sacarosa, a 25 a 28 grados centígrados, con cada incubación durando 30 minutos o más hasta que las células se asienten en el fondo del tubo. Y utilícelo para transferir la muestra al centro de un criomolde, pipeteando el exceso de líquido. Agregue con cuidado la temperatura de corte óptima o la solución OCT al molde, sin volver a suspender la muestra, luego elimine las burbujas excesivas con una pipeta.

Coloque el molde con la muestra en un mezclador de laboratorio a baja velocidad durante 15 minutos, lo que asentará los cuerpos embrioides y las células progenitoras neurales en el fondo de la solución OCT. A continuación, congele rápidamente la muestra colocando el molde en nitrógeno líquido. Bloquee las secciones de OCT o las cámaras de cultivo que contengan neuronas en suero de burro normal al 10% y Triton X-100 al 0,1% en PBS durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, incubar las muestras en anticuerpo primario, diluido en suero de burro normal al 5% y Triton X-100 al 0,05% en PBS, a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave las muestras en PBS con 0.1%Triton X-100 tres veces durante cinco minutos por lavado. Incubarlos con anticuerpo secundario, diluido en suero de burro normal al 5% y Triton X-100 al 0,05% en PBS, durante una hora a temperatura ambiente.

Repita los lavados en Triton X-100 y PBS, luego incube la muestra en un DAPI de microgramos por mililitro. Monte la muestra con un cubreobjetos y algún medio de montaje, deje que se seque y obtenga imágenes con un microscopio de fluorescencia. Para realizar la diferenciación neuronal, las células E14 se cultivaron en fibroblastos embrionarios de ratón irradiados con rayos gamma hasta que la población de fibroblastos se diluyó.

La pluripotencia de las células E14 se confirmó con tinción con fosfatasa alcalina. Después de la diferenciación, los cuerpos embrionarios tenían una forma redonda que aumentaba continuamente de tamaño. Para el día 10, las células progenitoras neurales que se diferenciaban en neuronas, tenían una forma celular alargada.

Se realizaron experimentos de inmunofluorescencia en células progenitoras neurales en el día ocho y en neuronas en el día 12. Se observó tinción positiva para la anidación en las células progenitoras neurales y para el neurofilamento en las neuronas. Se diferenció una línea de células madre embrionarias de ratón que expresaban un indicador de GFP impulsado por el promotor Sox1 y se realizó una citometría de flujo en las células madre embrionarias y las células progenitoras neurales.

Se encontró que el 58,7% del total de células en la etapa NPC son GFP positivas, mientras que el 0% son GFP positivas en la etapa ESC. Se realizaron experimentos de secuencia de ARN en células madre embrionarias E14, cuerpos embrioides y células progenitoras neurales. Los genes en el mapa de calor de la secuencia de ARN se clasificaron en función de sus niveles de expresión.

El análisis de la ontología génica de los cuatro grupos de genes mostró que corresponden a distintas funciones o vías celulares. Al realizar este protocolo, EBS debe aparecer como masas esféricas y ennegrecidas de células. Para asegurarse de que EBS crezca con él, cambie el medio el primer día, si el medio comienza a volverse amarillento.

El mismo enfoque es importante para el cultivo de MPC, ya que tanto las EB como las MPC se encuentran en una etapa crítica del desarrollo embrionario temprano. Se pueden realizar otros ensayos genómicos funcionales, como ChIPseek y los ensayos de captura de confirmación de cromatina de las diferentes etapas de la diferenciación neuronal, para comprender los procesos biológicos subyacentes. La integración mediante ensayos de genómica química y funcional en el proceso de diferenciación de neuronas, permite a los investigadores delinear mejor los mecanismos moleculares del desarrollo embrionario temprano.