Name: Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a diferenciar células madre embrionarias de ratón en neuronas mediante el método de gota colgante. Este protocolo incluye análisis fenotípico completo usando RT-qPCR, inmunofluorescencia y citometría de flujo para estudiar la neurogénesis in vitro.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Nos gustaría agradecer al Dr. Ryan Hobbs por la asistencia en la sección. Agradecemos las instalaciones centrales de Penn State College of Medicine, incluidas las Ciencias del Genoma y la Bioinformática, las Imágenes Avanzadas de Microscopía de Luz y la Citometría de Flujo. También agradecemos a la Dra. Yuka Imamura por la asistencia en el análisis de ARN-seq.

1. Cultura mESC
<ol><li>Cubra una placa tratada con cultivo de tejidos de 10 cm con gelatina al 0,1% y deje que la gelatina se fije durante al menos 15-30 minutos antes de aspirarla.</li>
	<li>Semilla γ fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (MEF) un día antes de cultivar las mESC en el medio mESC precalentado (medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con suero fetal bovino (FBS) al 15%), aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, LIF, PD0325901 (PD) y Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Permita que los MEFs irradiados por γ se asienten y se adhieran a la superficie de la placa antes de cultivar las células E14.</li>
	<li>Descongele las ESC E14 en un baño de agua a 37 °C y transfiera rápidamente las células en un tubo cónico de 15 cm con medio mESC caliente. Peletizar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 10 ml de medio mESC y colocar las células en la placa de cultivo que contiene los MEFs γ irradiados sembrados anteriormente. Incubar el cultivo celular en una incubadora de 37 °C bajo 5% de CO2.</li>
	<li>Para el pasaje de cultivo, aspire e el medio y lave la placa con 1x PBS estéril. Agregue suficiente tripsina al 0.05% para cubrir la superficie de la placa e incube a 37 ° C durante 3 min.</li>
	<li>Neutralizar la tripsina con medio mESC y pipeta para generar suspensión unicelular. Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Cuente las células con un hemocitómetro o contador celular y siembre aproximadamente 5.0 x 105 células en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
	<li>Resuspend las células en 10 ml de medio mESC, placa las células en la placa de cultivo de tejido recubierta de gelatina e incuba cultivos como se describió anteriormente. NOTA: Se recomienda que las mESCs se pasen cada 2 días para evitar que las células se diferencien en sus colonias. El rojo fenol en el medio funciona únicamente como un indicador de pH y dependiendo de la densidad celular, puede volverse amarillento (más ácido), antes de 2 días. Por lo tanto, puede ser necesario cambiar el medio todos los días. Los MEF irradiados por γ eventualmente morirán después de un par de pasajes.</li>
</ol>2. EB, NPC y diferenciación neuronal
<ol><li>Realice el protocolo de paso de cultivo mencionado anteriormente y cuente las células (pasos 1.7-1.10).</li>
	<li>Método de caída colgante (día 0)<ol>
<li>Para una placa de cultivo celular de 10 cm, cuente aproximadamente 2.5 x 104 células donde 5.0 x 102 células se suspenderán en un medio de diferenciación de 20 μL (DMEM con 15% de FBS, aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina / estreptomicina y piruvato de sodio). Aproximadamente cincuenta gotas de 20 μL que contienen las células se pueden enchapar en una placa de 10 cm.</li>
		<li>Alícuota el número apropiado de células, y luego centrifuga las células a 200 x g durante 3 min y retire el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en el volumen apropiado del medio de diferenciación para una densidad celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por ejemplo, 2,5 x 104 células en 1 mL de medio de diferenciación).</li>
		<li>Usando una micropipeta o una pipeta repetidora, coloque gotas de 20 μL de la suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo de tejidos. Asegúrese de que las gotas no estén demasiado cerca unas de otras para evitar que se fusionen. NOTA: Las gotas se pueden enchapar en una placa de fijación tratada con cultivo de tejidos o en una placa de suspensión, ya que se colocarán en la tapa y no en la placa en sí. Para un enfoque más factible y estéril, coloque las gotas en una placa de cultivo de tejido de fijación y transfiéralas a una placa de suspensión como se describe a continuación.</li>
		<li>Llene el plato con 5-10 ml de 1x PBS y vuelva a colocar cuidadosamente la tapa en el plato. Incubar el cultivo en la incubadora de 37 °C. NOTA: PbS se agrega a la placa de cultivo para evitar que las gotas se sequen.</li>
	</ol></li>
	<li>El día 2,use una micropipeta para recoger las gotas de la tapa y colóquelas en una placa de suspensión de cultivo celular de 10 cm llena de 10 ml de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en un agitador orbital que tiembla a baja velocidad en la incubadora.</li>
	<li>El día 4,para cosechar los EB, recolectar las células, centrifugar a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante. NOTA: Los EB también se pueden lavar con 1x PBS según los requisitos de los experimentos posteriores.</li>
	<li>Para continuar el procedimiento e inducir la diferenciación EB en células progenitoras neurales (NPC), prepare el medio de diferenciación con ácido retinoico (AR) de 5 μM.</li>
	<li>Retire el medio viejo peletizando los EB a 100 x g durante 3 minutos o permita que los EB se asienten antes de aspirar el medio viejo. Añadir 10 ml del medio de diferenciación que contiene 5 μM de AR a la placa de cultivo.</li>
	<li>El día 6, reemplace al menos la mitad del medio con un medio fresco que contenga 5 μM ra inclinando la placa y canalizando el medio como se describió anteriormente. NOTA: Se recomienda que al menos la mitad del medio se reemplace con un medio fresco que contenga AR los días 5 y 7. Tome nota del indicador rojo fenol; si se vuelve amarillento, es mejor reemplazar todo el medio.</li>
	<li>El día 8,cosecha los NPC recolectando las células, centrifugando a 200 x g durante 3 min, y retirando el sobrenadante. NOTA: Los NPC también se pueden lavar con 1x PBS de acuerdo con las necesidades de los experimentos posteriores. Si es necesario, los NPC pueden congelarse y descongelarse nuevamente para su posterior cultivo y análisis. Si los NPC van a ser cultivados, la accutasa también se puede utilizar como una alternativa a la tripsina.</li>
	<li>Para continuar el procedimiento y diferenciar los NPC en neuronas, recoja los NPC en un tubo cónico de 15 ml por centrifugación, disocie con tripsina e incube a 37 °C durante 3 min. Pipetear los NPC para asegurarse de que todos los agregados de NPC estén disociados y neutralizar la tripsina con el medio.</li>
	<li>Filtrar las células con un colador de células de nylon de 40 μm y contar las células antes de enchaparlas a una densidad de 1,5 x10 5/cm2 en medio N2 (medio DMEM/F12 + 3 mg/ml de glucosa + 3 mg/ml de albúmina bovina rica en lípidos (LBSA) + suplemento de 1:100 N2 + 10 ng/mL de bFGF + 50 U/mL de pluma/estreptococo + 1 mM de L-glutamina) en una placa tratada con cultivo de tejidos para experimentos posteriores de PCR y western blot; o en una cámara de cultivo de tejidos para experimentos de inmunofluorescencia.</li>
	<li>El día 9,reemplace el medio antiguo por un medio N2 fresco.</li>
	<li>El día 10,cambie el medio N2 con medio N2 / B27 (50% DMEM / F12 y 50% basal neural, 3 mg / ml LBA, suplemento 1: 200 N2, suplemento 1: 100 B27, 50 U / ml pluma / estreptococo y 1 mM L-glutamina).</li>
	<li>En los días 11-12,cosecha las neuronas de la siguiente manera. Lave las células con 1x PBS, agregue tripsina e incube el cultivo en la incubadora de 37 °C durante 3 min antes de neutralizar la tripsina con medio y centrífuga a 200 x g durante 3 min.</li>
</ol>3. Caracterización de mESCs y células diferenciadas
<ol><li>Ensayo de fosfatasa alcalina (AP) 
	<ol>
<li>Use un kit para evaluar la actividad de la fosfatasa alcalina (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Retire el medio de la placa de cultivo y lave los ESC con 1x PBS.</li>
		<li>Agregue 1 ml de la solución fija (consiste en formaldehído y metanol) provisto con el kit a la placa e incube a temperatura ambiente durante 2-5 min. NOTA: La sobreincubación en la solución fix puede comprometer la actividad de AP.</li>
		<li>Retire la solución fija, lave los ESC con 1x PBS y deje cierta cantidad de PBS en la placa. NOTA: Mantenga los ESC húmedos en PBS para no comprometer la actividad de AP.</li>
		<li>Prepare la solución AP mezclando las soluciones de sustrato A, B y C en una proporción de 1:1:1. Mezcle primero las soluciones A y B e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 2 minutos antes de agregar la solución C.</li>
		<li>Retire el PBS 1x y agregue la solución AP preparada anteriormente.</li>
		<li>Incubar los ESC durante unos 15 minutos en la oscuridad envolviendo la placa de cultivo con papel de aluminio o realizando el paso 3.5 en una habitación oscura.</li>
		<li>Controle la reacción y retire la solución de reacción cuando la solución se vuelva brillante para evitar manchas no específicas.</li>
		<li>Lave los ESC dos veces con 1x PBS.</li>
		<li>Evite que la muestra se seque cubriendo los ESC con 1x PBS o medio de montaje. NOTA: Aparecerá una mancha roja o púrpura para la expresión AP. La placa se puede almacenar en un refrigerador de 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Recolecte células en varias etapas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y 2.4 para ESC y EB y NPC, respectivamente.</li>
		<li>Aislar el ARN utilizando ARN, ADN y solución de extracción de proteínas (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Genere ADNc con un kit de transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales)y siga el manual del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación e incrustación 
	<ol>
<li>Coseche los EB y los NPC como se describió anteriormente (paso 2.6) y corríjalos con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire el PFA y lave la muestra con 1x PBS durante 5 min.</li>
		<li>Coloque la muestra en una dilución en serie de 1x soluciones de PBS, 10%-, 20%-, y 30%-sacarosa a 25\u201228 °C donde la muestra se transfiere a la siguiente solución después de 30 min de incubación. NOTA: La muestra se puede almacenar en la solución de sacarosa al 30% a 4 °C antes de continuar con el paso de incrustación.</li>
		<li>Humedezca la punta de la pipeta con solución de sacarosa antes de colocar la muestra (sin apilarla) en el centro del criomolde y pipetee el exceso de líquido. NOTA: El papel de filtro también se puede utilizar para eliminar el exceso de solución. Mojar la punta de la pipeta con solución de sacarosa es importante para evitar que los EB y los NPC se peguen a las paredes de la punta.</li>
		<li>Agregue cuidadosamente la solución de temperatura de corte óptima (OCT) al molde sin volver a suspender las muestras y elimine el exceso de burbujas con una pipeta.</li>
		<li>Coloque el molde con la muestra en un mezclador de laboratorio a baja velocidad para agitar ligeramente la muestra durante 15 minutos. Esto ayuda a asentar los EB y NPC al fondo si se vuelven a suspender en la solución oct.</li>
		<li>Congele rápidamente la muestra colocando el molde en nitrógeno líquido o sobre hielo seco. NOTA: Las muestras se pueden almacenar en un congelador de -70 °C antes de continuar con el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Crioseccionado 
	<ol>
<li>Ajuste el criostato para que se enfríe a -20 a -18 °C antes de transferir la muestra al instrumento.</li>
		<li>Separe el bloque de OCT congelado del molde y asegúrelo en el soporte con una pequeña solución de OCT colocada en la superficie del soporte.</li>
		<li>Alinee el bloque oct para que los EB y los NPC estén más cerca de la hoja para asegurarse de que la muestra no se pierda durante la sección.</li>
		<li>Separe cuidadosamente 10 μm del bloque y preste mucha atención a las rodajas que contienen la muestra.</li>
		<li>Coloque rápidamente la rebanada de OCT que contiene la muestra en el portaobjetos de vidrio que incrusta tejido y permita que las rebanadas de OCT se sequen al aire durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -70 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunofluorescencia (IF) 
	<ol>
<li>Bloquee las secciones de OCT o las cámaras de cultivo que contienen neuronas en un 10% de suero de burro normal / 0.1% Triton X-100 en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar las muestras en anticuerpo primario diluido en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado.</li>
		<li>Incubar las muestras con anticuerpos secundarios diluidos en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado y luego incube las muestras en 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Monte las muestras con una funda y algún medio de montaje y deje que se seque.</li>
		<li>Observe las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de ARN-seq 
	<ol>
<li>Recolecte las células en varias etapas y realice la extracción de ARN (ver paso 3.2).</li>
		<li>Preparar las bibliotecas de ADNc, realizar secuenciación profunda y análisis de datos según el protocolo descrito en Wang et al.8.</li>
		<li>Realice el análisis de Ontología Génica (GO) utilizando el paquete R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometría de flujo 
	<ol>
<li>Recolecte escasiadas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y vuelva a suspender las células en medio. Recoge los EB y NPC siguiendo el paso 2.4 y vuelve a suspender las células en medio.</li>
		<li>Filtre la suspensión celular utilizando el colador de células de nylon de 40 μm en un nuevo tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Mida la señal GFP de las muestras utilizando el citómetro de flujo (realizado por la instalación central de la institución).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer%3A+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+imaging+%28HCI%29+on+miniaturized+three-dimensional+%283D%29+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.

El método para la diferenciación neuronal de las células madre embrionarias de ratón se ha establecido durante décadas y los investigadores han seguido modificando los protocolos anteriores o creando otros nuevos para diversos fines7,10,11. Utilizamos una serie de ensayos para analizar exhaustivamente la eficiencia y el progreso de las etapas de diferenciación de las mESCs a las neuronas, que pueden usarse en el análisis de otra...

Desde su primera derivación de la masa celular interna de los blastocistos de ratón en desarrollo1,2,las células madre embrionarias de ratón (mESC) se han utilizado como herramientas poderosas para estudiar la autorrenovación y diferenciación de las células madre3. Además, el estudio de la diferenciación mESC conduce a una tremenda comprensión de los mecanismos moleculares que pueden mejorar la eficiencia y la seguridad en la terapia basada en células madre en el tratamiento de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos4. En comparación con los modelos animales, este sistema in vitro proporciona muchas ventajas, incluida la simplicidad en la práctica y la evaluación, el bajo costo en el mantenimiento de las líneas celulares en contraste con los animales y la relativa facilidad en las manipulaciones genéticas. Sin embargo, la eficiencia y la calidad de los tipos de células diferenciadas a menudo se ven afectadas por diferentes líneas de mESCs, así como por los métodos de diferenciación5,6. Además, los ensayos tradicionales para evaluar la eficiencia de la diferenciación se basan en el examen cualitativo de genes marcadores seleccionados que carecen de robustez y, por lo tanto, no logran comprender los cambios globales en la expresión génica.
Aquí pretendemos utilizar una batería de ensayos para la evaluación sistemática de la diferenciación neuronal. Utilizando tanto análisis tradicionales in vitro en marcadores seleccionados como ARN-seq, establecemos una plataforma para medir la eficiencia de diferenciación, así como los cambios transcriptómicos durante este proceso. Basándonos en un protocolo previamente establecido7,generamos cuerpos embrioides (EB) a través de la técnica de gota colgante, seguida de la inducción utilizando cantidad suprafisiológica de ácido retinoico (AR) para generar células progenitoras neurales (NPC), que posteriormente se diferenciaron a neuronas con medio de inducción neural. Para examinar la eficiencia de la diferenciación, además de los ensayos tradicionales de RT-qPCR e inmunofluorescencia (IF), se realizó citometría de flujo y ARN-seq. Estos análisis proporcionan una medición exhaustiva de la progresión de la diferenciación específica de la etapa.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Preparado en agua desionizada</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluido en 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&mu; filtro de células</td><td>m Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 cabra anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>El anticuerpo se diluyó a 1:500 para el</td></tr><tr><td>kit de tinción de fosfatasa alcalina IF II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD 657338</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>C298-500</td><td>Fisher Químico</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB tampón</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluido en agua desionizada</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Productos biológicos</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sistema de secuenciación</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analítico</td><td>Diluido en agua desionizada</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Recolectado del sobrenadante MEF</td></tr><tr><td>m18srRNA cebadores</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM</td></tr> <tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>cebadores mNanog</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'</td></tr><tr><td>mNes imprimaciones</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGTGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGTGAGGGGTGT-3'mNeuroD1</td></tr> <tr><td>imprimaciones</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4</td></tr> <tr><td>imprimaciones</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6</td></tr> <tr><td>cebadores</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2</td></tr> <tr><td></td><td>suplemento Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin anticuerpo primario</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>se diluyó a 1:200 para IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>Anticuerpo primario de neurofilamento</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Kit de preparación de biblioteca de secuenciación de ARN direccional rápido</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparado en agua desionizada</td></tr><tr><td>- Cloruro de potasio</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Fosfato de potasio monobásico anhidro</td><td>0781-500G</td><td>VWR-</td><td></td></tr> <tr><td>Cloruro de sodio</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Fosfato de sodio, dibásico, heptahidratado</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación de hexámero aleatorio</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Preparado en DMSO</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluido en 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compuesto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de aislamiento TriPure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq</td><td>Rapid Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Describimos el procedimiento paso a paso para cultivar y diferenciar las células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales, seguido de una serie de ensayos para caracterizar las células diferenciadas. Las células madre embrionarias de ratón E14 se utilizaron para formar cuerpos embrionarios a través del método de la gota colgante, y luego se indujeron a diferenciarse en células progenitoras neurales por ácido retinoico, y finalmente se diferenciaron en neuronas. Los experimentos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) e inmunofluorescencia revelaron que los progenitores neurales y las neuronas exhiben marcadores correspondientes (nestina para los progenitores neurales y neurofilamento para las neuronas) en los días 8 y 12 después de la diferenciación, respectivamente. Los experimentos de citometría de flujo en una línea E14 que expresan un informador de GFP impulsado por el promotor Sox1 mostraron que aproximadamente el 60% de las células en el día 8 son GFP positivas, lo que indica la diferenciación exitosa de las células progenitoras neurales en esta etapa. Finalmente, se utilizó el análisis RNA-seq para perfilar los cambios transcriptómicos globales. Estos métodos son útiles para analizar la participación de genes y vías específicas en la regulación de la transición de la identidad celular durante la diferenciación neuronal.

Como representación de nuestro método, realizamos un experimento de EB, NPC y diferenciación neuronal en células E14. Las células E14 se cultivaron en MEFs irradiados γ(Figura 1A)hasta que la población de MEF γ-irradiada se diluyó. Confirmamos la pluripotencia de las células E14 mediante la tinción de fosfatasa alcalina (AP)(Figura 1B)y posteriormente RT-qPCR (ver más abajo) para los marcadores Nanog y Oct4. Las células E14 libres de MEF irradi...

Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Además del protocolo para la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en células neuronales, también mostramos un conjunto de experimentos que pueden analizar de forma exhaustiva el proceso de diferenciación. Estas técnicas son pertinentes para el desarrollo embrionario ectodérmico temprano, proporcionando a los investigadores opciones para analizar la diferenciación de las células neuronales. A la hora de intentar este procedimiento, es fundamental empezar con células madre en óptimas condiciones.Por lo tanto, es importante que las EB, MPC y neuronas se cultiven en medios frescos y óptimos. La demostración visual de este protocolo es importante, ya que contiene detalles minuciosos que pueden afectar su éxito y efectividad, especialmente la parte de diferenciación. Comience por establecer un cultivo de células colgantes.Para una placa de cultivo celular de 10 centímetros, ajuste la concentración a 500 células por 20 microlitros de medio de diferenciación. Prepare suficiente suspensión celular para 50 gotas de 20 microlitros. Utilice una micropipeta o una pipeta repetidora para colocar gotas de 20 microlitros de suspensión celular en la tapa de una placa de cultivo de t

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este vídeo describe el método utilizado para el aislamiento de neuroprecursors de la corteza en desarrollo de embriones de ratones. El procedimiento para la eliminación de embriones del útero, la disección de los tejidos corticales, y la digestión de la corteza cerebral aislada se muestra.

Cultura de ratón con células madre neurales Precursores

Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Este video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias humanas, o hESCs, directamente en células progenitoras neurales sin usar células alimentadoras ni ningún paso intermedio. La inhibición selectiva de la proteína morfogenética ósea o BMP y las vías de señalización del factor de crecimiento transformante beta, o TGF-β, conducen a la diferenciación de las hESC en células progenitoras neurales, o NPC.

Diferenciación de células madre embrionarias humanas en progenitores neurales

Este video muestra un método para la generación in vitro de células progenitoras neurales (NPCs) a partir de células madre embrionarias de ratón (mESCs). Las mESCs se cultivan en suspensión para formar cuerpos embrioides (EBs), que luego son guiados para diferenciarse en NPCs mediante tratamiento con ácido retinoico en un cultivo adherente.

Una técnica para generar células progenitoras neurales a partir de células madre embrionarias de ratón

El video mostró un método de cultivo celular para diferenciar células progenitoras neurales en neuronas. Al incubar las células en un medio rico en nutrientes complementado con factores de crecimiento, las células progenitoras maduraron hasta convertirse en neuronas con axones y dendritas desarrollados. Un agente estabilizador garantizaba la viabilidad celular y protegía contra el daño oxidativo durante todo el proceso de diferenciación.

Diferenciación de Células Progenitoras Neurales en Neuronas

Este protocolo describe en detalle el método para generar progenitores neurales a partir de células madre embrionarias utilizando un método de monocapa sin suero. Estos progenitores se pueden utilizar para derivar tipos de células neuronales maduras o para estudiar el proceso de especificación neuronal y son susceptibles de escalado en formato multipocillo para el cribado de compuestos.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Este protocolo describe un método para generar progenitores interneurona cortical y poste-mitotic interneurona precursores de células madre embrionarias del ratón usando un método modificado de cuerpo para monocapa embryoid. Estos progenitores/precursores puede ser usado en vitro fluorescencia ordenados y trasplantado en neocortex neonatal para el estudio de determinación de destino o utilizado en aplicaciones terapéuticas.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

Aprende a diferenciar células madre embrionarias de ratón en neuronas mediante el método de gota colgante. Este protocolo incluye análisis fenotípico completo usando RT-qPCR, inmunofluorescencia y citometría de flujo para estudiar la neurogénesis in vitro.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

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