Name: Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a cultivar poblaciones de Caenorhabditis elegans a gran escala para investigación ómica. Este método permite obtener millones de gusanos con mínima manipulación y documentar su crecimiento de forma consistente.

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Agradecemos a los miembros del Laboratorio Edison por sus útiles discusiones y comentarios sobre este manuscrito; en particular, B.M. García. Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que es financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440), y CeNDR, que es financiado por NSF Living Collections CSBR 1930382. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH (U2CES030167).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una variedad de recipientes se pueden utilizar como LSCP. En este protocolo, un plato de la hornada de cristal estándar fue utilizado. Los LSPCs en uso tenían dimensiones exteriores de 35,56 x 20,32 cm, dimensiones interiores de 27,94 x 17,78 cm, y aproximadamente 4,45 cm de profundidad y venían con una tapa ajustada. Por lo tanto, la cantidad de bacterias utilizadas aquí se ha optimizado para un LSCP con las dimensiones anteriores para producir una gran población de gusanos de etapa mixta. El volumen bacteriano y la concentración se pueden ajustar para adaptarse a las necesidades experimentales.
La contaminación por moho, hongos u otras fuentes bacterianas puede ocurrir en cualquier paso del método LSCP, así que maneje las muestras con cuidado. Antes de comenzar cualquier paso en el protocolo, asegúrese de que el espacio de trabajo se limpie con 70% de etanol y 10% de lejía. Si está disponible, trate las áreas usadas con luz UV durante 30 minutos y encienda un filtro de aire HEPA 30 minutos antes de comenzar cada paso.
Al cultivar el LSCP en un entorno controlado(es decir,en una sala de TC establecida a 20 °C), el usuario puede rastrear más fácilmente el crecimiento de la muestra y documentar la contaminación potencial. Si la superficie del LSCP se contamina, corte la contaminación cuando sea posible y deje que la muestra continúe creciendo o deseche la muestra si la contaminación no es posible controlar. Es imperativo abordar la contaminación rápidamente para reducir el crecimiento no deseado y para asegurarse de que no está superando a los gusanos en cuanto a recursos.
Este método está destinado a aquellos que quieren cultivar cultivos de poblaciones mixtas a gran escala de C. elegans. Aunque puede ser posible cultivar poblaciones sincronizadas de gusanos en el LSCP como se hace en placas de Petri disponibles en el mercado y en cultivo líquido, los autores no han probado esta opción. Además, si los usuarios desean cultivar más de aproximadamente 2,4 millones de gusanos en promedio en una muestra dada, se recomienda un método diferente4. El éxito del crecimiento depende de la cepa que se está procesando en la tubería. Los autores fueron capaces de cultivar con éxito poblaciones de aproximadamente 2,4 millones de gusanos en al menos cinco réplicas biológicas de 15 cepas de C. elegans, lo que indica que el método es robusto.
Antes de comenzar el experimento, tenga en cuenta que la edad y la salud de un gusano determinado pueden influir en la fecundidad y el tiempo de crecimiento de la población posterior. Asegúrese de que los gusanos se mantienen en condiciones saludables con un estrés mínimo antes de ser utilizados en esta canalización. Se supone que las muestras de stock se han creado, congelado y mantenido a -80 °C para reducir la deriva genética con el tiempo.
Dependiendo de las necesidades de un experimento dado, el número de adultos grávidos iniciales en un LSCP puede ser cambiado. Alterar el número de adultos grávidos iniciales en el LSCP cambiará la tasa de crecimiento y, por lo tanto, el tiempo para cosechar. Cinco adultos grávidos se utilizan para sembrar cada LSCP por las siguientes razones: (1) Se necesitaba una forma simple, rápida y eficiente de sembrar muchas cepas de C. elegans en LSCP a la vez y (2) reducir las diferencias de edad entre los adultos grávidos recogidos que podrían conducir a la heterogeneidad del crecimiento.
Este método permite al usuario cosechar grandes poblaciones de gusanos con todas las etapas del ciclo de vida presentes. Con los métodos actuales disponibles, la recolección de muestras a gran escala de C. elegans requiere la sincronización de la lejía para obtener el número de gusanos deseados para el trabajo aguas abajo. Dado este enfoque, ahora se pueden cultivar tantos gusanos como antes fuera posible en fermentadores o cultivos de líquidos a gran escala sin las dificultades asociadas con la sincronización de la lejía y múltiples pasos de manejo. Nuestro protocolo permite apuntar a las cepas de interés de manera eficiente, utilizar un tiempo de manipulación mínimo en el cultivo de la muestra en sí, y aislar las etapas de los gusanos o la población según sea necesario en las tuberías aguas abajo.
Un LPFC fue utilizado como herramienta para documentar la distribución y el tamaño de la población en un LSCP dado. El LPFC utilizado es un sistema de flujo continuo que analiza, clasifica y dispensa gusanos en función de su tamaño (TOF) y densidad óptica. A medida que un gusano dado pasa a través de la celda de flujo, el detector de pérdida de luz axial captura la cantidad de luz de señal bloqueada por un láser de estado sólido de 488 nm durante el tiempo que tarda un gusano en pasar, dando al usuario el TOF y la densidad óptica del gusano. La óptica y los detectores de recolección de fluorescencia también se pueden utilizar para maximizar la sensibilidad a la fluorescencia y la recolección en cada muestra. Los parámetros de recolección de LPFC variarán según el instrumento. Los usuarios pueden emplear una variedad de plataformas para capturar el tamaño del gusano y no están limitados a utilizar este protocolo si un LPFC no está disponible.
Los autores están utilizando muestras cultivadas en el método descrito aquí para identificar metabolitos desconocidos en varias cepas de C. elegans a través de cromatografía líquida – espectrometría de masas, espectroscopia de RMN, y la secuenciación de ARN. Los autores planean continuar utilizando este método para el crecimiento de muestras en esta tubería con una variedad de cepas de C. elegans, ya que las nuevas cepas de interés se pueden procesar fácilmente utilizando esta tubería.

C. elegans es un pequeño nematodo de vida libre que se encuentra en todo el mundo en una variedad de hábitats naturales1. Su relativa facilidad de crecimiento, el rápido tiempo de generación, el sistema de reproducción y el cuerpo transparente lo convierten en un poderoso organismo modelo que ha sido ampliamente estudiado en biología del desarrollo, envejecimiento, neurobiología y genética2,3. El copioso trabajo sobre C. elegans lo convierte en un candidato principal para usar en estudios ómicos para vincular exhaustivamente los fenotipos con componentes biológicos complejos y sus relaciones en un organismo dado.
Para utilizar C. elegans en la investigación ómica colaborativa, se necesita un método para generar grandes poblaciones de animales en etapas mixtas donde una sola muestra se pueda dividir y utilizar en diversas plataformas e instrumentos para análisis comparativos. La creación de una canalización para generar una muestra de este tipo requiere un gran conocimiento de la dieta, el medio ambiente, el estrés, la estructura de la población y el manejo y la recolección de muestras. Por lo tanto, es crucial tener condiciones de cultivo estándar y reproducibles integradas en tuberías a gran escala. En la investigación de C. elegans, se utilizan dos métodos tradicionales para cultivar gusanos: placas de Petri de agar y cultivo líquido4.
Históricamente, cuando se necesitan grandes cantidades de C. elegans, se cultivan en cultivo líquido4. Los pasos involucrados en la generación de una gran población de gusanos en cultivo líquido requieren múltiples pasos de manejo que a menudo incluyen la sincronización de la lejía para romper las cutículas adultas grávidas, liberando embriones para lograr el tamaño de población deseado. Sin embargo, cuando se utiliza la sincronización de la lejía, el crecimiento de la población depende del tamaño inicial del censo y, por lo tanto, afecta el crecimiento posterior y los números de población. Además, las cepas de C. elegans varían en su sensibilidad a la cutícula, el tiempo de exposición y la respuesta de estrés a la sincronización de la lejía, lo que dificulta el ensayo de muchas cepas a la vez5,6,7,8,9.
Además, el crecimiento de gusanos en el cultivo de líquidos requiere un par de pasos de transferencia, ya que a menudo se recomienda cultivar solo una generación de gusanos antes de la cosecha porque el hacinamiento puede ocurrir fácilmente si se cultiva durante varias generaciones y conducir a la formación de dauer a pesar de la presencia de alimentos10. La formación de Dauer se produce a través de pequeñas moléculas de señalización como los ascarósidos, a menudo denominados "feromonas dauer"11,12,13,14,se liberan en medios líquidos y afectan el crecimiento de la población. Además, el crecimiento de grandes poblaciones de gusanos en cultivo líquido conduce a un exceso de acumulación de bacterias en el cultivo, creando dificultades cuando se necesita una muestra limpia para ensayos fenotípicos aguas abajo. Por último, cuando un cultivo líquido se contamina, es más difícil de mantener ya que las esporas fúngicas o las células bacterianas se dispersan fácilmente por todo el medio15.
El otro método tradicional de cultivo de C. elegans es en placas de Petri de agar. Las placas de Petri disponibles comercialmente permiten cultivar fácilmente múltiples generaciones de gusanos de etapa mixta sin los rápidos efectos del hacinamiento y la formación de altos dauer como se ve en los cultivos líquidos. Sin embargo, una desventaja para el crecimiento de gusanos en las placas de Petri de agar tradicional es que la placa de Petri más grande disponible comercialmente no produce grandes poblaciones de gusanos para un estudio -omics sin agregar un paso de sincronización de lejía. En resumen, el cultivo de poblaciones de etapa mixta de C. elegans en placas de Petri de agar es más adecuado para la recolección de datos ómicos, pero se requiere un método para generar tamaños de población muy grandes sin cultivo líquido.
Aquí, presentamos un método para cultivar y recolectar grandes poblaciones de C. elegans de etapa mixta en placas de cultivo a gran escala (LSCP). La recolección de muestras a través de esta tubería produce suficiente muestra para recopilar datos fenotípicos y de población, junto con cualquier dato necesario para los experimentos de -ómica(es decir,genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica). Además, el método LSCP requiere una manipulación mínima de los animales, menos tiempo de preparación del usuario, proporciona un control ambiental estricto y garantiza que el manejo de cada muestra sea consistente a lo largo del estudio para la reproducibilidad general.

<table><tbody><tr><td>Pipetas Serológicas Estériles de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 10 ul</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 100 ul</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado de 1000 mL</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1000 ul</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de 190 grados</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer de cuello ancho de 2 L</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aspiración de fluidos G de control BVC</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Clorox Bleach</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Sala de Control de Temperatura Conviron</td><td>Conviron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well Black con microplaca de poliestireno transparente de fondo plano tratada con TC</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Acuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 24 pozos</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Purificador Honeywell True HEPA de 465 pies cuadrados.</td><td>Home Depot</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultivo a Gran Escala (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Molde de vidrio de 2 cuartos de Pyrex con tapa roja</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos planos para microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos Moleculares ImageXpress</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Número de modelo: IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , los autores utilizaron MetaXpress Software Versión 6.5.4.532</td></tr><tr><td>Nistatina (10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Monobásico de fosfato potásico</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Microsferas Fluroscentes Rojas</td><td>Policiencias</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Dibásico fosfato sódico anhidro</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Juego estándar de pipetas Gilson</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina (100mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , los autores utilizaron: Flow Pilot versión 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

cultivo y ensayo de las poblaciones de caenorhabditis elegans de etapa mixta a gran escala

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha sido y sigue siendo un valioso organismo modelo para estudiar la biología del desarrollo, el envejecimiento, la neurobiología y la genética. El gran cuerpo de trabajo sobre C. elegans lo convierte en un candidato ideal para integrarse en estudios de grandes poblaciones, en animales enteros, para diseccionar los componentes biológicos complejos y sus relaciones con otro organismo. Con el fin de utilizar C. elegans en la investigación ómica colaborativa, se necesita un método para generar grandes poblaciones de animales donde una sola muestra puede ser dividida y ensayada a través de diversas plataformas para análisis comparativos.
Aquí, un método para cultivar y recoger una población abundante de los elegans de la C. de la mezclado-etapa en una placa de cultivo en grande (LSCP) y los datos fenotípicos subsecuentes se presentan. Esta tubería produce un número suficiente de animales para recopilar datos fenotípicos y de población, junto con cualquier dato necesario para los experimentos -ómicos (es decir, genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica). Además, el método LSCP requiere una manipulación mínima de los propios animales, menos tiempo de preparación del usuario, proporciona un control ambiental estricto y garantiza que el manejo de cada muestra sea consistente a lo largo del estudio para la reproducibilidad general. Por último, se presentan métodos para documentar el tamaño de la población y la distribución de la población de las etapas de la vida de C. elegans en un LSCP dado.

El crecimiento de C. elegans utilizando el método LSCP produce un promedio de aproximadamente 2,4 millones de gusanos de etapa mixta por muestra durante 12,2 días. El crecimiento de C. elegans utilizando el método LSCP permite a los usuarios generar grandes poblaciones de etapa mixta de C. elegans con poco manejo y manipulación de los animales, lo que es ideal para estudios ómicos a gran escala(Figura 1). Una vez que un LSCP se ha lleno de gusanos adultos, ha alcanzado un gran tamaño de población y le quedan bacterias mínimas, los usuarios pueden cosechar y estimar el tamaño de la población. Este punto también puede servir como un control de calidad mediante la evaluación de si la población es suficiente para su uso en una tubería -ómica (Figura 2). La dinámica de la población depende de la cepa en sí, el comportamiento de la cepa(es decir,las cepas de madriguera tienden a tener una menor recuperación del gusano) y el éxito del crecimiento(es decir,la contaminación). El método LSCP se probó en 15 cepas de C. elegans que contenían una mezcla de mutantes del Caenorhabditis Genetics Center (CGC) y cepas silvestres de Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR)25. Los genotipos de cepa se describen en la Tabla suplementaria 3.
El método LSCP produjo tamaños de población de aproximadamente 94.500 a 9.290.000. El tamaño medio de la población dentro de la cepa de referencia, PD1074, y a través de las cepas fue de aproximadamente 2,4 millones de gusanos (Figura 3). No se encontraron diferencias significativas en los tamaños de población estimados entre las cepas de C. elegans en el transcurso de un promedio de 12,2 días de crecimiento de LSCP(Figura 4). Pd1074 LSCPs tomó entre 10 – 14 días para crecer a una población completa de etapa mixta. El tiempo medio de crecimiento en pd1074 fue de 10 días. La cepa de crecimiento más lento creció durante un máximo de 20 días, y la cepa de crecimiento más rápido creció durante un mínimo de 10 días (Figura 4).
Por lo tanto, utilizando este método LSCP, los usuarios pueden integrar fácilmente nuevas cepas de interés en un estudio con poco conocimiento de la sincronización del desarrollo y la experiencia de fondo. Tenga en cuenta que las cepas y fenotipos que tienen que ser mantenidos por picking, tienen defectos de fecundidad, son heterocigotos, o tienen defectos de crecimiento pueden no funcionar bien en esta tubería.
La citometría de flujo de partículas grandes y las imágenes de muestras permiten a los usuarios documentar la distribución de la población. Se puede utilizar una amplia variedad de plataformas para medir el crecimiento exitoso de la población.
Para mediciones -ómicas reproducibles, es importante cultivar cultivos consistentes. Las métricas de reproducibilidad del cultivo son el número de gusanos y una distribución de tamaño consistente para una cepa dada. Mostramos la distribución de la muestra para la cepa de referencia, PD1074 , una variante de la cepa original N2 Bristol, utilizando el LPFC23,26 y las imágenes de microscopio micro confocal como proxies para el éxito del crecimiento. Como los gusanos se midieron desde el estadio L1 hasta el adulto grávido en la distribución lpfc(Figura 5),las imágenes posteriores(Figura 6),y la variación en la distribución de la población a través de las muestras(Figura 7),podemos ver que esta tubería generó una población en etapa mixta de C. elegans.
Para echar un vistazo más de cerca a la distribución de la población de nuestras muestras de etapa mixta, observamos la distribución de 35 PD1074 LSCPs observando el porcentaje de gusanos que caen dentro de cada región a lo largo de toda la distribución de Tiempo de Vuelo (TOF)(es decir,longitud del cuerpo)(Figura 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general de la canalización de crecimiento de gusanos LSCP. (A) Una vez recibidas en el laboratorio , todas las cepas se prepararon y congelaron para su almacenamiento a largo plazo a -80 °C2. B) Se preparó una placa "master chunk" a partir de una culata de gusanos congelados y se almacenó a 15 °C para ser utilizada durante un mes como mayor. (C) Cada muestra pasó por cuatro pasos sucesivos de fragmentación para reducir el estrés generacional antes de crecer en el LSCP. (D)seleccionaron a 5 adultos grávidos individuales del "pedazo 4" placa de 6 cm en el paso (d) y el punto blanqueado en cinco áreas dadas del LSCP. (E)El LSCP se colocó en una sala de temperatura controlada y creció a 20 °C hasta que el LSCP estaba lleno de gusanos adultos, alcanzó un gran tamaño de población y le quedaban bacterias mínimas. (F) La población de gusanos se cosechó y se recogió para los pasos aguas abajo. (G) Las alícuotas se crearon a partir del LSCP y se congelaron flash para las aplicaciones deseadas aguas abajo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figura 2: Visión general de la cosecha de LSCP y la estimación del tamaño de la población. (A)se utilizaron 50 mL de M9 para lavar gusanos de la superficie ngma. La suspensión del gusano fue pipeteada en un tubo cónico de 50 mL. El paso (A) se repitió dos veces. (B)15 mL de suspensión de gusanos se vertieron en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Los gusanos fueron peleteados por centrifugado. M9 + la ruina fue aspirada apagado sin la pelotilla del gusano que disturba. El paso (b) fue repetido hasta que los 150 mL de la suspensión del gusano fueran recogidos. (C) El pellet de gusano fue lavado y centrifugado tres veces con M9 para eliminar los restos restantes. Una vez que la muestra estaba limpia, el pellet de gusano se resuspendió en 10 mL de ddH2O.(D)Se creó una dilución en serie de la muestra para estimar el tamaño de la población de gusanos. Se utilizaron los factores de dilución que permitieron contar con precisión los gusanos. Los factores de dilución utilizados cambiaron dependiendo del tamaño de la población del LSCP. (E) Una vez que se eligieron los factores de dilución, todos los gusanos de las tres réplicas alícuotas de esa dilución se pipetearon en un portaobjetos limpio y los gusanos se contaron bajo un microscopio de disección. (F) La muestra se dividió en alícuotas de tamaño apropiado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figura 3: El método LSCP generó en promedio una población de 2,4 millones de gusanos de etapa mixta. El LSCP produce tamaños de población en los crecimientos de población más pequeños en torno a 94.500 y en los mayores crecimientos de población en torno a 9.290.000. El tamaño medio de la población en todas las cepas fue de 2,4 millones de gusanos. Las barras debajo de los nombres de cepas de C. elegans indican si una cepa es un mutante CGC o un aislado natural de CeNDR. El tamaño de la muestra de LSCP se muestra para cada cepa. Se realizaron comparaciones para todos los pares utilizando la prueba HSD de Tukey. No se observaron diferencias significativas entre los tamaños de población estimados a través de las cepas de C. elegans (F (14,108) = 0,7, p = 0,77). Las barras de colores indican las pantallas de color estándar para la respectiva representación de la cepa de C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figura 4: El método LSCP generó grandes poblaciones de gusanos en etapas mixtas en 10 a 20 días. Un LSCP dado de C. elegans creció hasta que la muestra estaba llena de gusanos adultos, alcanzó un tamaño de población grande, y tenía césped bacteriano mínimo a la izquierda. Los LSCPs tardaron entre 10 y 20 días en crecer a una población completa en etapas mixtas, dependiendo de la cepa. El tiempo medio de crecimiento a través de las cepas fue de 12,2 días. El tamaño de la muestra de LSCP se muestra para cada cepa. Cada barra de error se construyó utilizando 1 desviación estándar de la media. Los niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes. Comparaciones para todos los pares usando la prueba HSD de Tukey. Una diferencia significativa fue encontrada en la cantidad de tiempo de crecimiento en LSCP necesario a través de las tensiones de los elegans de la C. (F (14.108) = 8,8, p < 0,0001*). Las barras de colores indican las pantallas de color estándar para la respectiva representación de la cepa de C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figura 5: Medición mixta de la población y el crecimiento de la cepa de referencia de tipo salvaje, PD1074. Una distribución lpfc representativa de un crecimiento LSCP de la cepa de referencia de tipo salvaje, una variante de la cepa original N2 Bristol, (PD1074) documenta la distribución de tamaño y los recuentos de eventos de una población de etapa mixta. El eje X muestra la longitud (Tiempo de vuelo, TOF) de los gusanos ordenados. El eje y muestra la densidad óptica (extinción óptica, EXT) de los gusanos clasificados. Cada punto de datos es un gusano que se documentó en el ejemplo. Cada región TOF que se utilizó para el análisis de imágenes se muestra en un color diferente. Se crearon veinte regiones TOF (R2 – R21) que van desde un TOF de 50 a 2050. Los detalles sobre cada región tof se pueden encontrar en la tabla suplementaria 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Figura 6: Las imágenes de gusanos clasificados de regiones TOF que van desde R2 – R12 muestran la distribución LPFC PD1074. En la región R2, se pueden identificar gusanos L1 y en la región R9 se identifican predominantemente adultos grávidos, que abarcan los dos extremos larvales del desarrollo que nos dan regiones aproximadas dentro de la distribución del citómetro de flujo de donde se esperan etapas en la distribución. La barra de escala representa 1 mm. Las imágenes representativas se tomaron de la distribución LPFC que se muestra en la Figura 5,y las cajas de colores corresponden a regiones de la Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figura 7: Distribución de la población a través de las regiones de tiempo de vuelo (TOF) en la cepa de referencia de tipo salvaje, PD1074. Distribución de gusanos en toda la región TOF que muestra las regiones donde se encontraron los gusanos. Cada PD1074 LSCP se representa como un color individual. (A)El eje x muestra las veinte regiones TOF (R2 – R21) observadas y contadas para el LSCP, mostrando toda la distribución de tamaño. El eje y muestra el porcentaje de gusanos de un LSCP dado que tenían un tamaño corporal que caía en una región TOF determinada. (B) Como una fracción más pequeña de la población de gusanos cae entre las regiones R7-R21, el registro del porcentaje de gusanos que cayeron dentro de cada región se tomó para mostrar la distribución de la población. El eje X muestra las regiones TOF R7-R21. El eje Y muestra el registro del porcentaje de gusanos de un LSCP determinado que tenía un tamaño de cuerpo que caía en una región TOF determinada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Temperatura media diaria (°C) de las condiciones de crecimiento en las que se cultivó y manipuló el LSCP. Las temperaturas reportadas de la sala de Temperatura Controlada (TC) se documentaron y recolectaron a lo largo del lapso de seis meses de crecimiento y recolección de muestras. La temperatura media diaria se informa aquí. No se observaron diferencias significativas entre la temperatura en la que creció el LCSP durante la duración del proyecto (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). La diferencia de temperatura total no abarcó más de 0,003 °C a lo largo de los seis meses de duración del crecimiento y la generación de la muestra. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Tabla suplementaria 1: Regiones cerradas por TOF utilizadas para clasificar gusanos en placas de 384 pozos para obtener imágenes. Las regiones agrupadas se crearon para abarcar un TOF de 100 en toda la distribución de TOF de 50 a 2050. Las regiones cerradas se pueden cambiar y optimizar para satisfacer sus necesidades. Cada región TOF que se utilizó para el análisis de imágenes se muestra en un color diferente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 2: Plantilla de placa de 384 pozos de regiones TOF y diseño de réplica. Cada muestra se clasificó en una placa de 384 pozos para obtener imágenes. Se crearon cuatro réplicas para cada región seleccionada para la clasificación. Las regiones cerradas se pueden cambiar y optimizar para satisfacer sus necesidades. Vea la tabla suplementaria 1 para las regiones cercadas específicas creadas y utilizadas en este protocolo. Cada región TOF que se utilizó para el análisis de imágenes se muestra en un color diferente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 3: Las cepas de C. elegans utilizadas en este protocolo contienen una mezcla de cepas CGC y CeNDR. La cepa, el genotipo, la fuente de la cepa y los detalles se describen en esta tabla. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Para utilizar Caenorhabditis elegans (C. elegans) en la investigación ómica, se necesita un método para generar grandes poblaciones de gusanos donde se pueda medir una sola muestra a través de plataformas para análisis comparativos. Aquí, un método para cultivar las poblaciones de C. elegans en placas de cultivo a gran escala (LSCPs) y para documentar el crecimiento de la población se presenta.

Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

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Esta técnica nos permite recolectar poblaciones de gusanos a gran escala para ser utilizadas para múltiples plataformas ómicas con una manipulación mínima. Esta técnica nos permite recolectar poblaciones mixtas de C.elegans en estadios a través de múltiples experimentos ómicos para obtener una imagen holística de cada muestra. Para el blanqueamiento puntual de adultos grávidos en placas de cultivo a gran escala, llame un pico de gusano sobre un quemador Bunsen y use el pico para extraer E. coli fresca del borde del césped bacteriano en una placa de cultivo a gran escala.Elija un solo adulto grávido de la placa de cuarto trozo para el blanqueamiento puntual y agregue cinco microlitros de solución de hipoclorito alcalino recién preparada en una esquina de la placa de cultivo a gran escala lejos del césped de E. coli. Coloque al adulto grávido en la solución de hipoclorito alcalino y toque el nematodo para interrumpir la cutícula y liberar huevos. Cuando un total de cinco adultos se han colocado uniformemente alrededor del césped de E. coli de la misma manera, coloque la tapa de nuevo en la placa.Para cosechar muestras de placas de cultivo a gran escala, vierta 50 mililitros de solución M9 en una superficie de placa de cultivo a gran escala y gire la placa para asegurarse de que el M9 cubra toda la superficie de agarosa mediana de crecimiento de nematodos. Preparar una pipeta serológica estéril con M9 e inclinar la placa para que la M9 y la población de gusanos se reúnan en una esquina de la placa. Utilice la pipeta preparada para aspirar la suspensión del gusano y agregue los gusanos a un tubo cónico de 50 mililitros.Coloque el tubo en un balancín para interrumpir cualquier agrupación bacteriana y escombros. Cuando todos los gusanos se han recogido de las tres placas, transferir 15 mililitros de gusanos de cada tubo en cada uno de los tres tubos cónicos de 15 mililitros y sedimentar los gusanos en los tubos por centrifugación. Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes sin molestar los pellets de gusano y añadir 13 mililitros de suspensión de gusano a cada tubo.Invierta los tubos para resuspend los pellets y para lavar la mayor cantidad posible de bacterias y escombros y centrifugar los gusanos de nuevo. Cuando se haya recogido toda cada población de gusanos, lave los pellets de gusano tres veces en 10 mililitros de solución M9 fresca por lavado. Después del último lavado, resuspend cada pellet de gusano limpiado en 10 mililitros de agua destilada doble.Para la estimación del tamaño de la población, diluya rápidamente tres alícuotas de 100 microlitros de muestra de gusano de cada tubo en 900 microlitros de solución M9 por muestra y use las alícuotas para hacer diluciones en serie. Coloque las suspensiones de muestra de gusano común en un balancín para el movimiento continuo de los cultivos mientras se cuentan las alícuotas y mezcle las diluciones de gusano hasta que sean homogéneas. Agregue cinco microlitros de solución desde el primero a 10 muestras de gusanos a un portaobjetos de microscopio de vidrio y cuente los gusanos por microscopía de luz.Si hay menos de 50 gusanos en la muestra, cuente las diluciones 1:100 y 1:1, 000. Si hay más de 50 gusanos, pase a la siguiente dilución en serie. Después de contar cada réplica alícuota de cada dilución tres veces, promediar los recuentos de dilución para determinar el tamaño estimado de la población del gusano.Luego divida las muestras de gusano en las alícuotas experimentales apropiadas y congele las muestras en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius. Para preparar una muestra de gusano para citometría de flujo de partículas grandes, diluya aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta etapa mixta alícuota de gusano a un volumen final de 10 mililitros de solución M9 y agregue 200 microlitros de un miligramo por mililitro E. coli y 1:50 de dilución de 0,5 micromolares rojos de solución fluorescente fluorescente a la suspensión del gusano. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente con balanceo, recoja los gusanos y microesferas por centrifugación y lave los gusanos dos veces con una solución M9 fresca para eliminar cualquier exceso de bacterias y microesferas no internalizadas.Después del segundo lavado, resuspend el pellet en cinco mililitros de solución M9. Si el pellet se ve limpio, agregue cinco mililitros de M9 complementados con azida de sodio de 50 milimolares a los gusanos y coloque el tubo en un balancín para enderezar y eutanasiar los gusanos para un conteo y dimensionamiento precisos. Para la documentación de distribución de la población, abra la plantilla calibrada de placa de 384 pozos y configure la plantilla para dispensar 20 objetos bloqueados en cuatro pozos para obtener cuatro réplicas técnicas de cada región cerrada para cada una de las 20 regiones de barra de la muestra.Cargue una muestra de gusanos de 40 mililitros en el citómetro de flujo de partículas grandes y comience a clasificar automáticamente la muestra mientras agita continuamente la muestra para evitar la sedimentación y dispensación simultánea de objetos de la muestra en la placa calibrada de 384 pozos. Una vez que se haya clasificado toda la muestra y se haya dispensado el número máximo de regiones cerradas en la placa de 384 pozos, retire la muestra del citómetro y limpie el instrumento. El método de placa de cultivo a gran escala se probó en 15 cepas de C.Elegans, incluida una mezcla de mutantes del Centro de Genética Caenorhabditis y cepas silvestres de Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource.En este análisis, el método de placa de cultivo a gran escala produjo tamaños de población de aproximadamente 94, 500 a 9, 290, 000. El tamaño medio de la población dentro de la cepa de referencia PD1074 y a través de las cepas fue de aproximadamente 2,4 millones de gusanos. No se encontraron diferencias significativas en los tamaños de población estimados entre las cepas de C.elegans en el transcurso de un promedio de 12,2 días de crecimiento de placas de cultivo a gran escala.Las placas de cultivo a gran escala PD1074 tardaron entre 10 y 14 días en crecer a una población de etapa mixta completa con un tiempo de crecimiento medio de 12,2 días. La cepa de crecimiento más lento creció durante un máximo de 20 días y la cepa de más rápido crecimiento creció durante un mínimo de 10 días. En esta distribución de la muestra para PD1074, los gusanos fueron medidos de la etapa L1 con adulto grávido en un citómetro grande del flujo de la partícula.Las imágenes posteriores y la visualización de las variaciones en la distribución de la población a través de las muestras revelaron que la tubería generó una población de etapa mixta de C.elegans. Es importante contar con precisión los gusanos a lo largo de la colección de muestras para obtener datos comparables entre crecimientos y estudios. Este enfoque de recolección se puede aplicar a la secuenciación de ARN, genómica, y otros análisis ómicos para ampliar nuestra comprensión de la dinámica complicada que se producen dentro de las poblaciones de C.elegans.Esta técnica nos permite recolectar poblaciones mixtas de C.elegans en etapas a través de múltiples experimentos ómicos para obtener una imagen holística de cada muestra.

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Investigación

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