Name: Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a visualizar proteínas de reparación del ADN mediante inmunofluorescencia indirecta en células HeLa. Este método permite detectar focos proteicos y cuantificar colocalización para estudiar interacciones en sitios de daño.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación del área de San Antonio. El Mays Cancer Center está respaldado por la subvención principal del centro oncológico NCI P30 CA054174. Nos gustaría agradecer a Stephen Holloway por su ayuda para obtener los reactivos, y al laboratorio Sung por proporcionar espacio y capacidad de microscopía.

1. Cultivo celular de HeLa
<ol><li>Pretrata los cubreobjetos redondos de vidrio con 1 M HCl a 50oC durante 16-18 horas. Enjuagar con ddH2O y conservar en 100% EtOH.</li>
	<li>Preparar el medio de cultivo celular: añadir 10% (v/v) FBS al medio DMEM.</li>
	<li>Cultivar 4,0 x 104 células/pozo en una placa estéril de 12 pozos con un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 mm a 37 oC y 5% deCO2 en una incubadora humidificada. Crecer las células al 80% de confluencia (aproximadamente 24 horas).</li>
</ol>2. Tratamiento celular con radiación (IR)
<ol><li>Para inducir la formación de roturas de doble hebra, exponga las células a 4 Gy -irradiación (control: Sin irradiación, t-0). En la célula gamma -40, esto corresponde a 4.54 min, a 0.815 Gy por minuto.</li>
	<li>Incubar células a 37oC y 5% deCO2 en una incubadora humidificada para la duración adecuada (puntos de tiempo elegidos aquí t-1, 2, 4, 16 h).</li>
</ol>3. Extracción nuclear y fijación celular
<ol><li>Preparar soluciones de stock: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacarosa, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).</li>
	<li>Preparar el tampón de extracción nuclear (NEB): disolver 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM de sacarosa, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) y 0.5% (v/v) Tritón X-100 en ddH2O. Mix hasta que se disuelva completamente.</li>
	<li>Preparar 4% (v/v) paraformaldehído (PFA): disolver 10 ml de 16% de solución acuosa de PFA en PBS de 30 ml. Mezclar hasta que se disuelva por completo.</li>
	<li>En el punto de tiempo apropiado (t-0, 1, 2, 4, 16 h), lave las células dos veces con 1 ml de PBS. Retire PBS por completo.</li>
	<li>Añadir 200 l de NEB a cada pocómo para la extracción de núcleos celulares (el citoplasma se degrada, sólo queda el núcleo) (Figura 2). Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente y retirar completamente. NOTA: No exceda los 2 minutos.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg"> Figura 2: Extracción nuclear. Imágenes representativas de las células antes de la extracción nuclear (izquierda) y posterior (derecha). El citoplasma debe ser digerido, pero la estructura nuclear debe permanecer intacta después de la extracción (derecha). (A) aumento de 20x; barra de escala de 20 m y (B) aumento de 40x; barra de escala a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="6"><li>Lavar las células con 1 ml de PBS. Retire PBS por completo. Agregue PBS cuidadosamente, las células son muy frágiles en este paso.</li>
	<li>Añadir 200 l de 4% (v/v) PFA a cada pocóptil para la fijación de la célula. Incubar durante 10 minutos a 4oC. Retire PFA por completo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS. NOTA: Las celdas se pueden almacenar en PBS a 4 oC.</li>
</ol>4. Tinción de inmunofluorescencia
<ol><li>Preparar la solución de bloqueo: disolver 5% BSA (p/v) en PBS y añadir 0.3% (v/v) Tritón X-100. Mezclar hasta que se disuelva por completo.</li>
	<li>Preparar el tampón de dilución: disolver 1% BSA (p/v) en PBS y añadir 0.3% (v/v) Tritón X-100. Mezclar hasta que se disuelva por completo.</li>
	<li>Para el bloqueo, agregue 200 l de solución de bloqueo a cada pocól. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente o 16-18 horas a 4oC. NOTA: Si se utilizará un anticuerpo caprino, añada un 5% de suero de cabra a la solución de bloqueo.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo primario en el tampón de dilución (1:500; ver Tabla 2 para la lista de anticuerpos) y el vórtice hasta que esté bien mezclado. NOTA: Si se utiliza anticuerpo de cabra, agregue 1% de suero de cabra al tampón de dilución.</li>
	<li>En una caja de humedad/incubación, adhiera un trozo de parafilm. Añadir 10 l de anticuerpo primario (en una sola gota). Alinee un borde del cubreobjetos con la gota y baje lentamente sobre la parapelta, para que el líquido se propague por todas partes (evitar burbujas si es posible). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de dilución (concentración final: 2 g/ml) y el vórtice hasta que esté bien mezclado.</li>
	<li>Aplicar 10 l de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. NOTA: Proteger de la luz.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticuerpo</td>
			<td>Empresa</td>
			<td>Referencia</td>
			<td>Fuente</td>
		</tr>
<tr>
<td>53BP1</td>
			<td>Señalización celular</td>
			<td>4937</td>
			<td>Conejo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Mouse IgG H&amp;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150103</td>
			<td>Burro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-fosfo-histona H2A. X (Ser139), clon JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td>Ratón</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Rabbit IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150081</td>
			<td>Cabra</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Anticuerpos utilizados. Lista de anticuerpos utilizados en este estudio.
<ol start="9"><li>Lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto.</li>
	<li>Lave los cubreobjetos con H2O durante 1 minuto.</li>
	<li>Contrate el ADN con DAPI: aplicar 10 l de DAPI de 300 nM (como se describe para los anticuerpos), incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego montar en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de glicerol. Alternativamente, agregue una gota (10 l) de soportes comerciales de montaje antifada que contengan DAPI en una diapositiva y aplique un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y retire el exceso de líquido a su alrededor con una toalla de papel.</li>
	<li>Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y déjelos secar durante 20 minutos.</li>
	<li>Almacene los portaobjetos a 4oC.</li>
</ol>5. Adquisición de imágenes
<ol><li>Coloque una gota de aceite de inmersión en la lente objetivo 60x. Utilice DAPI para localizar los núcleos a través de la pieza ocular.<ol>
<li>Para la adquisición de imágenes XYZ, abra el software de adquisición y seleccione parámetros: Tipo de escáner: Galvano; Modo escáner: ida y vuelta; Tamaño de la imagen: 512-512; Modo PMT: VBF; Promedio de PMT: marco (4 veces); Escaneo secuencial PMT: línea.</li>
		<li>Seleccione el tinte y los detectores: Canal (CH1), Tinte (DAPI), Detector (SD1) Canal (CH2), Tinte (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3) Canal (CH3), Tinte (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)</li>
		<li>Seleccione ON en "Z".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste la imagen en vivo. Pulse el botón Live en la ventana Live.<ol>
<li>Ajuste el enfoque y ajuste la intensidad del láser (%), la sensibilidad (HV), la ganancia y el desplazamiento en la ventana de herramientas "PMT".<ol>
<li>Ajustar la intensidad del láser (%): para el brillo y el blanqueo. Cuanto mayor sea la intensidad del láser, más fuerte será la señal, pero la muestra fotoblanqueará.</li>
			<li>Ajuste la sensibilidad (HV): nivel de ruido. Cuanto mayor sea el HV, más fuerte será la señal, pero la imagen será ruidosa si es demasiado alta. NOTA: Mantenga siempre constante el voltaje.</li>
			<li>Ajuste el desfase: nivel de fondo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seleccione Inicio/Fin (15 sectores) para Pilas Z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie la adquisición.<ol>
<li>Seleccione la carpeta para guardar las imágenes. Pulse el botón Inicio de LSM para empezar a adquirir la imagen. Pulse el botón Series Done para completar la adquisición de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Para el análisis de imágenes, abra el software de análisis.<ol>
<li>Presione la ventana de herramientas Lote, seleccione las imágenes que desea analizar y seleccione la carpeta de salida.</li>
		<li>Pulse la ventana Herramienta Análisis y seleccione Proyección (mostrará la proyección de intensidad máxima de 15 sectores).</li>
		<li>En Configuración de entrada/salida, seleccione el lote creado.</li>
		<li>Pulse Procesar para que se procesen las imágenes.</li>
		<li>Exportar imágenes como archivos .tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la cuantificación de focos nucleares, abra CellProfiler.<ol>
<li>Abra la canalización de cuantificación de focos de 2AX y 53BP1 (consulte Información complementaria).</li>
		<li>Graficar datos utilizando un software de tabla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para el análisis de co-localización, abra CellProfiler.<ol>
<li>Abra la canalización de colocación (consulte Información complementaria). Se creará un archivo de hoja de cálculo y se guardará en la ubicación preferida. Sin embargo, los gráficos en sí no se guardarán automáticamente. Se sugiere tomar una instantánea de las ventanas para mantener un registro de los resultados.</li>
		<li>Graficar datos utilizando un software de tabla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+human+health%3A+the+roles+of+BRCA1%2C+BRCA2%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).</li>
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<li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li>
<li>Huertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+resection+in+eukaryotes%3A+deciding+how+to+fix+the+break%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).</li>
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<li>Sturzenegger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA2+cooperates+with+the+WRN+and+BLM+RecQ+helicases+to+mediate+long-range+DNA+end+resection+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El análisis del momento y la eficiencia de la reparación del daño del ADN por microscopía ha demostrado ser esencial para entender cómo funciona la maquinaria de reparación del ADN, en las células normales y en patologías humanas como el cáncer.
El desarrollo de anticuerpos específicos que permitan la detección de proteínas activadas en su versión fosforilada (como el 10,10,23,39,,43...

Las células humanas están constantemente expuestas a una variedad de agentes dañinos del ADN de diversos orígenes. Las fuentes exógenas consisten principalmente en la exposición a radiaciones, productos químicos (incluidos agentes quimioterápticos y algunos antibióticos) y virus, mientras que las principales fuentes endógenas incluyen errores en la replicación del ADN y el estrés oxidativo. Los efectos directos de la exposición genotóxica pueden variar de una base modificada a una rotura de doble cadena de ADN potencialmente letal (DSB), dependiendo de la tensión y la dosis de exposición. En última instancia, el daño del ADN no reparado o mal reparado puede conducir a la acumulación de mutaciones, reordenamientos genómicos, inestabilidad del genoma y eventualmente conducir a la carcinogénesis1. Las células de mamíferos han evolucionado vías complejas para reconocer tipos específicos de daño del ADN2,3 y repararlos de manera oportuna, sincronizados con la progresión del ciclo celular.
La radiación ionizante (IR) daña la doble hélice del ADN y crea roturas de doble cadena (DSB), una de las formas más perjudiciales de daño al ADN. El complejo MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funciona como un sensor de ADN termina y activa la proteína quinasa ataxia telangiectasia mutada (ATM)4,5. Después de la activación inicial de ATM por los extremos de ADN, ATM desencadena una cascada de eventos DDR en el sitio de la rotura, iniciando con un evento clave, la fosforilación de la variante de histona H2AX6. La fosforilación H2AX en el residuo S139 la activa en el OH2AX, abarcando regiones hasta megabases alrededor de la lesión de ADN6,7,8,9. Este evento aumenta la accesibilidad del ADN, lo que lleva al reclutamiento y acumulación de otras proteínas de reparación del ADN7. Debido a que el S2AX es abundante y específicamente inducido por DSB, se puede visualizar fácilmente utilizando anticuerpos específicos, y se utiliza comúnmente como un marcador suplente para DSB en el campo de reparación del ADN. Una vez que se señala la rotura, las células activan sus vías de reparación del ADN y procesan el daño del ADN. La proteína MDC1 (mediador de la proteína de control de daño del ADN 1) se une directamente a la proteína de control de daño del ADN10, interactúa con el ATM11 y también con NBS112,,13. Contribuye a aumentar la concentración del complejo MRN en el OSD e iniciar un bucle de retroalimentación ATM positivo. En consecuencia, se elimina rápidamente el H2AX una vez que se repara la rotura, lo que permite la supervisión del aclaramiento del OSD. Seguido de la microscopía, la disminución de la V2AX con el tiempo proporciona una medición indirecta de las roturas residuales y la eficiencia de la reparación del ADN.
Las células eucariotas pueden reparar DSB por varias vías, siendo las dos principales la unión final no homóloga (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR) (Figura 1). NHEJ esencialmente liga los extremos de doble hebra de ADN sin el uso de homología extendida y opera a lo largo del ciclo celular14,15. HR se vuelve predominante durante las fases S y G2, y de lo contrario se reprime, ya que requiere un cromátido hermano como plantilla homóloga para la reparación14,16. La elección de la vía entre NHEJ y HR no sólo depende de la proximidad física del cromátido hermano, sino también de la extensión de la resección final del ADN17,que inhibe el NHEJ.
La reparación del DSB dependiente de la homología inicia por degradación nucleolítica de la hebra de 5' desde los extremos de rotura para generar colas de ADN de una sola cadena (ssDNA) de 3', un proceso denominado resección de 5'-3'. El complejo MRN inicia la resección del extremo del ADN y la resección posterior se procesa en combinación con BLM/EXO1 (proteína del síndrome de Bloom/exonucleasa 1) o BLM/DNA2 (helicasa/nucleasa dependiente de la replicación del ADN)18,19,20,21,22. La resección final del ADN se ve reforzada por CtIP (proteína que interactúa con CtBP) a través de su interacción directa con el complejo MRN23 y el reclutamiento de BRCA1 (proteína de susceptibilidad tipo 1 de cáncer de mama)24,,25. La proteína de replicación A (RPA) se une rápidamente al ssDNA expuesto y luego es desplazada por la proteína recombinase RAD51 para formar un filamento de nucleoproteína que cataliza la búsqueda homóloga y la invasión dehebras 26,,27,,28.
El inicio de la resección es un paso crítico para la elección de la vía de reparación. Una vez iniciada la resección, los extremos del ADN se convierten en sustratos pobres para la unión por heterodista Ku70/Ku80 (componente de la vía NHEJ) y las células se comprometen a HR17,,29,,30. El heterodimero Ku70/Ku80 se une a los extremos del OSD, reclutando DNA-PKcs y p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 actúa como barrera de resección en G1, bloqueando así los recursos humanos mientras se promueve NHEJ31,32, pero se elimina de forma dependiente de BRCA1 en la fase S, permitiendo así que se produzca la resección33,,34. Por lo tanto, 53BP1 y BRCA1 desempeñan funciones opuestas en la reparación del OSD, siendo 53BP1 un facilitador DE NHEJ, mientras que BRCA1 actúa permitiendo la reparación a través de HR.
En el laboratorio, la formación de DSB puede ser inducida por radiación ionizante (IR). Mientras que este ejemplo utiliza una dosis alta de 4 Gy, 1 Gy y 2 Gy también crean una cantidad significativa de DSBs, adecuado para el análisis de la formación de focos por proteínas abundantes. Es importante tener en cuenta que el tipo y la dosis de radiación utilizada pueden conducir a diferentes lesiones en el ADN y en la célula: mientras que ir ir induce DSB, también puede causar roturas de una sola hebra o modificación de la base (ver35,36 para una referencia sobre la irradiación de transferencia de energía lineal (LET) y el tipo de daño del ADN). Para determinar la cinética de la formación de focos inducidos por radiación ionizante (IRIF) y su aclaramiento, que indican la reparación del daño y la reversión de la ACTIVA DDR8,9,37,38, la formación de focos puede ser monitoreada en diferentes puntos de tiempo después de la radiación ionizante.38 El tiempo de activación y aclaramiento de todas las proteínas de daño del ADN importante se conoce39, y muchos se investigan como marcadores sustitutos de eventos clave. Por ejemplo, pRPA, que posee una alta afinidad por ssDNA se utiliza como sustituto de la resección de rotura, las proteínas MRN (MRE11, RAD50, NBS1) y las exonucleas también se pueden utilizar para evaluar la eficiencia de la resección. Mientras que RAD51, BRCA1, BRCA2 (proteína de susceptibilidad tipo 2 de cáncer de mama), y PALB2 (socio y localizador de BRCA2) se pueden monitorear para evaluar la eficiencia de HR, la presencia de las proteínas Ku o 53BP1, se utilizan como marcadores de NHEJ (Figura 1).
A medida que las proteínas de la maquinaria de reparación del ADN se reclutan entre sí para la ruptura y se ensamblan en supera complexios, las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína se pueden inferir siguiendo su localización individual a lo largo del tiempo y analizando la co-localización de proteínas, visualizadas por señales superpuestas en las células40,,41,,42. En las líneas celulares, la introducción de mutaciones puntuales o la deleción en genes específicos de reparación del ADN, ya sea a través de la edición del genoma, o mediante la sobreexpresión de mutantes a base de plásmidos, permite la investigación de residuos específicos y su posible papel en el reconocimiento del daño del ADN (por ejemplo, la co-localización con el OH2AX) o el montaje complejo (co-localización con otra, o varias, proteínas), así como su impacto en la reparación del ADN. Aquí, utilizamos la inmunofluorescencia indirecta como medio para investigar la formación y la resolución de los DSB siguiendo a los focos de H2AX a lo largo del tiempo. También presentamos un ejemplo de formación de focos y análisis de co-localización por un actor importante en la reparación del DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Como se mencionó anteriormente, 53BP1 se considera fundamental para la elección de la vía de reparación del ADN. Después de la acumulación de 53BP1 y su co-localización con el S2AX proporciona información valiosa sobre la fase del ciclo celular, la acumulación de daño en el ADN y la vía utilizada para reparar DSB. El propósito de la inmunolocalización indirecta es evaluar la eficiencia de la reparación del daño del ADN en las líneas celulares, después de IR como en este estudio, o después de la exposición a diversas tensiones en la célula, desde la reticulación del ADN hasta el bloqueo de la horquilla de replicación (se proporciona una lista de agentes que dañan el ADN en la Tabla 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg"> Figura 1: Dna double strand breaks (DSB) vías de reparación. La reparación del DSB implica dos vías principales: recombinación homóloga (HR, izquierda) y unión final no homóloga (NHEJ, derecha). Después de la rotura, las proteínas se activan para marcar la rotura ( H2AX), participar en la resección final (MRN), recubrir el ssDNA resecado (pRPA), promover la recombinación (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) o limitar la resección y promover NHEJ (53BPBP). Otras proteínas participan en la reparación del daño, pero las proteínas enumeradas son seguidas rutinariamente por inmunofluorescencia indirecta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Agente dañante del ADN</td>
			<td>Mecanismo de acción</td>
			<td>Dosis recomendada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rayos/rayos X</td>
			<td>Radiación Formación de roturas de doble cadena con algunos efectos celulares incontrolados</td>
			<td>1-4 Gy</td>
		</tr>
<tr>
<td>
36 Incendios</td>
			<td>Radiación Formación de roturas de doble cadena</td>
			<td>270 keV/m</td>
		</tr>
<tr>
<td>partículas</td>
			<td>Radiación Formación de roturas de doble cadena</td>
			<td>116 keV/m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bleomicina</td>
			<td>Inhibidor de la síntesis de ADN</td>
			<td>0,4-2 g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptotecina</td>
			<td>Inhibidor de la topoisomerasa I</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cisplatino</td>
			<td>Agente alquilante (induciendo reticulaciones intrastrand)</td>
			<td>0,25-2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doxorrubicina</td>
			<td>Agente intercalador Inhibidor de la topoisomerasa II</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etoposide</td>
			<td>Inhibidor de la topoisomerasa II</td>
			<td>10 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hidroxiurea</td>
			<td>Inhibidor de la síntesis de ADN (por ribonucleótido reductasa)</td>
			<td>10-200 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metanoesulfonato de metilo</td>
			<td>Agente alquilante</td>
			<td>0,25-2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mitomicina C</td>
			<td>Agente alquilante</td>
			<td>0,25-2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luz ultravioleta (UV)</td>
			<td>Formación de dimers de timidina (generando distorsión de la cadena de ADN)</td>
			<td>50-100 mJ/cm2
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Agentes genotóxicos. Ejemplos de agentes dañinos para el ADN, su mecanismo de acción y el daño inducido en función de la concentración de trabajo sugerida.

<table><tbody><tr><td>Solución acuosa de paraformaldehído (PFA) al 16% (v/v) Electrónica</td><td>Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>La calidad de la microscopía del PFA garantiza las mejores imágenes. Si usa "PFA casero", filtre antes de usar.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>Se recomienda la fracción de choque térmico, para evitar precipitaciones/fondo.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos #1, redondo de 18 mm (cubreobjetos)</td><td>Neuvitro</td><td>NC0308920</td><td>Los cubreobjetos deben limpiarse y esterilizarse antes de su uso, con HCl o etanol.</td></tr><tr><td>DMEM, Alta glucosa [(+) 4,5 g/L D-glucosa, (+) L-glutamina, (-) piruvato de sodio]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>Ajuste el medio de cultivo a las necesidades de la línea celular utilizada.</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS para el cultivo de tejidos.</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(&beta;-aminoethyl éter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Research Products International</td><td>E57060</td><td>Tampón de extracción nuclear.</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>La calidad del FBS puede evaluarse mediante el análisis de la formación de focos de gH2AX. Si hay trazas de endotoxina genotóxica en el lote, el gH2AX será positivo en ausencia de estrés.</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Research Products International</td><td>M24000</td><td>Tampón de extracción nuclear.</td></tr><tr><td>Piperazina-N, N&prime;-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES)</td><td>Research Products International</td><td>P40150</td><td>Tampón de extracción nuclear.</td></tr><tr>En su lugar, se puede utilizar el <td>montante antidecoloración SlowFade Diamond con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI con medio de montaje antidesvanecimiento VECTASHIELD.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Research Products International</td><td>S23020</td><td>Tampón de extracción nuclear.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Research Products International</td><td>S24060</td><td>Tampón de extracción nuclear.</td></tr><tr>En su lugar, se pueden utilizar <td>portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>1255015</td><td></td><td>portaobjetos de polisina.</td></tr><tr><td>Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, tamaño 12 pocillos</td><td>Costar</td><td>3513</td><td>La siembra en cubreobjetos se realiza en placa de 12 pocillos.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>Tampón de extracción nuclear.</td></tr><tr>En su lugar, se puede utilizar la <td>enzima TrypLE Express (1X), el Gibco rojo sin fenol</td><td></td><td>12604021</td><td>la tripsina-EDTA.</td></tr><tr>En su lugar, se puede utilizar <td>tripsina-EDTA (0,5%), sin rojo de fenol</td>, <td>Gibco</td><td>15400054</td><td>TrypLE.</td></tr></tbody></table>

visualización de la interacción de proteínas de reparación del adn por inmunofluorescencia

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Las células de mamíferos están constantemente expuestas a sustancias químicas, radiaciones y subproductos metabólicos de origen natural, que crean tipos específicos de insultos de ADN. Los agentes genotóxicos pueden dañar la columna vertebral del ADN, romperlo o modificar la naturaleza química de las bases individuales. Después del insulto al ADN, se activan las vías de respuesta al daño del ADN (DDR) y se reclutan proteínas implicadas en la reparación. Una gran cantidad de factores están involucrados en la detección del tipo de daño y la activación de la respuesta de reparación adecuada. No activar y reclutar correctamente factores DDR puede conducir a una inestabilidad genómica, lo que subyace a muchas patologías humanas, incluido el cáncer. Los estudios de proteínas DDR pueden proporcionar información sobre la respuesta de fármacos genotóxicos y los mecanismos celulares de resistencia a los medicamentos.
Hay dos formas principales de visualizar las proteínas in vivo:la observación directa, etiquetando la proteína de interés con una proteína fluorescente y siguiéndola por imágenes en vivo, o inmunofluorescencia indirecta en muestras fijas. Mientras que la visualización de proteínas etiquetadas fluorescentemente permite una monitorización precisa con el tiempo, el etiquetado directo en N- o C-terminus puede interferir con la localización o función de la proteína. Se prefiere la observación de proteínas en su versión endógena no modificada. Cuando las proteínas de reparación del ADN son reclutadas para el insulto del ADN, su concentración aumenta localmente y forman grupos, o "foci", que pueden ser visualizados por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos específicos.
Aunque la detección de focos proteicos no proporciona una prueba definitiva de interacción directa, la co-localización de proteínas en las células indica que se reagrupan en el lugar del daño y pueden informar de la secuencia de eventos necesarios para la formación compleja. Un análisis cuidadoso de la superposición espacial de los focos en células que expresan versiones de tipo salvaje o mutantes de una proteína puede proporcionar pistas preciosas sobre dominios funcionales importantes para la función de reparación del ADN. Por último, la co-localización de proteínas indica posibles interacciones directas que pueden ser verificadas por co-inmunoprecipitación en las células, o extracción directa usando proteínas purificadas.

En el día 2, o 24 h después de las células de siembra en los cubreobjetos, las células han sufrido una división y son 80% confluentes. Los derribos o mutaciones específicos en las proteínas de reparación del ADN pueden aumentar el tiempo de duplicación, o sensibilizar a las células al tratamiento genotóxico, y la densidad de siembra, así como las dosis de tratamiento, deben ajustarse en consecuencia. Para determinar las mejores condiciones de trabajo, el tiempo de la respuesta al daño del ADN puede ser establecido por la...

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

La inmunofluorescencia indirecta permite detectar proteínas de reparación del ADN, fotos de reclutamiento espacial y temporal y ayuda a interrogar las interacciones de Proteinprotein en el sitio del daño del ADN. Después del daño del ADN, las proteínas de reparación del ADN se reclutan para el insulto del ADN mientras que su concentración aumenta localmente, y forman grupos llamados focos que pueden ser visualizados por inmunofluorescencia indirecta en muestras fijas. Esta técnica se puede utilizar para detectar focos proteicos, así como para cuantificar la colocación del presente en las células.Esto puede ayudar a explicar la secuencia de eventos necesarios para la formación compleja y para la reparación del ADN. interacciones particulares con proteínaproteínas pueden implicarse de tales experimentos. Demostrando el procedimiento estará Barbara De La Pena, una foto Postdoc muy talentosa de mi laboratorio Begin por el cultivo de 40.000 células HeLa en cada bien sobre 12 pozos con un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 milímetros a 80% de confluencia.Después de exponer las células a cuatro irradiaciones gamma grises, lávelas dos veces con un mililitro de PBS. A continuación, retire el PBS por completo y agregue 200 microlitros de NDB a cada pozo. Incubar las células durante dos minutos a temperatura ambiente y luego retirar el NDB.Tenga en cuenta que el tiempo de incubación puede variar dependiendo de la línea celular, pero generalmente no debe exceder los dos minutos. Lave las células con un mililitro de PBS. A continuación, retire el PBS por completo y agregue 200 microlitros de 4%PFA a cada pozo para la fijación celular.Incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, quite la PFA y agregue un mililitro de PBS a cada pozo. Retire el PBS por completo y luego agregue 200 microlitros de solución de bloqueo a cada pozo e incubar las células durante dos horas a temperatura ambiente o de 16 a 18 horas a cuatro grados centígrados.diluir el anticuerpo primario y el tampón de dilución y el vórtice hasta que esté bien mezclado en una caja de humedad y aquí un trozo de parafilm y añadir 10 microlitros de anticuerpo primario en una sola gota. Alinee un borde del cubreobjetos del pozo con la gota y baje lentamente sobre la parafilma que esparce el líquido. incubar las cubiertas durante dos horas a temperatura ambiente.Después de la incubación, la cubierta se desliza tres veces en PBS durante un minuto por lavado. diluir el anticuerpo secundario y el tampón de dilución y el vórtice hasta que esté bien mezclado, aplicar 10 microlitros de anticuerpo secundario a cada cubrelip como se describió anteriormente e incubarlo durante dos horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave los resbalones de la cubierta tres veces con PBS y una vez con agua durante un minuto por lavado.A continuación, montarlos en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de glicerol que contiene los sellos DAPI con esmalte de uñas transparente y dejar que se sequen durante 20 minutos. Coloque una gota de aceite de inmersión en la lente objetivo de 60 x y utilice DAPI para localizar los núcleos a través del ocular para la adquisición de imágenes XYZ, abra el software de adquisición y establezca el tipo de escáner como galvano el tipo de escáner como de ida y vuelta y 512 por 512 tamaño de imagen. En el panel PMT, establezca el modo en promedio VBM a fotograma y escaneo secuencial a línea.A continuación, establezca el tinte y los detectores de calor para que el canal uno se active a DAPI y SD uno, el canal dos en alexafluor 488 y HSD tres, y el canal tres a alexafluor en 647 y HSD cuatro seleccione para Z.To ajustar la imagen en vivo, pulse el botón en vivo en la ventana en vivo y ajuste el enfoque. A continuación, utilice la ventana de herramientas PMT para establecer la sensibilidad de intensidad láser, ganancia y desplazamiento para pilas z, seleccione de principio a fin y 15 sectores. Seleccione la carpeta para guardar las imágenes y pulse el botón Inicio de LSM para empezar a adquirir.Cuando haya terminado, pulse el botón de la serie para completar la adquisición de la imagen. Abra el software de análisis y, a continuación, pulse la ventana de herramientas por lotes y seleccione las imágenes que desea analizar. Vaya a la ventana de herramientas de análisis y seleccione la proyección, que mostrará la proyección de intensidad máxima de 15 sectores.En la configuración de salida de entrada, seleccione el lote y la carpeta de salida creados. Proceso de prensa para que las imágenes se procesen y exporte las imágenes como archivos TIFF. Realizar la cuantificación nuclear con cellprofiler de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Las células no tratadas con la radiación presentan muy pocos signos de exposición gamma H2AX. En ausencia de proteínas esenciales de reparación del ADN, se puede observar la acumulación de gamma H2AX en las roturas del ADN. La acumulación de roturas no reparadas puede llevar a las células a volverse pre hipotónicas indicadas por núcleos gamma H2AX sólidos.Después de la irradiación, los núcleos exhiben un gran número de roturas de doble hebra a las que la gamma H2AX se localiza extremadamente rápidamente. Mientras que pocos o ningún foco se observa en ausencia de una radiación, el número de focos se cuantificó en una dos cuatro y 16 horas después de una radiación y para el control de radiación noa. Dependiendo de la cuestión biológica planteada y del tipo de datos requeridos, se deben considerar las diferentes opciones de trazado Colocación mediante la multiplexación de anticuerpos primarios criados en diferentes especies animales y utilizando anticuerpos secundarios, se etiquetan con distintos fluoróforos.Superposición de verde y rojo, da lugar a puntos de acceso amarillos, las dos proteínas de interés están presentes en los mismos píxeles. El análisis cuantitativo de la colocación se puede lograr mediante un enfoque basado en objetos o mediante un enfoque estadístico que realiza análisis basados en el coeficiente de correlación de intensidad. Una combinación de anticuerpos primarios criados en diferentes especies animales, se puede utilizar en este protocolo.Asegúrese de que los anticuerpos son compatibles y no interfieran entre sí. Debe establecer adecuadamente el anticuerpo secundario que se utilizará contra cada uno de los anticuerpos primarios y considerar una superposición espectral particular al seleccionar la menor fuerza que se utilizará. La colocación o las proteínas indican posibles interacciones directas.Esto puede ser verificado por precipitación granular en las células, o por la colocación directa usando proteínas purificadas in vitro.

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Biology

Biología

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

En este video, describimos la técnica de microscopía de inmunofluorescencia para detectar proteínas específicas de respuesta al daño del ADN localizadas en los sitios de roturas de doble cadena del ADN en células mononucleares humanas. Las proteínas son reconocidas por anticuerpos primarios específicos, que a su vez se unen a anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos que emiten fluorescencia durante la visualización microscópica, lo que permite la visualización de las proteínas como...

Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

El siguiente protocolo presenta la detección de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular utilizando la sincronización del ciclo celular seguida de la tinción inmunofluorescente de RPA2.

Visualización de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular

Aprende a visualizar proteínas de reparación del ADN mediante inmunofluorescencia indirecta en células HeLa. Este método permite detectar focos proteicos y cuantificar colocalización para estudiar interacciones en sitios de daño.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

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